Name: Lograr un cribado eficiente de fragmentos en las instalaciones de XChem en Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende el proceso XChem para cribado de fragmentos basado en cristalografía de rayos X en Diamond Light Source. Este método optimiza el descubrimiento de fármacos al identificar unidores débiles y sitios de interacción proteicos.

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Este trabajo representa un gran esfuerzo conjunto entre la Fuente de Luz de Diamante y el Consorcio Genómico de Estructuras. Los autores desean agradecer a los diversos grupos de apoyo de Diamond y al grupo MX por su contribución a la automatización de la línea de luz i04-1 y por proporcionar una recopilación de datos optimizada y canalizaciones de procesamiento automático, que se ejecutan comúnmente en todas las líneas de luz MX. También les gustaría agradecer al grupo SGC PX por su resiliencia al ser los primeros usuarios en probar la configuración y a Evotec por ser el primer usuario industrial serio. Este trabajo contó con el apoyo de iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El proceso descrito en este documento ha sido ampliamente probado por la comunidad de usuarios y la adaptabilidad de los protocolos descritos aquí es clave para manejar la amplia variedad de proyectos que normalmente se encuentran en la plataforma. Sin embargo, son necesarios algunos requisitos previos del sistema cristalino.
Para cualquier campaña de cribado de fragmentos llevada a cabo mediante cristalografía de rayos X, es fundamental contar con un sistema cristalino reproducible y robusto. Como el protocolo estándar XChem implica la adición del fragmento directamente a la gota de cristal, la optimización debe centrarse en el número de gotas que contienen cristales de alta calidad en lugar del número total de cristales. Si las gotas contienen varios cristales, entonces son efectivamente redundantes, aunque pueden aliviar el proceso de recolección. Además, transferir el protocolo de cristalización del instituto de origen a las instalaciones in situ puede ser un reto. Por lo general, esto se logra mejor utilizando la siembra de cristales para promover la nucleación reproducible54 y, por lo tanto, una buena práctica es que los usuarios proporcionen existencias de semillas junto con sus soluciones de proteínas y cristalización.
Para garantizar una buena solubilidad y soporte de los compuestos, las altas concentraciones de remojo destinadas a impulsar la unión de fragmentos débiles, las bibliotecas de fragmentos se proporcionan en disolventes orgánicos, específicamente DMSO y etilenglicol. El suministro de dos disolventes diferentes ofrece a los usuarios una alternativa para los cristales que no toleran el DMSO en absoluto, o cuando ocluye la unión de fragmentos en un sitio de interés. Los usuarios pueden suministrar bibliotecas alternativas en tampón acuoso: los compuestos se dispensarán bien siempre que estén completamente disueltos y formateados en placas compatibles con el robot dispensador de líquidos.
Para los proyectos en los que no es posible encontrar un disolvente orgánico apropiado que solubilice la biblioteca y sea tolerado por el sistema cristalino, un procedimiento alternativo es utilizar compuestos secos como se establece en BESSY55.
En la comunidad, existe una pregunta de larga data sobre la capacidad de remojar compuestos en cristales cultivados en condiciones de cristalización que contienen altas concentraciones de sal. Prácticamente, se observa una mayor precipitación de los compuestos y una rápida formación de cristales de sal en la etapa de recolección, que se reduce mediante la aplicación de un ambiente húmedo alrededor del área de recolección. En general, las campañas de cribado en sistemas cristalinos de condiciones de alta cristalización salina dan una tasa de aciertos comparable a la de condiciones de baja salinidad.
Las etapas iniciales del proceso XChem (pruebas de tolerancia a disolventes y pre-selección) son experimentos relativamente pequeños y rápidos, pero permiten una decisión clara de ir o no ir para el proyecto. Lo más doloroso es que será necesario encontrar sistemas de cristal alternativos si no se tolera ninguno de los dos disolventes, o si la preselección da como resultado una tasa de aciertos muy baja. Por el contrario, si tienen éxito, los resultados informan directamente la condición de remojo que se utilizará para el experimento de detección y la mejor estrategia para la recopilación de datos. Dado que la calidad de los datos, especialmente la resolución, afectará a la calidad de la densidad de electrones para la identificación y el análisis de los resultados, el objetivo es remojar a la concentración de compuestos más alta posible que no tenga un efecto perjudicial sobre la calidad de la difracción (con la mayoría de los conjuntos de datos (~80%) difractando a una resolución de 2,8 Å o mejor).
