Name: Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende a preparar montajes planos de retina en ratones C57-Black/6 para estudiar cambios vasculares en retinopatía inducida por oxígeno mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a todos los miembros de nuestro laboratorio y del Laboratorio de Animales Oftálmicos del Centro Oftalmológico Zhongshan por su asistencia técnica. También agradecemos al Prof. Chunqiao Liu por su apoyo experimental. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC: 81670872; Beijing, China), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (Subvención No.2019A1515011347), y el proyecto de construcción de hospitales de alto nivel del Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología en el Centro Oftalmológico Zhongshan (Subvención No. 303020103; Guangzhou, provincia de Guangdong, China).

Todos los procedimientos que involucran el uso de ratones fueron aprobados por el comité de ética experimental animal del Centro Oftalmológico Zhongshan, Universidad Sun Yat-sen, China (número autorizado: 2020-082), y de acuerdo con las pautas aprobadas del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro Oftalmológico Zhongshan y la Declaración de la Asociación de Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de la Visión.
1. Inducción del modelo OIR del ratón
<ol><li>Use ratones con una tasa más baja de malformación congénita de los ojos, por ejemplo, ratones C57BL / 6J, y aparee con ellos en una proporción de macho / hembra = 1: 2. Haga que los cachorros nazcan el mismo día y comience a inducir el modelo OIR en P7. Registre el peso corporal de los cachorros de ratón estrictamente antes de modelar. NOTA: Anote el día de nacimiento como P0. Registre el peso de cada ratón regularmente. El peso corporal de las crías recién nacidas es muy importante durante la inducción de OIR ya que la sensibilidad de los ratones en diferentes estados al oxígeno es diferente. Excluya a los cachorros más de 5 g en P7 para garantizar resultados comparables.</li>
	<li>Proporcionar un entorno de vida adecuado para las madres lactantes y sus cachorros, como ajustar la temperatura a 23 °C ± 2 °C, controlar la humedad al 40%-65%, alternar 12 h de luz y 12 h de oscuridad todos los días, agregar un poco de algodón a la jaula para anidar, asegurar alimentos y agua esterilizados adecuados y mantenerlos en jaulas ventiladas individualmente (IVC).</li>
	<li>Controle el nivel de humedad y temperatura dentro de la cámara. Controle la humedad entre 40% a 65% y mantenga la temperatura a 23 °C ± 2 °C.</li>
	<li>Compruebe el suministro de oxígeno con sensores de oxígeno, mantenga un nivel de oxígeno constante al 75% y controle el caudal de oxígeno a 0,5-0,75 L/min. Coloque 50 g de cal sodada en el fondo de la cámara para absorber el exceso de CO2 y mantener los valores de CO2 por debajo del 3%22.</li>
	<li>Controle los comportamientos de las madres lactantes, como el comportamiento de construcción de nidos, morder a sus cachorros y rechazar la lactancia al menos una vez al día. Eliminar a las madres lactantes con maternidad deficiente.</li>
	<li>Coloque a los cachorros P7 (machos y hembras) y sus madres lactantes en una cámara de oxígeno en la que el nivel de oxígeno sea del 75% durante 5 días a P12. Evite la apertura innecesaria de la cámara durante el período de inducción del modelo. Asegúrese de que haya madres sustitutas adicionales para el reemplazo, en caso de que las madres lactantes mueran debido a una lesión pulmonar mientras están en hiperoxia. NOTA: Para garantizar la comparabilidad del experimento, restrinja el número a 6-8 cachorros por cada madre. Preste atención al problema potencial de la toxicidad del oxígeno, que causa la muerte de algunas madres lactantes. Los signos de lesión pulmonar hiperóxica en madres lactantes incluyen, pero no se limitan a, frecuencia respiratoria fluctuante, disminución de la actividad y disminución de la alimentación. Cuando ocurra el fenómeno anterior, eutanasia a la madre lactante con pentobarbital sódico al 1% (50 mg / kg) tan pronto como sea posible. Prepare algunas madres sustitutas, por ejemplo, 129S1 / SvImJ para el reemplazo y úselas solo si es necesario. No se recomienda reemplazar a las madres lactantes como una rutina, ya que esto conducirá a la apertura frecuente de una cámara de oxígeno, lo que resultará en niveles inestables de oxígeno y agresión materna.</li>
	<li>Lleve a los cachorros y a sus madres lactantes de vuelta al aire de la habitación en P12 y controle el peso de todos los cachorros continuamente hasta P17. Agrupe a los cachorros según el peso para asegurarse de que cada grupo experimental tenga una distribución de peso similar.</li>
</ol>2. Preparación de monturas enteras retinianas y tinción por inmunofluorescencia
<ol><li>Registre el peso corporal de los cachorros. Sacrificar a los cachorros por una sobredosis de anestésico (1% pentobarbital sódico 50 mg/kg) o inhalación de CO2 . Otros métodos de eutanasia, como la luxación cervical y la toracotomía bilateral, se pueden utilizar si es necesario.</li>
	<li>Use tijeras curvas para liberar la conexión entre los globos oculares y el tejido orbital. Luego, coloque fórceps curvos en la parte posterior del globo ocular, sujete el nervio óptico y levante rápidamente el ojo de la órbita. Lave los globos oculares en una solución salina tampón fosfato (PBS) 1x preenfriada para eliminar el vello y la sangre de la superficie de los globos oculares.</li>
	<li>Coloque los globos oculares limpios en un tubo de microcentrífuga de 2 ml lleno de paraformaldehído al 4% (PFA) e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador a una velocidad de 12-15 revoluciones por minuto (rpm) (fijación inicial). PRECAUCIÓN: Se sabe que el paraformaldehído es alergénico, generalmente tóxico y extremadamente citotóxico. Siga estrictamente las instrucciones de seguridad y evite la inhalación y el contacto con la piel.</li>
	<li>Use una placa de cultivo y ponga una gota de 1x PBS en la parte central y realice los siguientes pasos bajo un microscopio de disección y coloque un globo ocular en esta gota. Sostenga el globo ocular con un par de fórceps y perfore cuidadosamente la córnea en el limbo corneal con una aguja de jeringa de 1 ml. Inserte la punta de las tijeras en este orificio y corte la córnea cuidadosamente a lo largo del limbo de la córnea. Tenga cuidado de no cortar la retina.</li>
