Name: Aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de NAFLD/NASH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a aplicar ultrasonido B-mode y elastografía de onda de cizallamiento para evaluar esteatosis y fibrosis hepática en modelos de rata con NASH. Este método no invasivo permite el seguimiento longitudinal de la progresión de la enfermedad.

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Los autores desean agradecer al Equipo de Operaciones de Medicina Comparativa de Pfizer por su arduo trabajo cuidando y asegurando la salud de los animales del estudio, así como ayudando con algunas de las técnicas. Además, se debe agradecer a Danielle Crowell, Gary Seitis y Jennifer Ashley Olson por su ayuda con el procesamiento de tejidos para análisis histológicos. Además, los autores desean agradecer a Julita Ramírez por revisar y proporcionar comentarios valiosos durante la preparación de este manuscrito.

Todos los procedimientos relacionados con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Pfizer y se llevaron a cabo en una instalación acreditada internacionalmente por AAALAC (Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio).
1. Inducción de la enfermedad
<ol><li>Use ratas Wister Han macho (150-175 g; ~ 6-7 semanas de edad; total de 40 ratas) que estén libres de patógenos adventiciales de ratas conocidos. Aloje a las ratas en parejas en una enjamedadera ventilada individualmente con ropa de cama de papel (consulte la Tabla de materiales)y manténgalas a 22 ± 1 ° C, 40-70% de humedad relativa con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.</li>
	<li>Coloque a las ratas que pesan 150-175 g (~ 6-7 semanas de edad) en una dieta alta en grasas y deficiente en colina con 1% de colesterol (n = 20) o un chow de roedor de laboratorio estándar (n = 20) dependiendo del diseño del estudio. NOTA: En este estudio, se inscribieron un total de 40 ratas con 20 animales por grupo. Al final de la6ª semana, la mitad de la cohorte de cada grupo fue necropsiada para el análisis histológico de mitad de estudio de muestras de hígado. Por lo tanto, el tamaño de la muestra fue de 10 animales por grupo para los puntos de tiempo de la9ª y12ª semana.</li>
</ol>2. Configuración del instrumento
<ol><li>Configure el área de imágenes de la siguiente manera: incluya una superficie calentada para mantener al animal caliente durante la obtención de imágenes (c en la Figura 1),y un cono nasal de anestesia asegurado para administrar anestesia inhalante para mantener un plano de anestesia durante todo el procedimiento (b en la Figura 1).</li>
	<li>Use un soporte de sonda de ultrasonido para facilitar el movimiento de la sonda de ultrasonido a la ubicación deseada y para evitar que la sonda descanse sobre el animal.<ol>
<li>Use gel de ultrasonido calentado en la piel donde se adquiere la imagen de ultrasonido.</li>
		<li>Mantenga los siguientes ajustes durante todo el procedimiento, que se pueden ajustar en la pantalla táctil: Potencia acústica 0,0 dB; Sintonizador de tejidos 1540 m/s; Rango dinámico 60 dB; Rango de elasticidad (para modo SWE) < 30 kPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conecte la sonda de ultrasonido al sistema de rieles en el soporte especializado (a en la Figura 1).</li>
	<li>Encienda el instrumento y permita que se inicie. Una vez que el monitor esté encendido, anote la imagen del modo B con los detalles del transductor conectado.</li>
</ol>3. Preparación de la asignatura
<ol><li>Asegúrese de que los animales estén en ayunas al menos 4 h antes del procedimiento de obtención de imágenes para evitar que el contenido intestinal interfiera con la adquisición de imágenes.<ol>
<li>Después de al menos 4 h de ayuno, coloque una rata en una cámara de inducción anestésica isoflurano hasta que se alcance un nivel adecuado de anestesia, confirmado por ninguna respuesta al pellizco del dedo del dedo del día. Exponer a los animales al 3-5% de isoflurano durante 3-5 min para inducir la anestesia.</li>
		<li>Para la anestesia de mantenimiento, mantenga a los animales bajo 2-3% de isoflurano durante la adquisición de la imagen. Aplique ungüento oftálmico para proteger el ojo del secado durante la anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que se haya logrado la anestesia, retire a un animal de la cámara de inducción y colóquelo sobre una manta circulante de agua caliente tibia. Coloque un cono nasal anestésico sobre el hocico y afeite al animal en su lado derecho, desde la caja torácica hasta la pelvis. Use crema depilación química para eliminar todo el vello restante en esta área.</li>
	<li>Una vez que se haya eliminado el pelo, coloque a un animal en recosto lateral izquierdo con las patas superiores pegadas con cinta adhesiva sobre la cabeza en una plataforma de imágenes cálida(Figura 3A).</li>
	<li>Presione la tecla Paciente en el panel de control del instrumento e identifique al sujeto de acuerdo con el diseño del estudio.<ol>
<li>Abra la función Teclado en el instrumento tocando el icono en la pantalla táctil. Escriba los nombres como desee.</li>
		<li>Toque Salir para salir de la pantalla de nombre de paciente. Observe que el modo B se vuelve a abrir en el monitor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Adquisición de imágenes para la medición del índice hepato-renal (HR)