El proceso de análisis de datos se agiliza dentro de XChemExplorer, que se basa en el software PanDDA para la detección de aglutinantes débiles y permite a los usuarios visualizar y revisar rápidamente los resultados de la campaña de detección. XChemExplorer importa los resultados del procesamiento de datos de los paquetes disponibles en Diamond (DIALS16, autoPROC30, STARANISO31 y Xia214) con límites de resolución determinados por el método estándar para cada paquete (es decir, CC1/2 = 0,3). De forma predeterminada, la selección del conjunto de datos se basa en una puntuación calculada a partir de I/sigI, completitud y una serie de reflexiones únicas, pero se pueden seleccionar resultados de procesamiento específicos para su uso tanto globalmente como para muestras individuales25. Los datos también se excluyen del análisis de PanDDA en función de criterios que incluyen la resolución, laR libre y la diferencia en el volumen de celda unitaria entre los datos de referencia y los de destino (los valores predeterminados son 3,5 Å, 0,4 y 12% respectivamente), de modo que los cristales mal difractados, mal centrados o mal indexados no afectan al análisis.
El algoritmo PanDDA aprovecha el número sustancial de conjuntos de datos recopilados durante una campaña de fragmentos para detectar ligandos de ocupación parcial que no son visibles en los mapas cristalográficos estándar. Inicialmente, PanDDA utiliza los datos recopilados durante las pruebas de tolerancia al solvente y los pasos previos a la selección para preparar un mapa de densidad promedio que luego se utiliza para crear un modelo de estado fundamental. Dado que este modelo se utilizará para todos los pasos de análisis posteriores, es vital que represente con precisión la proteína no ligada en las condiciones utilizadas para el cribado de fragmentos. A continuación, PanDDA utiliza un análisis estadístico para identificar los ligandos unidos, generando un mapa de eventos para el estado unido del cristal. Se genera un mapa de eventos restando la fracción no unida del cristal del conjunto de datos de ocupación parcial y presenta lo que se observaría si el ligando estuviera unido a plena ocupación. Incluso los fragmentos que aparecen claros en los mapas convencionales de 2mFo-DF c pueden ser erróneos si no se consultan los mapas de eventos32. Si bien PanDDA es un método poderoso para identificar conjuntos de datos que difieren de los mapas promedio (que generalmente es indicativo de la unión de fragmentos) y se proporcionan métricas como RSCC, RSZD, relación de factor B y RMSD durante el refinamiento para el beneficio del usuario, el usuario es responsable en última instancia de decidir si la densidad observada representa con precisión el ligando esperado y la conformación más adecuada.
Tras el análisis y el refinamiento de los datos, es posible que todos los usuarios depositen simultáneamente varias estructuras en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) utilizando XChemExplorer. Para cada fragmento-pantalla, se realizan dos deposiciones grupales. La primera deposición contiene todos los modelos enlazados a fragmentos, con coeficientes para calcular mapas de eventos PanDDA incluidos en archivos MMCIF. La segunda deposición proporciona el modelo de estado fundamental que lo acompaña, junto con los factores de estructura medidos de todos los conjuntos de datos del experimento: estos datos se pueden utilizar para reproducir el análisis PanDDA y para desarrollar algoritmos futuros. En cuanto a las estructuras de los hits, cuando la ocupación de fragmentos es baja, el refinamiento se comporta mejor si los modelos son un compuesto de las estructuras de estado fundamental unidas al ligando y confusas32; Sin embargo, la práctica es depositar solo las fracciones de estado ligado, ya que los modelos compuestos completos son en general complejos y difíciles de interpretar. Como resultado, algunos indicadores de calidad recalculados por el AP (en particular, R/Rfree) a veces son ligeramente elevados. También es posible proporcionar todos los datos en bruto utilizando plataformas como Zenodo56, aunque actualmente no es compatible con el pipeline XChem.
En general, desde su funcionamiento en 2016, se han podido identificar ligandos fragmentados en más del 95% de las dianas mediante este procedimiento. La experiencia de los muchos proyectos que XChem ha apoyado se destiló en las mejores prácticas para la preparación de cristales33, mientras que se desarrolló una biblioteca de fragmentos que implementó el concepto equilibrado para ayudar a la progresión de fragmentos29, lo que también ayudó a establecer la práctica de hacer pública la composición de la biblioteca. La plataforma ha demostrado la importancia de una infraestructura bien mantenida y procesos documentados, que se detallan aquí, y ha permitido evaluar otras bibliotecas de fragmentos 57,58, comparar bibliotecas48 e informar el diseño de la biblioteca colaborativa EUOpenscreen-DRIVE 59,60.