	<li>Retire el iris y el cristalino con un par de fórceps. Luego coloque el ocular restante en el PFA al 4% y fije nuevamente durante otros 45 minutos a temperatura ambiente en un agitador a una velocidad de 12-15 rpm (fijación secundaria).</li>
	<li>Use un plato de cultivo y ponga una gota de 1x PBS en la parte central. Coloque el globo ocular fijo en esta gota. Sostenga el globo ocular con un par de fórceps. Separe suavemente las capas de retina y esclerótica con dos fórceps. Coloque la punta de las tijeras entre las capas de retina y esclerótica y corte la esclerótica hacia el nervio óptico. Despegue la esclerótica de la retina y obtenga la copa retiniana. NOTA: Sostenga la copa posterior por el nervio óptico con fórceps, luego use el extremo curvo de otro fórceps para presionar hacia abajo la esclerótica en la cabeza del nervio óptico y masajee suavemente la retina en un movimiento de barrido hacia adelante como alternativa para liberar la retina.</li>
	<li>Use fórceps para liberar la conexión entre los vasos hialoides radiales y la retina periférica, sujete la raíz de los vasos hialoideos que está cerca de la cabeza del nervio óptico y corte los vasos hialoideos con cuidado.</li>
	<li>Use una pipeta de 2 ml con la punta cortada para transferir la copa retiniana. Coloque la copa retiniana en un pocillo en una placa de 48 pocillos y lávela durante 3 x 5 min con 1x PBS a temperatura ambiente en un agitador a una velocidad de 12-15 rpm.</li>
	<li>Incubar la copa retiniana en una solución mixta de Triton X-100 al 1% (en PBS) y suero de burro normal al 5% (en PBS) durante la noche a 4 °C.<ol><li>Alternativamente, bloquear y permeabilizar las retinas a temperatura ambiente durante 1 h como alternativa. Cambie el suero bloqueante de acuerdo con la fuente del anticuerpo secundario.</li>
	</ol></li>
	<li>Si se marca la vasculatura retiniana con isolectina B4, incubar la retina en un pocillo de placa de 48 pocillos con 0,1% de suero de burro normal (400 μL) e isolectinaB4-594 (1:400) durante la noche a 4 °C en un agitador a una velocidad de 12-15 rpm. NOTA: Si marca los vasos sanguíneos con otros marcadores, como CD31, o marca otras células, use anticuerpos primarios específicos para etiquetarlos.</li>
	<li>Incubar la retina con anticuerpos primarios específicos 1:100-1:500 (en 400 μL 0,1% de suero de burro normal) a 4 °C en un agitador a una velocidad de 12-15 rpm durante 48 h. (opcional)</li>
	<li>Después de volver a la temperatura ambiente, lave la retina con PBST al 0,1% (TritonX-100 al 0,1% en PBS) durante 3 x 20 min en un agitador a una velocidad de 12-15 rpm.</li>
	<li>Incubar la retina con 1:1.000 anticuerpos secundarios (en 400 μL 0,1% de suero de burro normal) durante la noche a 4 °C en un agitador a una velocidad de 12-15 rpm. (opcional)<ol><li>Alternativamente, incubar la retina con anticuerpos secundarios de alta afinidad a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar la retina con DAPI (1:1.000) a temperatura ambiente durante 20-25 min para marcar el núcleo. NOTA: Pruebe las proporciones de dilución óptimas para todos los anticuerpos utilizados en los pasos 10-11 y 13-14 en el pre-experimento.</li>
	<li>Lave la retina durante 3 x 30 min con 0,1% de PBST en un agitador a una velocidad de 12-15 rpm a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera la copa retiniana a un portaobjetos limpio con la abertura hacia arriba. Corte la retina radialmente en las posiciones de las 3, 6, 9 y 12 en punto de periférica a central cortando aproximadamente 1-1.5 mm de distancia de la cabeza del nervio óptico.</li>
	<li>Agregue unas gotas de 1x PBS para enjuagar la retina tres veces. Use papel colocado al aire para secar y aplanar la retina. Agregue una gota de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) al centro del cubreobjetos y deje de agregarlo hasta que el diámetro de la gota aumente a la mitad del cubreobjetos. Voltee rápidamente el cubreobjetos y colóquelo encima de la retina extendida. Evite formar burbujas.</li>
	<li>Tome imágenes de los soportes planos de retina o guarde y proteja las diapositivas de la luz a 4 °C.</li>
</ol>3. Análisis y cuantificación de soportes planos retinianos
NOTA: Para el modelo de ratón OIR, los investigadores a menudo registran el área de oclusión vascular central de la retina y la neovascularización patológica periférica de la retina durante P12-P25. Estudios previos han demostrado que el área avascular central de la retina alcanza el máximo en P12 y se reduce gradualmente de P13 a P17; al mismo tiempo, la retina de los ratones OIR alcanza el pico del área de neovascularización alrededor de P1722,29. A partir de P17, los neovasos retroceden gradualmente y los vasos funcionales vuelven a crecer en el área avascular. La vasculatura retiniana básicamente vuelve a la normalidad en P2533.
<ol><li>Tome imágenes de monturas planas retinianas con un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales) con lente de objetivo 10x. Primero, elija el canal DAPI y coloque la cabeza del nervio óptico en el centro del campo visual. Luego, ajuste otros canales y concéntrese en la vasculatura superficial de la retina. Compruebe los mosaicos en un software fotográfico (consulte Tabla de materiales) y establezca el número de fotos que deben coserse. Haga clic en Iniciar experimento para capturar toda la retina.</li>
	<li>Use un programa de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales) para cuantificar el área de vaso-obliteración (VO) y neovascularización (NV) después de la tinción de inmunofluorescencia.<ol><li>Primero, haga clic en la herramienta Varita mágica y establezca una tolerancia adecuada de acuerdo con la diferencia de brillo y mueva el cursor al fondo y haga clic con el mouse. A continuación, elija Seleccionar inversa para obtener un contorno básico de la retina. Utilice la herramienta Lazo para delinear aún más los detalles de la retina. Usando la función Histograma , registre el valor de píxeles de toda la retina y escríbalo o genere una tabla en un programa de base de datos.</li>
		<li>Divide la imagen de la retina en cuatro cuadrantes. En cada cuadrante, use la herramienta Lazo para dibujar el área VO (Figura 2A-C) y use la herramienta Varita mágica para seleccionar el área NV (Figura 2D-F). A través de la información de píxeles en el histograma, calcule la proporción de píxeles de VO y NV a toda la retina, es decir, el porcentaje de área de VO o NV en relación con toda la retina. NOTA: También existe una canalización de código abierto y totalmente automatizada para la cuantificación de áreas VO y NV en imágenes OIR utilizando redes neuronales de aprendizaje profundo (http://oirseg.org/), que proporciona una forma confiable y de ahorro de tiempo para los investigadores, así como unifica el estándar de la cuantificación34.</li>