<ol><li>Aplique una pequeña cantidad de gel de ultrasonido calentado en la región de la piel depilada en el animal.</li>
	<li>Mueva la sonda de ultrasonido para tocar el área cubierta de gel del sujeto(Figura 3B). Una vez que aparezca una imagen en vivo en modo B de los órganos internos del sujeto en el monitor, mueva la sonda de ultrasonido al área ligeramente por encima de la cadera, justo paralela a las vértebras lumbares (plano sagital).</li>
	<li>Usando la pantalla de modo B en el monitor, localice el riñón derecho identificando la arteria renal grande y la separación corteza/médula(Figura 4A). Además, observe parte del hígado en un solo plano de la imagen.<ol>
<li>Asegúrese de que haya poco o ningún artefacto de imagen, como sombras y burbujas de aire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mida una relación de modo B para obtener el índice HR.<ol>
<li>Asegúrese de que tanto la corteza renal como el parénquima hepático estén en el mismo plano de enfoque. Si es necesario, ajuste el enfoque y obtenga control para obtener una imagen clara.<ol>
<li>Ajuste el enfoque girando la perilla de enfoque en el panel de control. Ajuste la ganancia presionando el botón Auto TGC una vez.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Presione la tecla Congelar en el panel de control. Asegúrese de que el animal esté entre respiraciones al congelar la pantalla para evitar imágenes borrosas.</li>
		<li>Una vez que la pantalla esté congelada, toque Herramientas de medición en la pantalla táctil. Seleccione Relación de modo B,una herramienta integrada que mide el brillo relativo de un tejido de una región de interés seleccionada. Cree un círculo de 2 mm para seleccionar una región de interés (ROI). Ajuste el tamaño del círculo moviendo un dedo a lo largo del borde exterior de la bola de seguimiento en el panel de control.</li>
		<li>Coloque el círculo de 2 mm en la imagen hepática ROI, que debe ubicarse a la derecha del riñón. Identificar el tejido hepático en función de su ecogenicidad homogénea y contorno liso.</li>
		<li>Una vez que el círculo esté en su lugar, presione el botón Seleccionar en el panel de control y observe el nuevo círculo que aparece.</li>
		<li>Ajuste el tamaño del nuevo círculo a 2 mm y colóquelo en la imagen de la corteza renal. Asegúrese de mantener la misma profundidad de los círculos en el hígado y la corteza renal. Una vez en su lugar, presione el botón Seleccionar en el panel de control. Observe que la herramienta del sistema incorporada muestra el índice HR como una relación de modo B.</li>
		<li>Presione Guardar imagen para guardar la imagen y observe las imágenes guardadas que aparecen como miniaturas en el lado derecho del monitor.</li>
		<li>Presione el botón Congelar en el panel de control para descongelar la imagen y volver a una imagen en modo B en vivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita la medición de la relación de modo B 3 veces a diferentes profundidades y planos de tejido. Calcule el promedio de estas tres relaciones de modo B para cada animal y punto de tiempo.</li>
</ol>5. Adquisición de imágenes para la elastografía de onda de cizalla
<ol><li>Mueva la sonda transversalmente en el área subcostal derecha para localizar el hígado usando el modo B. Localice un área del hígado que sea principalmente parénquima y libre de vasos sanguíneos grandes como la vena porta y la arteria hepática. Una vez que se haya encontrado un área clara del hígado, genere un mapa de elasticidad de cizalla del tejido presionando el botón SWE en el panel de control.</li>
	<li>Ajuste el tamaño y la posición de la caja SWE debajo de la cápsula hepática en un área libre de sombras. Identifique la cápsula como una línea ecogénica brillante cerca de la parte superior del hígado.</li>
	<li>Observe que el cuadro SWE pasa a un mapa de color dentro de 5-10 s. Una vez que la caja esté llena y estable, presione el botón Congelar en el panel de control cuando el animal esté entre respiraciones. NOTA: La cantidad mínima de cobertura de la caja debe ser del 60-80% para evaluar con precisión la elasticidad del hígado.</li>
	<li>En la pantalla táctil, toque QBox,una herramienta de sistema integrada que calcula la elasticidad a partir de un ROI en el mapa de elasticidad de onda de cizalla. Observe el círculo y el cuadro de datos que aparecen en el monitor. Ajuste la posición del QBox tocando el icono de posición en la pantalla táctil a la configuración deseada.</li>
	<li>Ajuste el tamaño del círculo a 3 mm moviendo un dedo a lo largo del borde exterior de la bola de seguimiento en el panel de control. Usando la bola de pista, coloque el círculo en un área libre de sombras con coloración uniforme(Figura 5A,B). Tenga cuidado de evitar áreas conocidas de rigidez, como los vasos sanguíneos o la cápsula hepática, así como la hemorragia de estas estructuras.</li>
	<li>Cuando se encuentre un área adecuada, presione Guardar imagen en el panel de control para guardar la imagen. Repita este procedimiento 3 veces en diferentes áreas del hígado. Mueva la sonda hacia arriba y hacia abajo o hacia los lados en el abdomen para recopilar imágenes mapeadas por SWE de diferentes áreas del hígado.</li>