El descubrimiento de fármacos basado en fragmentos (FBDD, por sus siglas en inglés) es una estrategia ampliamente utilizada para el descubrimiento de plomo, y desde su aparición hace 25 años, ha entregado cuatro fármacos para uso clínico y más de 40 moléculas han avanzado a ensayos clínicos 1,2,3. Los fragmentos son pequeñas entidades químicas, generalmente con un peso molecular de 300 Da o menos. Se seleccionan por su baja complejidad química, lo que proporciona buenos puntos de partida para el desarrollo de inhibidores altamente eficientes en ligandos con excelentes propiedades fisicoquímicas. Su tamaño significa que muestrean el paisaje de unión de las proteínas más a fondo que las bibliotecas de compuestos más grandes similares a los fármacos o al plomo y, por lo tanto, también revelan puntos calientes y sitios alostéricos putativos. Combinados con información estructural, los fragmentos proporcionan un mapa detallado de las posibles interacciones moleculares entre la proteína y el ligando. Sin embargo, la detección y validación fiables de estas entidades, que tienden a unirse débilmente a la proteína diana, requiere una serie de métodos de cribado biofísico robustos y sensibles, como la resonancia de plasmón de superficie (SPR), la resonancia magnética nuclear (RMN) o la calorimetría de titulación isotérmica (ITC)4,5.
La cristalografía de rayos X es una parte esencial del conjunto de herramientas FBDD: es lo suficientemente sensible como para identificar aglutinantes débiles y proporciona directamente información estructural sobre las interacciones a nivel molecular. Es complementario a otros cribados biofísicos y, por lo general, es esencial para progresar los golpes de fragmentos a compuestos principales; requiere sistemas cristalinos de alta calidad, lo que significa que la cristalización es altamente reproducible, y los cristales idealmente se difractan a una resolución superior a 2,8 Å.
Históricamente, ha sido muy difícil utilizar la cristalografía como cribado de fragmentos primarios 6,7,8, ya sea en el ámbito académico o en la industria. Por el contrario, los sincrotrones lograron mejoras de orden de magnitud en robótica, automatización 9,10,11 y tecnología de detectores 12,13, y combinados con una potencia de cálculo igualmente acelerada y algoritmos de procesamiento de datos14,15,16, los conjuntos de datos de difracción completos se pueden medir en segundos y un gran número de ellos completamente desatendidos, como se inició en LillyCAT7 y más tarde MASSIF17,18 (Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF)). Esto llevó a los sincrotrones a desarrollar plataformas altamente optimizadas para hacer que el cribado de fragmentos basado en cristales como pantalla principal fuera accesible para una amplia comunidad de usuarios (XChem en Diamond; CrystalDirect en EMBL/ESRF19; BESSY en el Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax en MaxIV21).
Este artículo documenta los protocolos que constituyen la plataforma XChem para el cribado de fragmentos mediante cristalografía de rayos X, desde la preparación de la muestra hasta los resultados estructurales finales de los resultados de los resultados modelados en 3D. La tubería (Figura 1) requirió el desarrollo de nuevos enfoques para la identificación de cristales 22, el remojo 23 y la recolección 24, así como un software de gestión de datos25 y un enfoque algorítmico para identificar fragmentos 26 que ahora se usa ampliamente en la comunidad. La tecnología de recolección de cristales ahora es vendida por un proveedor (ver Tabla de Materiales), y la disponibilidad abierta de las herramientas ha permitido que otros sincrotrones las adapten para establecer plataformas equivalentes21. Los proyectos en curso abordan el análisis de datos, la finalización de modelos y la difusión de datos a través de la plataforma Fragalysis27. El laboratorio de preparación de muestras se encuentra junto a la línea de luz I04-1, lo que simplifica la logística de transferir cientos de muestras congeladas a la línea de luz y el tiempo de haz dedicado en I04-1 permite una rápida retroalimentación de rayos X para guiar la campaña.
XChem es una parte integral del programa de usuarios de Diamond, con dos llamadas al año (principios de abril y octubre). El proceso de revisión por pares se ha perfeccionado en consulta con expertos en el descubrimiento de fármacos del mundo académico y la industria. Junto con un caso científico sólido, el proceso de propuesta28 requiere que los solicitantes autoevalúen no solo la preparación del sistema cristalino, sino también su experiencia en métodos bioquímicos y biofísicos ortogonales y su capacidad para avanzar en los resultados de detección a través de la química de seguimiento. Los modos de acceso también han evolucionado para dar cabida a la comunidad multidisciplinaria de usuarios:
El nivel 1 (proyecto único ) es para proyectos en fase exploratoria y no es necesario que existan herramientas de validación de resultados positivos (herramientas biofísicas o bioquímicas) ni estrategias de seguimiento. Si se acepta, al proyecto se le concede un número reducido de turnos de tiempo de haz, suficiente para la prueba de concepto.
El Nivel 2 (proyecto único) es para proyectos bien validados y requiere que se implementen herramientas posteriores y estrategias de seguimiento. Si se acepta, al proyecto se le asigna suficiente tiempo de haz para una campaña completa de cribado de fragmentos. Los proyectos individuales (Nivel 1 o Nivel 2) deben completarse dentro de los 6 meses del período de asignación (ya sea de abril a septiembre o de octubre a marzo).
El Grupo de Asignación de Bloques ( BAG, por sus siglas en inglés) es para un consorcio de grupos y proyectos, en el que existe un sólido proceso de selección y priorización de objetivos dentro del BAG, junto con una línea de seguimiento clara. Los BAG deben tener al menos un experto (superusuario) totalmente capacitado en XChem, que coordine sus actividades con el personal de Diamond y capacite a los miembros del BAG. El número asignado de desplazamientos de tiempo de haz se define por el número de proyectos científicamente sólidos en el BAG y se reevalúa por período de asignación sobre la base del informe del BAG. El acceso está disponible durante 2 años.