	</ol></li>
	<li>Registre la información de píxeles en una tabla de hoja de cálculo, lo cual es conveniente para el análisis posterior.</li>
</ol>4. Imágenes in vivo con angiografía de fondo de fluoresceína (FFA)
NOTA: Para ratones OIR, tanto la perfusión FITC como la tinción de inmunofluorescencia solo se pueden usar una vez debido a la muerte de animales de experimentación. En comparación con esto, una de las ventajas de FFA es la observación de los cambios dinámicos de los vasos retinianos del ratón durante el desarrollo y el estado patológico in vivo35,36.
<ol><li>Pesar a los cachorros antes de la anestesia.</li>
	<li>Anestesiar a las crías mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 0,3% a una dosis de 30-50 mg/kg. NOTA: Para ratones dentro de 1 mes, preste atención a las dosis de anestesia. Use concentraciones y dosis más bajas de anestésico para reducir la muerte de ratones causada por la anestesia. Después de anestesiar a los cachorros, use una pequeña almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. La hipotermia no solo afecta la función fisiológica de los cachorros, sino que también conduce a cambios en la cristalina y acelera el desarrollo de cataratas.</li>
	<li>Use gotas oftálmicas midriáticas de 20 μL (0,5% tropicamida + 0,5% clorhidrato de fenilefrina) para cada cachorro y espere 5 minutos para lograr una dilatación pupilar duradera (Figura 3A, B).</li>
	<li>Lleve a los cachorros anestesiados frente al dispositivo de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Mantenga a los cachorros en una pequeña almohadilla térmica, colóquelos en una posición estable y use lágrimas artificiales regularmente para mantener la humedad en la córnea. Haga clic en el modo de imágenes infrarrojas del fondo de ojo (IR) para ajustar la cabeza del nervio óptico al centro de la pantalla. NOTA: Al observar un ojo de los cachorros, no olvide proteger el otro ojo. Use gotas oftálmicas de hipromelosa para evitar que la córnea se blanquee debido a la sequedad.</li>
	<li>Después de la inyección intraperitoneal de 0,15 ml de solución de sal de sodio fluoresceína al 0,5%, haga clic en el botón FA y en el botón Inyección inmediatamente en el panel táctil del dispositivo de imágenes para iniciar el cronometraje. Grabe las imágenes después de 3 minutos cuando la circulación sanguínea de la retina entre en la fase venosa y observe la retina no menos de 6-8 minutos. NOTA: Después de la inyección intraperitoneal de solución salina de sodio fluoresceína, la piel, la mucosa y la orina de los cachorros muestran un verde amarillento evidente. La mayor parte de la fluoresceína es excretada por los cachorros en un día. La inyección de fluoresceína sódica por vía intraperitoneal cada dos días durante seis veces no causa efectos secundarios significativos37.</li>
	<li>Mueva la cabeza del nervio óptico al centro del área de adquisición de imágenes y tome la primera imagen de la retina central. Luego, mueva la lente del dispositivo de imágenes horizontalmente hacia el lado nasal del ojo hasta que la cabeza del nervio óptico se encuentre en el punto medio de un lado del área de adquisición de imágenes y tome la segunda imagen. Continuar tomando imágenes de la retina temporal, superior e inferior, respectivamente utilizando este método (Figura 3C). NOTA: Tome imágenes de "Cinco orientaciones" dentro de los 12 minutos a medida que ocurre la fase de regresión. Se permite que la posición de la cabeza del nervio óptico en la imagen inferior no caiga en la línea lateral debido al ajuste limitado del ángulo de la lente.</li>
	<li>Guarde las imágenes y utilice un programa de procesamiento de imágenes para coser.</li>
</ol>5. Procesamiento de imágenes de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA)
<ol><li>Abra el programa de procesamiento de imágenes y haga clic en Nuevo en archivo para crear un nuevo lienzo con un fondo negro (Figura 4A).</li>
	<li>Abra primero una imagen de la retina central en la capa de fondo. Haga clic en Archivo y agregue la segunda imagen. Ajuste la opacidad de la segunda imagen al 60%, mueva y cambie el tamaño de la segunda imagen hasta que las mismas partes de las dos imágenes se superpongan altamente. Haga clic en el botón Cambiar entre los modos de transformación libre y deformación y realice ajustes sutiles en los recipientes si es necesario. Luego, vuelva a colocar la opacidad de la segunda imagen al 100% (Figura 4A, B).</li>
	<li>Seleccione dos imágenes al mismo tiempo y haga clic en Fusionar capas automáticamente. Marque Panorama como método de mezcla y seleccione las dos oraciones siguientes. Haga clic en Aceptar y termine la costura de la imagen de las dos primeras imágenes (Figura 4C, D).</li>
	<li>Tome las dos primeras imágenes cosidas como un todo, agregue la tercera imagen y continúe mezclando. Repita los métodos anteriores para completar la costura de cinco imágenes (Figura 4E).</li>
	<li>Utilice la herramienta Recortar para cortar imágenes de FFA en diferentes puntos de tiempo a un tamaño uniforme y observe cambios dinámicos de la vasculatura retiniana de P15 a P25 tanto en cachorros normales como OIR.</li>
</ol>6. Análisis estadístico
<ol><li>Presentar valores como media ± desviación estándar (d.e.).</li>
	<li>Utilice la prueba t de Student para comparar dos muestras independientes. Utilice ANOVA unidireccional para comparar múltiples conjuntos de datos y combinarlos con la prueba de Dunnett o Tukey, que es una prueba de comparación múltiple de uso común.</li>
	<li>Para datos no distribuidos normalmente, utilice la prueba U de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal Wallis. Considere diferencias estadísticas significativas cuando P < 0,05.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La susceptibilidad de los ratones a OIR se ve afectada por muchos factores. Los cachorros de diferentes antecedentes genéticos y cepas no se pueden comparar. En ratones albinos BALB/c, los vasos vuelven a crecer rápidamente en el área de VO con mechones neovasculares significativamente reducidos38, lo que trae algunas dificultades a la investigación. En ratones C57BL/6, hay un aumento del daño a los fotorreceptores en comparación con la cepa de ratón BALB/cJ39,40...