	<li>Una vez que se hayan recopilado todas las imágenes, presione Finalizar examen en el panel de control y tome nota de la pantalla de información del paciente que aparece en el monitor.</li>
	<li>Retire la cinta de las patas del animal, limpie el exceso de gel y retire al animal de la etapa de imágenes. Permita que se recupere de la anestesia en una jaula cálida y seca por sí mismo hasta que se recupere por completo. Monitorear a cada animal para asegurar la recuperación completa de la anestesia, indicada por su capacidad para mantener la reclinación esternal</li>
	<li>Repita los pasos de las secciones 4-5 para cada animal de la cohorte que se le imagine.</li>
</ol>6. Recuperación y análisis de datos de imágenes
<ol><li>Cuando se hayan recogido imágenes de todos los animales, apague la anestesia.</li>
	<li>Para extraer datos de imagen de la máquina, presione el botón Revisar en el panel de control y observe todos los escaneos realizados en ese instrumento que aparecen en el monitor. Busque los escaneos deseados utilizando la ventana de búsqueda en la esquina superior de la pantalla.</li>
	<li>Seleccione todos los escaneos necesarios para el análisis de datos marcando la casilla junto al nombre del paciente a través del trackball y el botón Seleccionar. Una vez que se resalten todos los escaneos necesarios, seleccione Exportar JPEG en la pantalla táctil. Exporte datos a una unidad de red o a una unidad de bus serie universal (USB) portátil. Localice los puertos USB en la parte posterior del instrumento.</li>
	<li>Una vez que los archivos se hayan exportado, abra archivos jpg individuales de cada escaneo en una computadora de estación de trabajo. Observe todos los datos en el lado derecho de la imagen: Relación de modo B: recopile el número de relación B; Q Box-recoge el valor de elasticidad media (kPa).</li>
	<li>Ingrese todos los datos en una hoja de cálculo u otro software de administración de bases de datos y realice los análisis estadísticos deseados.</li>
</ol>7. Análisis histológico de muestras hepáticas
<ol><li>Al final de la6ª semana, realizar necropsia en la mitad de la cohorte de cada grupo para el análisis histológico a mitad del estudio de las muestras de hígado. Del mismo modo, sacrificar al resto de la cohorte de animales y recolectar muestras de hígado para su análisis histológico en el punto de tiempode la semana 12.</li>
	<li>Para la tinción ORO, fije las secciones hepáticas en formalina tamponada neutra al 10% y criopreservarlas con sacarosa utilizando una solución refrigerada de sacarosa al 30% durante la noche como mínimo. Crio-incrustar las secciones en un compuesto de temperatura de corte óptima, y crio-sección en portaobjetos cargados para prepararse para la tinción ORO.</li>
	<li>Coloque las criosección en 100% propilenglicol durante 2 minutos, seguido de una incubación durante la noche en una solución ORO al 0,5%. Después de retirar la solución ORO, diferencie las secciones en propilenglicol al 85% durante 1 min, enjuague en agua desionizada y contratinúe con la modificación de Hematoxilina-Lillie de Mayer durante 1 min.<ol>
<li>Coloque las fundas en las diapositivas utilizando un medio de montaje acuoso y séquelas a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para PSR, desparafinar las diapositivas de sección hepática fijadas con formalina e incrustadas en parafina, colocarlas durante la noche en Bouin Fluid y luego teñirlas con un tinter de diapositivas automatizado según el protocolo del fabricante con algunos pasos optimizados (1% de ácido fosfomolíbdico durante 5 min; 0.1% sirius red en ácido pícrico saturado durante 90 min; lavado de 2 x 30 s en ácido acético al 0.5%). Deshidrate automáticamente las diapositivas y luego móntelas con un medio de montaje permanente.</li>
	<li>Capture imágenes de las diapositivas teñidas de ORO y PSR utilizando el escáner de microscopía digital con un aumento de 20x, guárdelas en formato .svs y guárdelas en la base de datos de imágenes del administrador de diapositivas.</li>
	<li>Analice las imágenes utilizando algoritmos personalizados creados en software de patología digital. Aplique uniformemente aplicaciones de software de patología digital con parámetros de umbral para identificar y cuantificar el área de las secciones hepáticas, así como las áreas teñidas con ORO y PSR. Exporte las mediciones a una hoja de cálculo para calcular el porcentaje de área.</li>
</ol>8. Análisis estadístico
<ol><li>Realice un análisis estadístico de los datos de imágenes con ANOVA bidireccional utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak para evaluar la diferencia entre grupos en diferentes puntos de tiempo. Supongamos diferencias significativas entre grupos para valores de probabilidad p ≤ 0,001. Además, realizar la correlación de las lecturas de imágenes con los análisis histológicos.</li>
	<li>Utilice estadísticas no paramétricas para analizar los resultados del análisis histológico de este estudio. Informe los valores del grupo como mediana ± rango semi intercuartílico (sIQR). Supongamos diferencias significativas entre grupos para valores de probabilidad p ≤ 0,001. Utilice una prueba de Mann-Whitney para comparar la cantidad de tinción histoquímica PSR y ORO entre diferentes grupos.</li>
</ol>