El experimento XChem se divide en tres etapas, con un punto de decisión para cada una de ellas: prueba de tolerancia a disolventes, preselección y pantalla principal (Figura 2). La prueba de tolerancia al disolvente ayuda a definir los parámetros de remojo, la cantidad de disolvente (DMSO, etilenglicol u otros crioprotectores si es necesario) que el sistema de cristal puede tolerar y durante cuánto tiempo. Las concentraciones de disolventes suelen oscilar entre el 5% y el 30% en al menos dos puntos temporales. Los datos de difracción se recopilan y se comparan con la difracción base del sistema cristalino; Esto determinará los parámetros de remojo para la siguiente etapa. Para la pre-selección, se empapan entre 100 y 150 compuestos utilizando las condiciones determinadas en la prueba de disolvente, y su propósito es confirmar que los cristales pueden tolerar los compuestos en esas condiciones. Si es necesario, el crioprotector se añade posteriormente a las gotas que ya contienen los fragmentos. Los criterios de éxito son que el 80% o más de los cristales sobrevivan lo suficientemente bien como para producir datos de difracción de buena y consistente calidad; Si esto falla, las condiciones de remojo generalmente se revisan alterando el tiempo de remojo o la concentración de solvente. Tras un pre-screening exitoso, el resto de los compuestos elegidos para el experimento pueden ser configurados utilizando los parámetros finales.
La biblioteca preparada para DSI (ver Tabla de Materiales) fue diseñada a propósito para permitir una rápida progresión de seguimiento utilizando la química equilibrada29 y ha sido la biblioteca de caballo de batalla de la instalación. Está disponible para los usuarios en una concentración de 500 mM en DMSO. Los usuarios académicos también pueden acceder a otras bibliotecas proporcionadas por colaboradores (más de 2.000 compuestos en total) en concentraciones de 100-500 mM en DMSO (se puede encontrar una lista completa en el sitio web28). Gran parte de la colección general también está disponible en etilenglicol, para sistemas cristalinos que no toleran el DMSO. Los usuarios también pueden traer sus propias bibliotecas, siempre que estén en placas compatibles con el sistema acústico de manejo de líquidos (ver Tabla de Materiales).
Para los tres pasos del experimento (caracterización del disolvente, preselección o cribado completo), los siguientes procedimientos de preparación de la muestra son idénticos (Figura 3): selección del lugar de dispensación del compuesto a través de la obtención de imágenes y la orientación de las gotas de cristalización con TeXRank22; dispensación en gotas utilizando el sistema acústico de dispensación de líquidos tanto para disolventes como para compuestos23; recolección eficiente de los cristales utilizando el Crystal shifter24; y la carga de la información de la muestra en la base de datos de la línea de luz (ISPyB). La interfaz actual para el diseño y ejecución de experimentos es una aplicación basada en Excel (SoakDB), que genera los archivos de entrada necesarios para los diferentes equipos de la plataforma, y rastrea y registra todos los resultados en una base de datos SQLite. Los escáneres de códigos de barras se utilizan en varias etapas a lo largo del proceso para ayudar a rastrear las muestras y estos datos se agregan a la base de datos.
Los datos de difracción se recogen en modo desatendido utilizando un tiempo de haz dedicado en la línea de luz I04-1. Hay dos modos de centrado disponibles, a saber, óptico y basado en rayos X17. Para los cristales en forma de aguja y varilla, se recomienda el centrado de rayos X, mientras que los cristales más gruesos generalmente admiten el modo óptico, que es más rápido y, por lo tanto, permite recolectar más muestras en el tiempo de haz asignado. Dependiendo de la resolución de los cristales (establecida antes de entrar en la plataforma) la recogida de datos puede ser de 60 s o 15 s de exposición total. La recopilación de datos durante la etapa de prueba de solvente generalmente informa qué combinación funcionará mejor con el rendimiento de la línea de luz I04-1.
El gran volumen de análisis de datos se gestiona a través de XChemExplorer (XCE)25, que también se puede utilizar para iniciar el paso de identificación de visitas utilizando PanDDA26. XCE es una herramienta de gestión de datos y flujo de trabajo que admite el análisis a gran escala de estructuras proteína-ligando (Figura 4); lee cualquiera de los resultados de procesamiento automático de los datos recopilados en Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 y STARANISO31) y selecciona automáticamente uno de los resultados en función de la calidad de los datos y la similitud con un modelo de referencia. Es importante que el modelo sea representativo del sistema cristalino utilizado para el cribado XChem y debe incluir todas las aguas u otras moléculas de disolvente, así como todos los cofactores, ligandos y conformaciones alternativas visibles en cristales empapados únicamente con disolvente. La calidad de este modelo de referencia tendrá un impacto directo en la cantidad de trabajo requerido durante la etapa de construcción y refinamiento del modelo. PanDDA se utiliza para analizar todos los datos e identificar los sitios de unión. Alinea las estructuras con una estructura de referencia, calcula los mapas estadísticos, identifica eventos y calcula mapas de eventos26,32. En el paradigma PanDDA, no es necesario ni deseable construir el modelo cristalográfico completo; Lo que se debe modelar es solo la vista de la proteína donde se une un fragmento (el modelo de estado ligado), por lo que el enfoque debe estar solo en la construcción del ligando y los residuos circundantes/moléculas de solvente de acuerdo con el mapa de eventos32.