La neovascularización retiniana (RNV), que se define como un estado en el que nuevos vasos patológicos se originan en las venas retinianas existentes, generalmente se extiende a lo largo de la superficie interna de la retina y crece en el espacio vítreo (o subretiniano en algunas condiciones)1. Es un sello distintivo y una característica común de muchas retinopatías isquémicas, incluyendo la retinopatía del prematuro (ROP), la oclusión de la vena retiniana (RVO) y la retinopatía diabética proliferativa (RDP)2.
Numerosas observaciones clínicas y experimentales han indicado que la isquemia es la principal causa de neovascularización retiniana 3,4. En la ROP, los neonatos están expuestos a oxígeno de alto nivel en incubadoras cerradas para aumentar las tasas de supervivencia, lo que también es un factor importante para la detención del crecimiento vascular. Después del tratamiento, las retinas de los recién nacidos experimentan un período relativamente hipóxico5. Otras situaciones se observan en la oclusión de las venas retinianas centrales o ramificadas en la OVR y también se observa daño de los capilares retinianos causado por microangiopatía en la PDR2. La hipoxia aumenta aún más la expresión de factores angiogénicos como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a través de la vía de señalización del factor 1α inducido por hipoxia (HIF-1α) que a su vez guía a las células endoteliales vasculares para crecer en el área hipóxica y formar nuevos vasos 6,7.
La RP es un tipo de retinopatía proliferativa vascular en lactantes prematuros y una de las principales causas de ceguera infantil 8,9, que se caracteriza por hipoxia retiniana, neovascularización retiniana e hiperplasia fibrosa10,11,12. En la década de 1950, los investigadores encontraron que la alta concentración de oxígeno puede mejorar significativamente los síntomas respiratorios de los bebés prematuros13,14. Como resultado, la oxigenoterapia se usaba cada vez más en bebés prematuros en ese momento15. Sin embargo, simultáneamente con el uso generalizado de oxigenoterapia en lactantes prematuros, la incidencia de RP aumentó año tras año. Desde entonces, los investigadores han relacionado el oxígeno con la ROP, explorando varios modelos animales para comprender la patogénesis de la ROP y la RNV16.
En humanos, la mayor parte del desarrollo de la vasculatura retiniana se completa antes del nacimiento, mientras que en roedores la vasculatura retiniana se desarrolla después del nacimiento, proporcionando un sistema modelo accesible para estudiar la angiogénesis en la vasculatura retiniana2. Con el progreso continuo de la investigación, los modelos de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se han convertido en modelos importantes para imitar la angiogénesis patológica resultante de la isquemia. No hay especies animales específicas en el estudio del modelo OIR y el modelo se ha desarrollado en varias especies animales, incluyendo gatito 17, rata18, ratón19, cachorro beagle 20 y pez cebra21. Todos los modelos comparten el mismo mecanismo por el cual están expuestos a la hiperoxia durante el desarrollo temprano de la retina y luego regresan al ambiente normóxico. Smith et al. observaron que la exposición de crías de ratón a la hiperoxia de P7 durante 5 días indujo una forma extrema de regresión de los vasos en la retina central y traerlas de vuelta al aire ambiente en P12 desencadenó gradualmente mechones neovasculares, que crecieron hacia el cuerpo vítreo19. Este fue un modelo de ratón OIR estandarizado también llamado modelo Smith. Connor et al. optimizaron aún más el protocolo y proporcionaron un método universalmente aplicable para cuantificar el área de VO (vaso-obliteración) y NV (neovascularización) en 2009, lo que aumentó la aceptación y utilización del modelo22. El modelo de ratón OIR sigue siendo el modelo más utilizado ahora debido a su pequeño tamaño, reproducción rápida, antecedentes genéticos claros, buena repetibilidad y alta tasa de éxito.
En ratones, la vascularización retiniana comienza después del nacimiento con el crecimiento interno de vasos desde la cabeza del nervio óptico hacia la retina interna hacia la ora serrata. Durante el desarrollo normal de la retina, los primeros vasos retinianos brotan de la cabeza del nervio óptico alrededor del nacimiento, formando una red en expansión (el plexo primario) que llega a la periferia alrededor del día postnatal 7 (P7) 23. Luego, los vasos comienzan a crecer en la retina para formar una capa profunda, penetrar en la retina y establecer una red laminar alrededor de la capa nuclear interna (INL) como en el humano24. Al final de la tercera semana postnatal (P21), el desarrollo más profundo del plexo está casi completo. Para el modelo de ratón OIR, la oclusión vascular siempre aparece en la retina central debido a la rápida degeneración de un gran número de redes vasculares inmaduras en la región central durante la exposición a la hiperoxia. Por lo tanto, el crecimiento de la neovascularización patológica también ocurre en la retina periférica media, que es el límite del área de no perfusión y el área vascular. Sin embargo, los vasos retinianos humanos casi se han formado antes del nacimiento. En cuanto a los bebés prematuros, la retina periférica no está completamente vascularizada cuando se expone a la hiperoxia25,26. Así, la oclusión vascular y la neovascularización aparecen principalmente en la retina periférica27,28. A pesar de estas diferencias, el modelo OIR de ratón recapitula de cerca los eventos patológicos que ocurren durante la neovascularización inducida por isquemia.
La inducción del modelo OIR se puede dividir en dos fases29: en la fase 1 (fase de hiperoxia), el desarrollo vascular retiniano se detiene o retrasa con oclusión y regresión de los vasos sanguíneos como resultado de la disminución del VEGF y la apoptosis de las células endoteliales 24,30; En la fase 2 (fase de hipoxia), el suministro de oxígeno retiniano será insuficiente en condiciones de aire ambiente29, lo cual es esencial para el desarrollo neural y la homeostasis 19,31. Esta situación isquémica generalmente resulta en una neovascularización anormal no regulada.
Actualmente, el método de modelado comúnmente utilizado es alternar la exposición alta / baja al oxígeno: las madres y sus cachorros están expuestos al 75% de oxígeno durante 5 días en P7 seguido de 5 días en el aire ambiente hasta que P17 demostró resultados comparables22, que es el punto final de la inducción del modelo de ratón OIR. (Figura 1). Además de simular la ROP, esta neovascularización patológica mediada por isquemia también se puede utilizar para estudiar otras enfermedades isquémicas de la retina. Las principales mediciones de este modelo incluyen la cuantificación del área de VO y NV, que se analizan a partir de montajes planos retinianos mediante tinción de inmunofluorescencia o perfusión FITC-dextrano. Cada ratón puede ser estudiado sólo una vez debido a la operación letal. En la actualidad, existen pocos métodos para observar continuamente cambios dinámicos de la vasculatura retiniana durante el proceso de regresión vascular y angiogénesis patológica32. En este documento, proporcionamos un protocolo detallado de inducción del modelo OIR, análisis de montajes planos retinianos, así como un flujo de trabajo de angiografía de fondo de ojo fluoresceína (FFA) en ratones que sería útil para obtener una comprensión más completa de los cambios dinámicos vasculares durante dos fases del modelo de ratón OIR.