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</ol>

Todos los autores son empleados de Pfizer, Inc.

Las imágenes basadas en ultrasonido, incluido SWE, pueden ser una herramienta invaluable para la evaluación longitudinal de la esteatosis hepática y la rigidez en modelos preclínicos de NAFLD / NASH. Este artículo describe metodologías detalladas sobre cómo adquirir el modo B de alta calidad, así como imágenes SWE de hígados para la medición del índice de FC y la elasticidad utilizando un modelo de rata de NASH inducido por la dieta CDAHFD. Además, los resultados muestran una excelente correlación del índice de FC y la e...

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es una condición metabólica caracterizada por una acumulación excesiva de grasa en el hígado y se está convirtiendo rápidamente en una dolencia hepática líder en todo el mundo con una prevalencia global recientemente reportada del 25%1. La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una etapa más progresiva del espectro de la EHGNA, caracterizada por un exceso de grasa hepática con daño celular progresivo, inflamación y fibrosis. Estas dolencias a menudo son silenciosas, no se detectan a través de análisis de sangre o exámenes de rutina, hasta que ya se ha producido un daño considerable en el hígado de un paciente. Actualmente, el estándar de oro para diagnosticar la EHNA en pacientes es a través del examen histológico de muestras de biopsia hepática derivadas del paciente. Del mismo modo, los investigadores preclínicos que trabajan para comprender la patogénesis de NASH / NAFLD, así como la industria del desarrollo de medicamentos, se basan en la biopsia en cuña in vivo de muestras de hígado o la eutanasia terminal de cohortes satélites para la histología para medir la esteatosis, la inflamación y la fibrosis.
Por ejemplo, la biopsia en cuña hepática ha sido una técnica estándar para evaluar la esteatohepatitis y la fibrosis utilizando el modelo GUBRA NASH2. El método de biopsia en cuña hepática es invasivo y laborioso en animales pequeños3. El uso de la biopsia hepática en cuña en medio de un estudio representa una variable experimental adicional en un modelo de enfermedad, que a menudo aumenta el número de animales que se necesitan. Con estos factores en mente, las técnicas de imagen no invasivas que se pueden utilizar para evaluar de manera confiable la esteatosis y la fibrosis en modelos animales NASH / NAFLD en puntos de tiempo tempranos resultan valiosas. La elastografía de onda de cizalla (SWE) es un método basado en ultrasonido utilizado para medir la elasticidad de los tejidos blandos. La técnica mide la propagación de las ondas de cizallamiento creadas por pulsos de ultrasonido supersónico dirigidos a un objetivo tisular, y luego calcula un valor llamado módulo E4. La velocidad de la onda de cizallamiento es proporcional al grado de rigidez del tejido.
La Figura 1 y la Figura 2 muestran la configuración del área de imágenes y el instrumento SWE. El instrumento SWE es una unidad única con ruedas con dos pantallas y un panel de control que se muestra en la Figura 2A. El monitor superior(Figura 2B)actúa como monitor de ordenador y muestra imágenes y directorios de pacientes. El panel de control(Figura 2C)es una serie de botones y diales que controlan aspectos generales de la captura de imágenes: congelar la pantalla, guardar imágenes, cambiar de un modo a otro. La pantalla inferior(Figura 2D)es una pantalla táctil con controles adicionales para cambiar la configuración y actúa como un teclado para ingresar datos según sea necesario. El instrumento está equipado con un lápiz óptico para usar en la pantalla táctil si lo desea. Las sondas de ultrasonido se conectan al panel frontal inferior del dispositivo. Para las imágenes en modo B y SWE en roedores, se utilizó el transductor superlineal de 6 a 20 MHz. Esta capacidad de medir de forma no invasiva la rigidez tisular hace de SWE una herramienta valiosa para la identificación y estadificación de la fibrosis hepática5 en pacientes con EHNA, disminuyendo la necesidad de métodos más invasivos. SWE, de hecho, se ha utilizado para medir la fibrosis hepática en pacientes y es un método aprobado por la FDA para puntuar la fibrosis en la clínica6. El uso de SWE para monitorear la progresión de la EHNA en modelos animales de la enfermedad proporcionaría una herramienta de traducción para el desarrollo de tratamientos y, al mismo tiempo, mejoraría el bienestar animal a través de la reducción del número de sujetos animales y el refinamiento de los procedimientos in vivo para minimizar el dolor y la angustia.
Las imágenes SWE en pacientes humanos utilizan un transductor de ultrasonido de baja frecuencia4,que no es ideal para animales pequeños. En particular, se han utilizado técnicas de SWE de alta frecuencia para evaluar la eficacia de la inhibición de la acetil-CoA carboxilasa en la patogénesis de NASH en un modelode rata 7,y la utilidad de esta técnica se ha descrito en modelos de ratas con tetracloruro de carbono de fibrosis hepática con resultados exitosos en comparación con los métodos tradicionales de puntuación histológica METAVIR8. Sin embargo, la literatura existente carece de información detallada sobre la técnica y la metodología sobre la aplicación de imágenes deWE en modelos preclínicos de NASH. Como se describió anteriormente, la esteatosis hepática es una de las características clave de la afección NAFLD / NASH y es una etapa importante en la que se puede considerar la intervención. Por lo tanto, evaluar la acumulación de grasa hepática utilizando una modalidad de imagen es tan importante como evaluar la fibrosis hepática en modelos preclínicos de NASH / NAFLD.
Una técnica ecográfico conocida como índice HR, una relación del brillo tisular del hígado en comparación con la de la corteza renal, se ha utilizado como marcador sustituto de esteatosis en la clínica9,10. Este enfoque, sin embargo, no se ha utilizado ampliamente en modelos animales preclínicos de NAFLD/NASH. Este artículo describe un método para medir la elasticidad, así como el índice hr como un marcador sustituto de fibrosis hepática y esteatosis, respectivamente, en un modelo de rata de dieta alta en grasas y deficiente en colina (CDAHFD) de NAFLD / NASH. Este modelo induce esteatosis rápida, inflamación hepática y fibrosis, que es medible dentro de las 6 semanas en ratones11. Se ha demostrado que la adición de colesterol (1%) a esta dieta promueve la fibrogénesis enratas 12,lo que convierte a este modelo en un candidato adecuado para estudios de validación que involucran imágenes de ondas de cizalla. En general, esta tecnología de imágenes también se puede aplicar a una amplia gama de modelos / dietas NASH donde la esteatosis y / o fibrosis es un punto final de interés.