<table><tbody><tr><td>Biblioteca preparada para DSI</td><td>Enamine</td><td>Biblioteca de fragmentos DSI-896</td><td></td></tr><tr><td>Series Echo 550 y 650</td><td>Sistema de dosificación acústica</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas Echo</td><td>Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>Microplacas de 1536 pocillos y 384 pocillos</td></tr><tr><td>Shifter</td> Dispositivo de <td>recolección</td>Oxford <td>Lab Technology</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca centrífuga con rotor basculante</td><td>Sigma</td><td>modelo 11121</td><td>centrífuga de microplacas</td></tr><tr><td>Placas de cristalización de 3 gotas</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>Placas de cristalización</td></tr><tr><td>Formulatrix Imager de placas y software Rockmaker</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Dispositivo de imagen de placas de cristalización</td></tr></tbody></table>

lograr un cribado eficiente de fragmentos en las instalaciones de xchem en diamond light source

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

En el descubrimiento de fármacos basados en fragmentos, cientos o, a menudo, miles de compuestos de menos de ~300 Da se prueban contra la proteína de interés para identificar entidades químicas que puedan convertirse en potentes candidatos a fármacos. Dado que los compuestos son pequeños, las interacciones son débiles y, por lo tanto, el método de cribado debe ser muy sensible; Además, la información estructural tiende a ser crucial para elaborar estos golpes en compuestos similares al plomo. Por lo tanto, la cristalografía de proteínas siempre ha sido una técnica de referencia, pero históricamente ha sido demasiado difícil para encontrar un uso generalizado como cribado primario.
Los experimentos iniciales de XChem se demostraron en 2014 y luego se probaron con colaboradores académicos e industriales para validar el proceso. Desde entonces, un gran esfuerzo de investigación y un tiempo de haz significativo han simplificado la preparación de muestras, desarrollado una biblioteca de fragmentos con posibilidades de seguimiento rápido, automatizado y mejorado la capacidad de la línea de luz I04-1 para la recopilación de datos desatendidos, e implementado nuevas herramientas para la gestión de datos, el análisis y la identificación de impactos.
XChem es ahora una instalación para el cribado de fragmentos cristalográficos a gran escala, que apoya todo el proceso de deposición de cristales y es accesible para usuarios académicos e industriales de todo el mundo. El programa de usuarios académicos revisados por pares se ha desarrollado activamente desde 2016, para dar cabida a proyectos de un alcance científico lo más amplio posible, incluidos proyectos bien validados y exploratorios. El acceso académico se asigna a través de convocatorias semestrales para propuestas revisadas por pares, y el trabajo propio es organizado por el grupo de Enlace Industrial de Diamond. Este flujo de trabajo ya se ha aplicado de forma rutinaria a más de cien dianas de diversas áreas terapéuticas, e identifica eficazmente los aglutinantes débiles (tasa de aciertos del 1 % al 30 %), que sirven como puntos de partida de alta calidad para el diseño de compuestos y proporcionan una amplia información estructural sobre los sitios de unión. La resiliencia del proceso quedó demostrada por la detección continua de los objetivos del SARS-CoV-2 durante la pandemia de COVID-19, incluido un tiempo de respuesta de 3 semanas para la proteasa principal.

