Lograr un cribado eficiente de fragmentos en las instalaciones de XChem en Diamond Light Source

La instalación XChem en Diamond Light Source proporciona un cribado rutinario de fragmentos gráficos de cristal a gran escala, lo que respalda todo el proceso de deposición del cristal. La cristalografía de rayos X es una parte esencial del conjunto de herramientas FBDD. Es lo suficientemente sensible como para identificar aglutinantes débiles y proporciona directamente información estructural sobre las interacciones a nivel molecular.

El descubrimiento de fármacos basado en fragmentos es una estrategia ampliamente utilizada para el descubrimiento de plomo. Ha entregado seis medicamentos para uso clínico y más de 50 moléculas han avanzado a ensayos clínicos. El impacto de los avances y la eficiencia proporcionados por la plataforma XChem sobre los métodos tradicionales de remojo, la recopilación de datos y los métodos de análisis se demuestra mejor visualmente.

Comience eligiendo los cristales y la ubicación del compuesto. Abra TextRank desde una PC y seleccione la bandeja de cristal, ya sea de la lista en la parte inferior derecha o escribiendo el código de barras en el cuadro en la parte superior izquierda. Seleccione el formato de imagen correcto y la vista de pozo único.

Para agregar solvente o compuestos a una gota sin golpear el cristal, haga clic con el botón derecho dentro de la gota, pero lejos del cristal cuando se encuentre un cristal adecuado para un experimento mientras se mueve a través de las imágenes de la gota. Abra el software Echo y seleccione nuevo para dispensar soluciones utilizando el dispensador acústico. Elija la placa de pocillo de origen correcta y la clase de líquido.

Asegúrese de seleccionar el tipo de placa correcto como placa de destino. A continuación, marque la casilla personalizada y continúe. Seleccione importar y elija el archivo por lotes correspondiente.

A continuación, complete los pasos de importación según lo solicite el software. Utilice los mapas de placas para comprobar la solución que se va a dispensar y los lugares de destino. A continuación, ejecute el protocolo siguiendo las indicaciones a medida que surjan.

Las soluciones de la placa fuente se dispensarán en las gotas de cristal elegidas. Guarde la placa en la incubadora durante el tiempo requerido. Para cosechar los cristales utilizando el dispositivo semiautomático de recolección de cristales, presione el botón de inicio del flujo de trabajo para pasar a la primera posición de pozo seleccionada.

Si el cristal ha sobrevivido, móntelo en el bucle y sumérjalo en el nitrógeno líquido, colocándolo en la posición uno en el primer disco de la lista. Seleccione la descripción apropiada para el cristal en la interfaz. Si la gota es un remojo compuesto, registre la descripción del estado compuesto.

Si el cristal se ha montado correctamente, seleccione montado, de lo contrario, seleccione fallar. Una vez que se hayan cosechado los cristales, lleve los discos al escáner de código de barras y colóquelos en el soporte uno a la vez para escanear los códigos de barras del disco y el pin. Una vez que se complete el escaneo, coloque las tapas en los discos y guárdelos en un depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido.

Para recopilar las muestras descentradas, observe la vista del cambiador de muestras en ISPyB y seleccione clasificar por resolución AP para clasificar las muestras por resolución procesada automáticamente en una graduación de color de verde a rojo. Haga clic en las muestras para comprobar si hay muestras rojas o amarillas. A continuación, compruebe las instantáneas del cristal para ver si el cristal se ha centrado.

Para recuperar y analizar los resultados del procesamiento automático de Diamond a través de XChem Explorer o XCE, en un terminal vaya a la subcarpeta de procesamiento y use el alias XCE para abrir XChem Explorer. Seleccione el botón Actualizar tablas de la fuente de datos en la pestaña de información general para actualizar el resumen de los datos experimentales. En la pestaña de configuración, seleccione el directorio de recopilación de datos y abra la pestaña de conjuntos de datos.

Elija el destino en el menú desplegable Seleccionar destino, seleccione Obtener nuevos resultados del procesamiento automático en el menú desplegable Conjuntos de datos y haga clic en Ejecutar. Para calcular los mapas iniciales con Dimple, abra la pestaña de mapas, elija el modelo de referencia en el menú desplegable y seleccione los datasets deseados y, a continuación, ejecute Dimple en los archivos MTZ seleccionados. Para generar restricciones de ligandos, seleccione los conjuntos de datos deseados y, a continuación, cree un archivo SCF, PDB o PNG de los compuestos seleccionados en el menú desplegable de mapas y restricciones.

Para identificar los hits con Panda, seleccione la pestaña Pandas, asegúrese de que el directorio de salida esté definido correctamente y ejecute panda. Analizar desde el menú desplegable de identificación de visitas. Para analizar los resultados identificados por Panda, ejecute panda.

Inspeccionar en el menú desplegable Identificación de visita. Para abrir Coot con el panel de control de Panda. Cargue mapas de promedio y 2mFo-DFc de Dimple para compararlos con el mapa de eventos y el modelo.

Una vez que se haya instalado un ligando, haga clic en fusionar ligando con el modelo y guarde el modelo antes de navegar a otro evento para evitar perder cualquier cambio en el modelo de estado ligado. Anote el evento de enlace mediante el campo de comentario de evento y anote los sitios de enlace mediante la información del sitio de registro. Una vez que todos los ligandos viables se hayan modelado, fusionado y guardado en función del mapa de eventos, cierre panda.inspect.

Exporte los modelos de inspección de Panda de nuevo al directorio del proyecto e inicie una ronda inicial de refinamiento para los conjuntos de datos seleccionados, y el refinamiento ahora será visible en la pestaña de refinamiento. La línea XChem para el cribado de fragmentos mediante cristalografía de rayos X se ha simplificado ampliamente, lo que ha permitido su adopción por parte de la comunidad científica. Este gráfico demuestra la aceptación y consolidación del programa de usuarios desde 2015 hasta 2019 con la creación de grupos de asignación de bloques en 2019 y la resiliencia de la plataforma durante la pandemia de COVID-19 en 2020.

Las campañas exitosas producen un mapa tridimensional de los posibles sitios de interacción en la proteína diana. Un resultado típico es el cribado XChem de la proteasa principal del SARS-CoV-2. Los sitios de interés conocidos, como los sitios activos de enzimas y las subbolsas, se muestran en amarillo.

Los sitios alostéricos putativos, como los involucrados en las interacciones proteína-proteína, se muestran en magenta y las interfaces de empaquetamiento de cristales, generalmente consideradas falsos positivos, se muestran en verde. Históricamente, el uso de la cristalografía como cribado de fragmentos primarios ha sido difícil. Este estudio documentó los protocolos de la tubería XChem desde la preparación de la muestra hasta las estructuras finales.

El cribado cristalográfico de fragmentos complementa otras técnicas biofísicas y, por lo general, es esencial para progresar los golpes de fragmentos a compuestos de plomo. Se puede aplicar a cualquier clase de diana de descubrimiento de fármacos.