<table><tbody><tr><td>Instrumento de elastografía de onda de corte</td> <td>Aixplorer</td><td>Supersonic Imagine</td><td></td></tr><tr><td>Transductor Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transductor</td><td>supersónico Imagine</td><td></td><td>para elastografía de onda de corte</td></tr><tr><td>Jaulas de ratas</td><td></td><td></td> de<td>lecho Alpha-dri</td></tr><tr><td>Escáner Aperio AT2 Escáner</td> de patología digital <td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Escáner de campo claro</td></tr><tr><td>Compac 6 Sistema de anestesia</td><td>VetEquip</td><td></td><td>Vaporizador de anestesia y sistema de administración. Sin embargo, se puede utilizar cualquier sistema de administración de anestesia.</td></tr><tr><td>Gestión de la base de datos de generadores de imágenes</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Digital Pathology</td></tr><tr><td>Mayer's Hematoxilin</td><td>Dako/Agilent</td><td></td><td>H& E Tinción/Histología</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church & Dwight</td><td></td><td>Removedor de pelo</td></tr><tr><td>Aceite Rojo O solución</td><td>Poly Scientific</td><td></td><td>Tinción de lípidos/Histología</td></tr><tr><td>Picrosirius Red Stain (PSR)</td><td>Rowley Biochemical</td><td>F-357-2</td><td>Tinción de colágeno/Histología</td></tr><tr><td>Puralube Pomada oftalmológica</td><td>Dechra Veterinary</td><td></td><td>Product Lubricación para prevenir la sequedad ocular durante la anestesia</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus</td><td>Sakura Finetek USA</td><td></td><td>Tinción de portaobjetos automatizada</td></tr><tr><td>VISIOPHARM software</td><td>Visiopharm</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td></td> de patología digital <td>Research Diets</td><td>A06071309i</td><td>Dieta</td></tr><tr><td></td> inductora de NASH <td>Purina</td><td>5053</td><td>Control animal chow</td></tr><tr><td>Estación de imagen Vevo</td><td>Fujifilm VisualSonics</td><td></td><td>La estación de imagen Vevo se utiliza para sujetar el transductor de ultrasonido durante la toma de imágenes.</td></tr><tr><td>Ratas Wistar Han Laboratorios</td><td></td><td></td> <td>Charles River</td></tr></tbody></table>

aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de nafld/nash

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una afección dentro del espectro de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que se caracteriza por la acumulación de grasa hepática (esteatosis) y la inflamación que conduce a la fibrosis. Los modelos preclínicos que recapitulan de cerca la EHNA/EHGNA humana son esenciales en el desarrollo de fármacos. Si bien la biopsia hepática es actualmente el estándar de oro para medir la progresión y el diagnóstico de NAFLD / NASH en la clínica, en el espacio preclínico, se necesita la recolección de muestras de hígado completo en múltiples puntos de tiempo durante un estudio o la biopsia de hígado para el análisis histológico para evaluar la etapa de la enfermedad.
La realización de una biopsia hepática a mitad del estudio es un procedimiento invasivo y laborioso, y la recolección de muestras de hígado para evaluar el nivel de enfermedad aumenta el número de animales de investigación necesarios para un estudio. Por lo tanto, existe la necesidad de un biomarcador de imágenes confiable, traducible y no invasivo para detectar NASH / NAFLD en estos modelos preclínicos. Las imágenes no invasivas en modo B basadas en ultrasonido y la elastografía de onda de cizallamiento (SWE) se pueden usar para medir la esteatosis y la fibrosis hepática. Para evaluar la utilidad de SWE en modelos preclínicos de roedores de NASH, los animales se colocaron en una dieta pro-NASH y se sometieron a imágenes de ultrasonido no invasivas en modo B y elastografía de onda de corte para medir el índice hepatorrenal (HR) y la elasticidad hepática, midiendo la progresión de la acumulación de grasa hepática y la rigidez del tejido, respectivamente, en múltiples puntos de tiempo en el transcurso de un estudio NAFLD / NASH dado.
El índice de HR y los números de elasticidad se compararon con los marcadores histológicos de esteatosis y fibrosis. Los resultados mostraron una fuerte correlación entre el índice HR y el porcentaje de tinción oil red O (ORO), así como entre la elasticidad y la tinción Picro-Sirius Red (PSR) de los hígados. La fuerte correlación entre los métodos ex vivo clásicos y los resultados de las imágenes in vivo proporciona evidencia de que la elastografía de onda de corte / imágenes basadas en ultrasonido se pueden usar para evaluar el fenotipo y la progresión de la enfermedad en un modelo preclínico de NAFLD / NASH.

Un sello distintivo de los animales alimentados con CDAHFD es la esteatosis. La acumulación de grasa en el hígado cambia las propiedades ecogénicas del tejido, que se pueden cuantificar midiendo el brillo del hígado y normalizándolo al brillo de la corteza renal a partir de una imagen en modo B tomada en el mismo plano. El valor cuantificado se expresa como un índice de HR, que es una medida indirecta de la esteatosis. En la Figura 4A,una imagen hepática representativa de un animal de contro...

Este protocolo describe el uso de una técnica de ultrasonido mejorada para observar y cuantificar de manera no invasiva los cambios en el tejido hepático en modelos de roedores de enfermedad del hígado graso no alcohólico.

Aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...