La línea XChem para el cribado de fragmentos mediante cristalografía de rayos X se ha simplificado ampliamente, lo que ha permitido su adopción por parte de la comunidad científica (Figura 5). Este proceso ha sido validado en más de 150 campañas de cribado con una tasa de aciertos que varía entre el 1% y el 30G,48,49,50,51,52 y por muchos usuarios habituales. Los sistemas de cristal que no son adecuados (baja resolución, inconsistentes en la cristalización o en la calidad de la difracción) o que no pueden tolerar el DMSO o el etilenglicol se eliminan al principio del proceso, ahorrando tiempo, esfuerzo y recursos. Las campañas exitosas proporcionan un mapa tridimensional de los posibles sitios de interacción en la proteína diana; un resultado típico es el cribado XChem de la proteasa principal del SARS-CoV-2 (Figura 6). Típicamente, los resultados de los fragmentos se encuentran en: (a) sitios de interés conocidos, como sitios activos enzimáticos y subbolsas48; b) sitios alostéricos putativos, por ejemplo, en las interacciones proteína-proteína53; (c) interfaces de empaquetamiento de cristal, generalmente consideradas como falsos positivos (Figura 6). Estos datos estructurales generalmente proporcionan una base para fusionar, unir o hacer crecer fragmentos en pequeñas moléculas similares al plomo 1,3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg"> Figura 1: La canalización de XChem. La plataforma se representa esquemáticamente desde la propuesta del proyecto hasta la preparación de muestras, la recopilación de datos y la identificación de impactos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg"> Figura 2: Estrategia de cribado. El flujo de trabajo indica el propósito de cada hito, los requisitos del experimento y los puntos de decisión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg"> Figura 3: Flujo de trabajo de preparación de muestras. Los pasos críticos para la preparación de la muestra se representan con información de cada paso que se registra en una base de datos SQLite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg"> Figura 4: Análisis de datos con XCE. Los pasos críticos en el análisis de datos están representados por un diagrama de flujo de trabajo con los paquetes de software relevantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg"> Figura 5: Evolución del programa de usuarios de XChem: El gráfico muestra la adopción y consolidación del programa de usuarios desde 2015 hasta 2019 con la creación de BAG en 2019 y la resiliencia de la plataforma durante la pandemia de COVID-19 en 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos de la pantalla de fragmentos XChem. El dímero de la proteasa principal del SARS-CoV2 (Mpro) se representa en la superficie con los impactos del sitio activo que se muestran en amarillo, los golpes alostéricos putativos que se muestran en magenta y los artefactos de superficie/empaque de cristales que se muestran en verde. La figura se realizó utilizando las entradas de Chimera y Mpro PDB de la deposición grupal G_1002156. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este artículo describe el proceso completo de XChem para el cribado de fragmentos basados en cristales, desde la solicitud de acceso y todos los pasos posteriores hasta la difusión de los datos.

Lograr un cribado eficiente de fragmentos en las instalaciones de XChem en Diamond Light Source