<table><tbody><tr><td>Jeringa estéril de 1</td><td>mL Solarbio</td><td>YA0550</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina e inyección intraperitoneal</td></tr><tr><td>1&veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>&nbsp; FG701-01</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2 ml</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina Placas de</td></tr><tr><td>pocillos múltiples tratadas con TC transparentes de 48 pocillos</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio adhesivos</td><td></td><td></td><td>Varios Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Gas de dióxido de carbono</td><td>Varios</td><td></td><td>Para el sacrificio</td></tr><tr><td>Diapositiva de cubierta</td><td>Varios</td><td></td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina Solución</td></tr><tr><td>de tinción DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td>Para el etiquetado de núcleos en monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Fluoresceína sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>Para in vivo</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>&nbsp; Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>Para la adquisición de imágenes de fluorescencia de monturas planas retinianas</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Medios de montaje</td><td>SouthernBiotech</td><td>&nbsp; 0100-01</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Hidroxipropilmetilcelulosa</td><td>Maya</td><td>89161</td><td>Para imágenes in vivo</td></tr><tr><td>Anticuerpo Isolectina B4 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Para el marcaje de la vasculatura de la retina en monturas planas de la retina</td></tr><tr><td>Ratones C57/BL6J</td><td>GemPharmatech de la provincia</td><td></td> de Jiangsu <td>Para la inducción del modelo OIR</td></tr><tr><td>Micro disección tijera de hoja recta</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>No.4 pinzas rectas World</td><td>Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501978-6</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Sensor O2</td><td>Varios</td><td></td><td>Para controlar el nivel de O2</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>Para la inducción del modelo OIR</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Para la fijación de tejidos</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Varios</td><td></td><td>Para la anestesia</td></tr><tr><td>Cal sódica</td><td>Varios</td><td></td><td>Para absorber el exceso de CO2 en la cámara de oxígeno</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>Heidelberg</td><td>HC00500002</td><td>Para in vivo imágenes</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>Para el análisis estadístico</td></tr><tr><td>Agitador desmoldeador de Tansference</td><td>Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos (fijación baja)</td><td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Varios</td><td></td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; SLBW6818</td><td>Para la preparación de monturas planas de retina</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Varios</td><td></td><td>Para in vivo</td></tr><tr><td>software de imagen ZEN</td><td>ZEISS</td><td>Para la adquisición y exportación</td> de <td></td> imágenes</tr></tbody></table>

monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se usa ampliamente para estudiar el crecimiento anormal de vasos en enfermedades isquémicas de la retina, incluida la retinopatía del prematuro (ROP), la retinopatía diabética proliferativa (PDR) y la oclusión de la vena retiniana (RVO). La mayoría de los estudios OIR observan neovascularización retiniana en puntos de tiempo específicos; sin embargo, el crecimiento dinámico de vasos en ratones vivos a lo largo de un curso de tiempo, que es esencial para comprender las enfermedades vasculares relacionadas con OIR, ha sido poco estudiado. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la inducción del modelo de ratón OIR, destacando las posibles dificultades y proporcionando un método mejorado para cuantificar rápidamente las áreas de vaso-obliteración (VO) y neovascularización (NV) utilizando tinción de inmunofluorescencia. Más importante aún, monitoreamos el recrecimiento de los vasos en ratones vivos de P15 a P25 mediante la realización de angiografía de fondo de ojo fluoresceína (FFA) en el modelo de ratón OIR. La aplicación de FFA al modelo de ratón OIR nos permite observar el proceso de remodelación durante el recrecimiento del vaso.

En el modelo de ratón OIR, el resultado más importante y básico es la cuantificación del área VO y NV. Después de vivir en el ambiente de hiperoxia durante 5 días desde P7, la retina central de las crías mostró el área de no perfusión más grande. Bajo la estimulación de la hipoxia en otros 5 días, se produjo gradualmente una neovascularización retiniana que fluoresceba más intensamente que los vasos normales circundantes. Después de P17, la señal de fluorescencia de neovascularización patológica retrocedió rápidamente co...

Este protocolo describe un método detallado para la preparación y tinción de inmunofluorescencia de ratones montados planos de retina y análisis. El uso de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA) para crías de ratones y el procesamiento de imágenes también se describen en detalle.

Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Este protocolo puede ayudar a los investigadores a separar fácilmente las retinas de los ratones y observar los cambios dinámicos en la vasculatura retiniana del modelo de ratón OIR. Las principales ventajas de este método son la preservación de la integridad de las retinas separadas y permitir que cada ratón sirva como su propio control, lo que hace que los resultados sean más comparables. Los investigadores que prueban este método por primera vez pueden tener dificultades al tomar las cinco imágenes de orientación porque es un poco difícil colocar a los cachorros en la posición correcta.Para recolectar el tejido para el montaje completo de la retina, use tijeras curvas para desconectar los globos oculares del tejido orbital de un cachorro C57-Black / 6 sacrificado. Luego, inserte pinzas curvas en la parte posterior del globo ocular, sujetando el nervio óptico y levantando rápidamente el ojo de la órbita. Coloque los globos oculares en PBS preenfriado para eliminar el vello y la sangre de la superficie.Cuando se hayan recogido todos los globos oculares, transfiera los globos oculares limpios a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga 4% de paraformaldehído e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente y de 12 a 15 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, agregue una gota de PBS al centro de una placa de cultivo bajo un microscopio de disección y coloque un globo ocular en la gota. Sosteniendo el globo ocular con un par de fórceps, use una aguja de jeringa de un mililitro para perforar cuidadosamente la córnea en el limbo corneal.Inserte la punta de un par de tijeras en la punción y corte la córnea a lo largo del limbo corneal, teniendo cuidado de no cortar la retina. Use fórceps para extraer el iris y el cristalino, y coloque el ocular restante en paraformaldehído al 4% para una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente en el agitador. Al final de la incubación, coloque el ocular fijo en una gota fresca de PBS en el centro de un nuevo plato de cultivo.Sosteniendo el ocular con un par de fórceps, use un segundo par de fórceps para separar suavemente las capas de retina y esclerótica. Coloque la punta de las tijeras entre las capas de retina y esclerótica, y corte la esclerótica hacia el nervio óptico. Despegue la esclerótica de la retina para obtener la copa retiniana.Usando fórceps, libere la conexión entre los vasos hialoides radiales y la retina periférica. Use una pipeta de dos mililitros con la punta cortada para transferir la copa retiniana a un pocillo de una placa de 48 pocillos durante tres lavados de cinco minutos en PBS a temperatura ambiente en el agitador. Después del último lavado, incube la taza en 1% Triton X-100 y 5% de suero de burro normal en PBS durante la noche a cuatro grados centígrados.Para marcar la vasculatura retiniana con isolectina B4, incubar la retina en un pocillo de una placa de 48 pocillos en 400 microlitros 0,1% suero de burro normal suplementado con isolectina B4-594 durante la noche a 4 grados centígrados en una coctelera. Si es necesario, se puede agregar otro anticuerpo primario al mismo tiempo. Al día siguiente, lave la retina con tres lavados de 20 minutos en PBST al 0,1% en el agitador.Después del último lavado, incubar la retina con un anticuerpo secundario apropiado de alta afinidad durante una hora a temperatura ambiente antes de etiquetar la muestra con DAPI durante 20 a 25 minutos. Al final de la incubación, lavar la retina con tres lavados de 30 minutos en PBST al 0,1% a temperatura ambiente con agitación. Después del último lavado, transfiera la copa retiniana a un portaobjetos limpio con la abertura hacia arriba, y use el microscopio para cortar la retina radialmente en las posiciones de las tres, seis, nueve y 12 en punto desde la periferia hacia el centro, hasta uno a 1,5 milímetros de la cabeza del nervio óptico.Enjuague la retina tres veces con unas gotas de PBS por lavado antes de usar papel colocado al aire para secar y aplanar la retina. Agregue una gota de medio de montaje al centro del cubreobjetos hasta que el diámetro de la gota cubra la mitad del cubreobjetos. Luego, coloque rápidamente el cubreobjetos con el lado medio de montaje hacia abajo sobre la retina extendida.Una vez que se han preparado todos los soportes planos de retina, las muestras se pueden obtener imágenes mediante microscopía de fluorescencia confocal. Para obtener imágenes in vivo, agregue 20 microlitros de gotas oftálmicas midriáticas para lograr una dilatación de la pupila duradera. Después de cinco minutos, coloque a los cachorros en una posición estable en una pequeña almohadilla térmica frente al dispositivo de imágenes.Para mantener la humedad en las córneas, agregue regularmente lágrimas artificiales durante todo el procedimiento de imágenes. A continuación, haga clic en Imágenes de fondo de ojo infrarrojo en el dispositivo para ajustar la cabeza del nervio óptico al centro de la pantalla. Inyecte por vía intraperitoneal 150 microlitros de solución salina de sodio con fluoresceína al 0,5% e inmediatamente haga clic en los botones FA e Inyección en el panel táctil del dispositivo de imágenes para iniciar el temporizador.Después de tres minutos, cuando la circulación sanguínea de la retina haya entrado en la fase venosa, adquiera la primera imagen de la retina central. Mueva la lente del dispositivo de diagnóstico por imágenes horizontalmente hacia el lado nasal del ojo hasta que la cabeza del nervio óptico esté ubicada en el punto medio de un lado del área de adquisición de imágenes y tome la segunda imagen. Continúe moviendo el cristalino y adquiera imágenes de la retina temporal, superior e inferior de la misma manera.Para procesar las imágenes de la retina en un programa de procesamiento de imágenes adecuado, abra el menú Archivo y haga clic en Nuevo para crear un nuevo lienzo con un fondo negro. Abra la imagen de la retina central. A continuación, haga clic en Archivo para agregar una segunda imagen.Ajuste la opacidad de la segunda imagen al 60% y mueva y cambie el tamaño de la imagen hasta que las dos imágenes se superpongan. Haga clic en Cambiar entre los modos de transformación libre y deformación, y realice ajustes sutiles en los recipientes si es necesario. A continuación, vuelva a establecer la opacidad de la segunda imagen en 100%Seleccione ambas imágenes y haga clic en Capas de fusión automática.Marque Panorama como método de fusión y también marque las casillas Tonos y colores sin fisuras y Áreas transparentes de relleno conscientes del contenido. Haga clic en Aceptar para completar la unión de las dos primeras imágenes. A continuación, agregue la tercera imagen y cose esta imagen a las dos primeras imágenes como se demostró hasta que se hayan cosido las cinco imágenes de una sola retina.Cuando se hayan procesado todas las imágenes del análisis, utilice la herramienta Recortar para recortar las imágenes FFA a un tamaño uniforme para facilitar la observación de los cambios en la dinámica de la vasculatura retiniana en diferentes puntos de tiempo de desarrollo. Después de cinco días de exposición a la hiperoxia, las retinas centrales de las crías postnatales del día 12 demuestran una gran área de no perfusión. Tras la transferencia a cinco días de condiciones hipóxicas, las retinas se neovascularizan gradualmente, exhibiendo un aumento en la señal de fluorescencia más fuerte que la observada en los vasos normales circundantes.Después del día postnatal 17, la neovascularización patológica retrocede rápidamente y la retina muestra una apariencia completamente normal para el día postnatal 25. Se puede lograr una buena repetibilidad y estabilidad del modelo de retinopatía inducida por oxígeno controlando el tamaño de la camada y el aumento de peso postnatal de los cachorros. Como se observa, la vaso-obliteración típicamente alcanza su punto máximo en el día postnatal 12 y desaparece en el día postnatal 25, mientras que la neovascularización alcanza su punto máximo en el día postnatal 17 y retrocede en el día postnatal 25.En el día postnatal 15 a 25 ratones con retinopatía inducida por oxígeno, el diámetro de los vasos sanguíneos retinianos aumenta y se vuelve altamente tortuoso en comparación con el observado para las retinas de ratones normales. Los fórceps en la mano izquierda juegan principalmente un papel de apoyo. Tenga cuidado de no apretar el globo ocular, que puede deformarlo o romperlo.