El uso de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento permite a los investigadores medir los cambios en la grasa hepática y la fibrosis implícitas en los modelos de esteatohepatitis no alcohólica. Esta modalidad de imagen es una técnica no invasiva, de alto rendimiento y clínicamente traducible, y se puede utilizar para evaluar el estadio de la enfermedad y la eficacia en modelos de esteatohepatitis no alcohólica durante el descubrimiento de fármacos. Para comenzar, coloque ratas Wistar Han macho de seis a siete semanas de edad que pesen de 150 a 175 gramos en parejas en jaulas ventiladas individualmente con ropa de cama adecuada a aproximadamente 22 grados Celsius y 40 a 70% de humedad relativa con un ciclo de luz / oscuridad de 12 a 12 horas.Proporcione a 20 ratas una dieta alta en grasas y deficiente en colina con 1% de colesterol, y a otras 20 ratas con el chow de roedor de laboratorio estándar. Para configurar el instrumento de imágenes, coloque una superficie calentada en el área de imágenes para mantener al animal caliente durante la obtención de imágenes y fije el cono nasal de anestesia para administrar la anestesia inhalante. Use el soporte de la sonda de ultrasonido para mover la sonda de ultrasonido a la ubicación deseada y para evitar que la sonda descanse sobre el animal.Una vez que la rata esté completamente anestesiada, transfiérala de la cámara de inducción a una manta circulante de agua caliente tibia. Use crema depilación química para eliminar el vello de la caja torácica a la pelvis en el lado derecho de la rata. Coloque la rata en la posición reclinada lateral izquierda y pegue con cinta adhesiva las patas superiores por encima de la cabeza en una plataforma de imágenes cálida.Presione la tecla del paciente en el panel de control del instrumento e identifique al sujeto de acuerdo con el diseño del estudio. Aplique una pequeña cantidad de gel de ultrasonido calentado en la región de la piel depilada de la rata. Mueva la sonda de ultrasonido para tocar el área cubierta de gel.Una vez que aparezca la imagen en modo B en vivo de los órganos internos en la pantalla, mueva la sonda de ultrasonido al área ligeramente por encima de la cadera, justo paralela a las vértebras lumbares. Utilice la pantalla del modo B para localizar el riñón derecho mediante la identificación de la separación de la arteria renal grande y la médula de la corteza. Observe una parte del hígado en un solo plano de la imagen y asegúrese de que las burbujas de aire o las sombras no estén presentes en la imagen.Ajuste el enfoque y asegúrese de que la corteza renal y el parénquima hepático estén en el mismo plano para obtener una imagen clara. Asegúrese de que el animal esté entre respiraciones al congelar la pantalla para evitar capturar imágenes borrosas. Seleccione la relación de modo B para medir el brillo relativo del tejido de la región de interés seleccionada.Cree un círculo de dos milímetros y colóquelo en la región de interés en la imagen del hígado, que se encuentra a la derecha del riñón. Coloque un nuevo círculo en la imagen de la corteza renal, manteniendo las profundidades de los círculos en el hígado y la corteza renal iguales. Presione el botón de selección en el panel de control para mostrar el índice hepato-renal como una relación de modo B y repita la medición tres veces a diferentes profundidades y planos del tejido, luego calcule el promedio.Mueva la sonda transversalmente en el área subcostal derecha para localizar el hígado usando el modo B. Localice un área clara del hígado que sea principalmente parénquima y libre de vasos sanguíneos grandes, como la vena porta y la arteria hepática, luego presione el botón SWE en el panel de control para generar un mapa de elasticidad de cizallamiento del tejido. Ajuste el tamaño y la posición de la caja SWE debajo de la cápsula hepática en un área libre de sombras.Cuando la caja esté llena y estable, presione el botón de congelación en el panel de control mientras la rata está entre respiraciones. Toque el Q-Box en la pantalla táctil del instrumento para calcular la elasticidad de la región de interés en el mapa de elasticidad de onda de cizalla. Aparecerá un círculo y un cuadro de datos.Coloque el círculo en el área libre de sombras con una coloración uniforme, evitando áreas de rigidez. Repita el procedimiento tres veces moviendo la sonda hacia arriba y hacia abajo o hacia los lados en el abdomen para recopilar imágenes mapeadas por SWE de diferentes áreas del hígado. Cuando termine, retire la cinta de las patas y limpie el exceso de gel.Coloque a la rata de nuevo en una jaula tibia y seca y permita que se recupere por completo. Seleccione todos los escaneos necesarios para el análisis de datos marcando la casilla junto al nombre del paciente usando la bola de seguimiento y el botón Seleccionar. Después de exportar los archivos, abra un archivo JPG individual de cada escaneo y observe los datos en el lado derecho de la imagen.Copie todos los datos en una hoja de cálculo u otro software de administración de bases de datos, y realice los análisis estadísticos deseados. Las imágenes representativas de los índices hepato-renales de los grupos de control y dieta alta en grasas con deficiencia de colina muestran que el brillo del hígado en la corteza renal fue casi el mismo, y el índice hepato-renal fue menor que uno en el grupo de control. En el grupo de dieta alta en grasas, el brillo del hígado aumentó y el índice hepato-renal se elevó hasta 1,91 a las seis semanas y 1,79 a los puntos de tiempo de 12 semanas.Los valores del índice hepato-renal del grupo de dieta alta en grasas aumentaron rápidamente durante las primeras tres a seis semanas, antes de alcanzar una meseta. Las secciones hepáticas teñidas con colorante O rojo aceite mostraron un aumento significativo del área teñida en el grupo de dieta alta en grasas en comparación con el grupo de control. También se encontró una correlación entre el porcentaje de área teñida y el índice hepato-renal.La rigidez tisular aumentó gradualmente en el grupo de dieta alta en grasas durante 12 semanas, y alcanzó los 23,1 kilopascales debido a la fibrosis. Las muestras de hígado se tiñeron con rojo picrosirius para localizar el colágeno como un indicador de fibrosis. Se observó un aumento significativo del porcentaje de área teñida en el grupo de dieta alta en grasas en comparación con el grupo de control.Y también se encontró una fuerte correlación entre el área teñida por ciento y los números del módulo E de la onda de cizallamiento. Es importante colocar correctamente el transductor y los círculos o cajas de medición. Evitar artefactos en las imágenes permitirá mediciones repetibles y consistentes.Después del procedimiento, también se pueden realizar mediciones ex vivo de triglicéridos hepáticos y expresión génica de colágeno en el tejido de necropsia para confirmar los resultados observados en las imágenes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Giustetto, P., et. al., Ultrasonido de alta frecuencia parenquimatoso, vascular y metabólico no invasivo e imágenes cerebrales profundas fotoacústicas de rata. J. Vis. Exp. (2015)En este video, demostramos el uso de ultrasonido de alta frecuencia e imágenes fotoacústicas para estudiar la vasculatura y el contenido de hemoglobina en el cerebro de rata. Este método proporciona información detallada sobre la perfusión cerebral y la oxigenación de la sangre, lo que permite el análisis no...