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

La instalación XChem en Diamond Light Source proporciona un cribado rutinario de fragmentos gráficos de cristal a gran escala, lo que respalda todo el proceso de deposición del cristal. La cristalografía de rayos X es una parte esencial del conjunto de herramientas FBDD. Es lo suficientemente sensible como para identificar aglutinantes débiles y proporciona directamente información estructural sobre las interacciones a nivel molecular.El descubrimiento de fármacos basado en fragmentos es una estrategia ampliamente utilizada para el descubrimiento de plomo. Ha entregado seis medicamentos para uso clínico y más de 50 moléculas han avanzado a ensayos clínicos. El impacto de los avances y la eficiencia proporcionados por la plataforma XChem sobre los métodos tradicionales de remojo, la recopilación de datos y los métodos de análisis se demuestra mejor visualmente.Comience eligiendo los cristales y la ubicación del compuesto. Abra TextRank desde una PC y seleccione la bandeja de cristal, ya sea de la lista en la parte inferior derecha o escribiendo el código de barras en el cuadro en la parte superior izquierda. Seleccione el formato de imagen correcto y la vista de pozo único.Para agregar solvente o compuestos a una gota sin golpear el cristal, haga clic con el botón derecho dentro de la gota, pero lejos del cristal cuando se encuentre un cristal adecuado para un experimento mientras se mueve a través de las imágenes de la gota. Abra el software Echo y seleccione nuevo para dispensar soluciones utilizando el dispensador acústico. Elija la placa de pocillo de origen correcta y la clase de líquido.Asegúrese de seleccionar el tipo de placa correcto como placa de destino. A continuación, marque la casilla personalizada y continúe. Seleccione importar y elija el archivo por lotes correspondiente.A continuación, complete los pasos de importación según lo solicite el software. Utilice los mapas de placas para comprobar la solución que se va a dispensar y los lugares de destino. A continuación, ejecute el protocolo siguiendo las indicaciones a medida que surjan.Las soluciones de la placa fuente se dispensarán en las gotas de cristal elegidas. Guarde la placa en la incubadora durante el tiempo requerido. Para cosechar los cristales utilizando el dispositivo semiautomático de recolección de cristales, presione el botón de inicio del flujo de trabajo para pasar a la primera posición de pozo seleccionada.Si el cristal ha sobrevivido, móntelo en el bucle y sumérjalo en el nitrógeno líquido, colocándolo en la posición uno en el primer disco de la lista. Seleccione la descripción apropiada para el cristal en la interfaz. Si la gota es un remojo compuesto, registre la descripción del estado compuesto.Si el cristal se ha montado correctamente, seleccione montado, de lo contrario, seleccione fallar. Una vez que se hayan cosechado los cristales, lleve los discos al escáner de código de barras y colóquelos en el soporte uno a la vez para escanear los códigos de barras del disco y el pin. Una vez que se complete el escaneo, coloque las tapas en los discos y guárdelos en un depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido.Para recopilar las muestras descentradas, observe la vista del cambiador de muestras en ISPyB y seleccione clasificar por resolución AP para clasificar las muestras por resolución procesada automáticamente en una graduación de color de verde a rojo. Haga clic en las muestras para comprobar si hay muestras rojas o amarillas. A continuación, compruebe las instantáneas del cristal para ver si el cristal se ha centrado.Para recuperar y analizar los resultados del procesamiento automático de Diamond a través de XChem Explorer o XCE, en un terminal vaya a la subcarpeta de procesamiento y use el alias XCE para abrir XChem Explorer. Seleccione el botón Actualizar tablas de la fuente de datos en la pestaña de información general para actualizar el resumen de los datos experimentales. En la pestaña de configuración, seleccione el directorio de recopilación de datos y abra la pestaña de conjuntos de datos.Elija el destino en el menú desplegable Seleccionar destino, seleccione Obtener nuevos resultados del procesamiento automático en el menú desplegable Conjuntos de datos y haga clic en Ejecutar. Para calcular los mapas iniciales con Dimple, abra la pestaña de mapas, elija el modelo de referencia en el menú desplegable y seleccione los datasets deseados y, a continuación, ejecute Dimple en los archivos MTZ seleccionados. Para generar restricciones de ligandos, seleccione los conjuntos de datos deseados y, a continuación, cree un archivo SCF, PDB o PNG de los compuestos seleccionados en el menú desplegable de mapas y restricciones.Para identificar los hits con Panda, seleccione la pestaña Pandas, asegúrese de que el directorio de salida esté definido correctamente y ejecute panda. Analizar desde el menú desplegable de identificación de visitas. Para analizar los resultados identificados por Panda, ejecute panda.Inspeccionar en el menú desplegable Identificación de visita. Para abrir Coot con el panel de control de Panda. Cargue mapas de promedio y 2mFo-DFc de Dimple para compararlos con el mapa de eventos y el modelo.Una vez que se haya instalado un ligando, haga clic en fusionar ligando con el modelo y guarde el modelo antes de navegar a otro evento para evitar perder cualquier cambio en el modelo de estado ligado. Anote el evento de enlace mediante el campo de comentario de evento y anote los sitios de enlace mediante la información del sitio de registro. Una vez que todos los ligandos viables se hayan modelado, fusionado y guardado en función del mapa de eventos, cierre panda.inspect.Exporte los modelos de inspección de Panda de nuevo al directorio del proyecto e inicie una ronda inicial de refinamiento para los conjuntos de datos seleccionados, y el refinamiento ahora será visible en la pestaña de refinamiento. La línea XChem para el cribado de fragmentos mediante cristalografía de rayos X se ha simplificado ampliamente, lo que ha permitido su adopción por parte de la comunidad científica. Este gráfico demuestra la aceptación y consolidación del programa de usuarios desde 2015 hasta 2019 con la creación de grupos de asignación de bloques en 2019 y la resiliencia de la plataforma durante la pandemia de COVID-19 en 2020.Las campañas exitosas producen un mapa tridimensional de los posibles sitios de interacción en la proteína diana. Un resultado típico es el cribado XChem de la proteasa principal del SARS-CoV-2. Los sitios de interés conocidos, como los sitios activos de enzimas y las subbolsas, se muestran en amarillo.Los sitios alostéricos putativos, como los involucrados en las interacciones proteína-proteína, se muestran en magenta y las interfaces de empaquetamiento de cristales, generalmente consideradas falsos positivos, se muestran en verde. Históricamente, el uso de la cristalografía como cribado de fragmentos primarios ha sido difícil. Este estudio documentó los protocolos de la tubería XChem desde la preparación de la muestra hasta las estructuras finales.El cribado cristalográfico de fragmentos complementa otras técnicas biofísicas y, por lo general, es esencial para progresar los golpes de fragmentos a compuestos de plomo. Se puede aplicar a cualquier clase de diana de descubrimiento de fármacos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