monitoring-dynamic-growth-retinal-vessels-oxygen-induced-retinopathy

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La microscopía intravital se puede utilizar en animales para visualizar y medir los diámetros vasculares de la retina, las velocidades del torrente sanguíneo y el flujo sanguíneo total de la retina.

Mediciones de videomicroscopía intravital del flujo sanguíneo de la retina en ratones

La retina de roedores ha sido reconocida como una ventana de acceso al cerebro. En este documento técnico se proporciona un protocolo que emplea el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno para estudiar los mecanismos que conducen al fracaso de la regeneración vascular en el sistema nervioso central después de la lesión isquémica. El sistema descrito también se puede aprovechar para explorar estrategias para promover el nuevo crecimiento de vasos sanguíneos funcionales dentro de la...

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

Muchas enfermedades oculares visión-que amenaza se asocian a microvasos retiniana disfuncional. Por lo tanto, la medición de las respuestas de la arteriola retiniana es importante investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Este artículo describe un protocolo detallado para ratón arteriola retiniana aislamiento y preparación para evaluar los efectos de sustancias vasoactivas en el diámetro vascular.

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se puede utilizar para modelar enfermedades retinianas isquémicas como la retinopatía de la prematuridad y la retinopatía diabética proliferativa y para servir como modelo para estudios de prueba de concepto en la evaluación de fármacos antiangiogénicos para enfermedades neovasculares. OIR induce neovascularización robusta y reproducible en la retina que se puede cuantificar.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones

Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

La vasculatura de la retina del ratón es particularmente interesante para comprender los mecanismos de formación de patrones vasculares. Este protocolo mide automáticamente el diámetro de los vasos de la retina del ratón a partir de imágenes de fondo de ojo de angiografía fluorescente a una distancia fija del disco óptico.

Medición del diámetro de los vasos retinianos a partir de imágenes de angiografía fluorescente de ratón

En este informe, proponemos una nueva aplicación de la luz de curado de resinas dentales base de montaje de los electrodos o sondas de microdiálisis en experimentos crónicos. Este material permite contacto directo con el cráneo.

Aplicación de curado con luz Resina Adhesivo Dental para los electrodos de montaje o sondas de microdiálisis en experimentos crónica

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado...

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Aprende a preparar montajes planos de retina en ratones C57-Black/6 para estudiar cambios vasculares en retinopatía inducida por oxígeno mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal.

Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Explorar más videos