Ecografía de alta frecuencia no invasiva e imágenes Doppler de la hemodinámica del cerebro de rata

La disfunción hemodinámica en etapa temprana es crítica para el desarrollo de la enfermedad renal. Sin embargo, las metodologías de detección son limitadas. Los avances recientes en la ecografía proporcionan una opción precisa y no invasiva para la detección temprana de la lesión renal. Este estudio describe una metodología ecográfica paso a paso para detectar la disfunción renal utilizando un modelo de nefrotoxicidad inducida por fármacos en ratas.

La detección precoz de la disfunción renal hemodinámico inducido por medicamentos Usando tecnología ecográfica en ratas

evaluación no invasiva de la función endotelial en el ser humano puede ser determinada por la técnica de la dilatación mediada por flujo. Aunque miles de estudios han utilizado esta técnica, ningún estudio ha realizado esta técnica no invasiva en ratas. El siguiente artículo describe la medición no invasiva de la dilatación mediada por flujo en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas.

Evaluación de la ecografía de dilatación mediada por flujo de la braquial y femoral superficial en ratas

En ajustes clínicos, una biopsia del hígado se utiliza para evaluar estadios de esteatohepatitis no alcohólica (esteatosis, inflamación, hepatocitos en globo y fibrosis). Aquí ilustramos una biopsia del hígado survivable en ratones que se puede utilizar para análisis histológicos para permitir la evaluación de los agentes terapéuticos de forma más alineada con los ensayos clínicos.

Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)

El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

Utilizando un modelo de ratón de enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) inducida por la dieta, describimos el uso de nuevas técnicas de imagen de microtomografía computarizada in vivo como método no invasivo para evaluar las etapas de progresión de la EHGNA, centrándonos predominantemente en la red vascular hepática debido a su participación significativa en la desregulación hepática relacionada con la EHGNA.

Nuevas técnicas de imagen de microtomografía computarizada in vivo para evaluar la progresión de la enfermedad del hígado graso no alcohólico

El objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo digital tridimensional para el diagnóstico precoz de la fibrosis hepática, que incluya la rigidez de cada vóxel en el hígado del paciente y, por lo tanto, pueda utilizarse para calcular la relación de distribución del hígado del paciente en diferentes etapas de fibrosis.

Un modelo digital tridimensional para el diagnóstico precoz de la fibrosis hepática basado en la elastografía por resonancia magnética

La ecografía Doppler ultrarrápida (UFUS) con alta resolución espacial (100 μm) y sensibilidad representa una modalidad de imagen no invasiva adecuada para obtener una visión cualitativa completa de la vasculatura hepática. UFUS también facilita las mediciones cuantitativas de la microvasculatura, con el objetivo de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad vascular.

Imagen y cuantificación de la vasculatura hepática de ratones mediante ecografía Doppler ultrarrápida

Este estudio describe un protocolo combinado de imágenes de resonancia magnética (IRM) y ultrasonido focalizado pulsado (FUS) de baja intensidad, utilizando ratas vivas con cateterismo de venas yugulares para monitorear la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB).

Monitorización de la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas con un sistema de ultrasonido preclínico focalizado

El objetivo de este protocolo es mostrar la técnica y el uso de la elastografía transitoria en el punto de atención para gastroenterólogos pediátricos que monitorean la afectación hepatobiliar y la enfermedad hepática de fibrosis quística avanzada en personas con fibrosis quística.

Implementación de elastografía transitoria no invasiva en el punto de atención para la evaluación de la enfermedad hepática en poblaciones pediátricas con fibrosis quística

Aprenda a aplicar ultrasonido B-mode y elastografía de onda de cizallamiento para evaluar esteatosis y fibrosis hepática en modelos de rata con NASH. Este método no invasivo permite el seguimiento longitudinal de la progresión de la enfermedad.

Aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de NAFLD/NASH

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