En este informe, se describen los procedimientos detallados para llevar a cabo experimentos de difracción de rayos X de cristal individuales con una celda de yunque de diamante en la línea de luz GSECARS 13-BM-C en la Fuente Avanzada de Fotones. Atrex programas y RSV se utilizan para analizar los datos.

Alta Presión cristal único Difracción en PX ^ 2

Se presenta un protocolo optimizado para realizar una amplia caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión a sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae .

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Se describe una configuración de línea para llevar a cabo rápida radiografía bidimensional fluorescencia rayos x microdiffraction la cartografía y de muestras unitarias de cristal o polvo con Laue (policromático radiación) o difracción de polvo (radiación monocromática). Los mapas resultantes dan información sobre tensión, orientación, distribución de fases y deformación plástica.

Rayos x de sincrotrón Microdiffraction y proyección de imagen de fluorescencia de las muestras de rocas y minerales

Aquí, se describe cómo utilizar la selección automática y opciones de recopilación de datos disponibles en algunos beamlines del sincrotrón. Los científicos enviaran muestras de cryocooled el sincrotrón, las propiedades de difracción son evaluadas, los conjuntos de datos son recogidos y procesados y, cuando sea posible, una solución de la estructura se lleva a cabo, todo ello sin intervención humana.

Caracterización totalmente autónoma y colección de datos de cristales de macromoléculas biológicas

Presentamos una guía completa para la preparación de muestras de objetivos fijos, la recopilación de datos y el procesamiento de datos para la cristalografía de sincrotrón en serie en Diamond beamline I24.

Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source

El cribado de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin se realiza utilizando un flujo de trabajo con bibliotecas de compuestos dedicadas, herramientas de manejo de cristales, instalaciones de recopilación de datos rápidas y análisis de datos en gran parte automatizado. El protocolo presentado tiene la intención de maximizar la salida de tales experimentos para proporcionar puntos de partida prometedores para el diseño de ligandos basados en la estructura aguas abajo.

Flujo de trabajo y herramientas para la detección de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin

La relación señal-ruido de los datos es una de las consideraciones más importantes para realizar mediciones de difracción de rayos X a partir de microcristales. La línea de haz VMXm proporciona un entorno de bajo ruido y microhaces para tales experimentos. Aquí, describimos los métodos de preparación de muestras para montar y enfriar microcristales para VMXm y otras líneas de haz de cristalografía macromolecular de microenfoque.

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación de muestras criogénicas y la transferencia de cristales a la estación final de vacío en la línea de haz I23 en Diamond Light Source, para experimentos de cristalografía de rayos X macromoleculares de longitud de onda larga.

Protocolo de preparación y transferencia de muestras para cristalografía de longitud de onda larga en vacío en Beamline I23 en Diamond Light Source

El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.

Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos

Aquí, describimos cómo utilizar las tuberías automatizadas de cristalografía macromolecular para el análisis rápido de complejos de ligando-proteína y proteína de proteína a proteína y el cribado de fragmentos a gran escala basado en la tecnología CrystalDirect en el Laboratorio HTX en EMBL Grenoble.

Las tuberías de cristalografía automatizadas en las instalaciones de EMBL HTX en Grenoble

Presentamos un protocolo para la cristalización de proteínas utilizando la instalación de cristalización en el Complejo de Investigación en Harwell y la posterior recopilación de datos cristalográficos de rayos X in situ de cristales dentro de las placas en la línea de luz de Cristalografía Macromolecular Versátil in situ (VMXi) de Diamond. Describimos los requisitos de la muestra, los protocolos de cristalización y las pautas de recopilación de datos.

Cristalización y recopilación de datos a temperatura ambiente in situ utilizando la instalación de cristalización en Harwell y Beamline VMXi, fuente de luz de diamante

Aprende el proceso XChem para cribado de fragmentos basado en cristalografía de rayos X en Diamond Light Source. Este método optimiza el descubrimiento de fármacos al identificar unidores débiles y sitios de interacción proteicos.

Lograr un cribado eficiente de fragmentos en las instalaciones de XChem en Diamond Light Source

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