Name: Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprende a aislar células de válvula aórtica de ratón mediante digestión con colagenasa en dos pasos para estudiar la calcificación valvular in vitro. Este método permite investigar vías moleculares en estenosis aórtica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NOTA: Todos los procedimientos animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina Icahn en el núcleo institucional y el comité de uso de Mount Sinai.
1. Preparación antes del aislamiento de células valvulares de ratones adultos
<ol><li>Limpiar y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos mostrados en la Figura 1A utilizando etanol al 70% v/v y posteriormente autoclavándolos durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Preparar una alícuota de 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga las soluciones en el hielo.</li>
	<li>Prepare soluciones de colagenasa de 1 mg/mL y 4,5 mg/mL, y use 5 mL de cada solución en tubos de 15 mL para realizar todo el procedimiento. Para preparar 5 mL de 1 mg/mL de colagenasa, mezcle 5 mg de colagenasa con 2,5 mL de Medio Águila Modificado de Dulbecco (DMEM, suero fetal bovino (FBS)-libre) y 2,5 mL de 10 mM HEPES suplementado con antibióticos (1% penicilina-estreptomicina de la etapa 1.2). Filtre las soluciones a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier contaminación. NOTA: Mantenga las soluciones en hielo para proteger las enzimas.</li>
	<li>Caliente la solución DMEM a 37 °C antes de su uso en todos los pasos descritos a continuación. Prepare el medio completo complementando DMEM con 1% penicilina-estreptomicina, 1% piruvato de sodio, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reactivo de eliminación de micoplasma (ver la Tabla de Materiales),y 10% FBS.</li>
</ol>2. Aislamiento de las células valvulares
<ol><li>Para obtener 106 células para el experimento, utilice cinco ratones de 8 semanas de edad (mínimo de tres). Coloque el ratón en una cámara de inducción junto con un pequeño trozo de papel tisú empapado con 1 mL de isoflurano, pero no permita el contacto con el tejido. Confirmar que el animal está completamente anestesiado; compruebe si hay reflejo de pellizco en el dedo deldo deldo del ratón, y luego eutanasiar el ratón por dislocación cervical. Utilice isoflurano para aliviar cualquier dolor antes de la dislocación cervical, ya que el procedimiento descrito a continuación es terminal.</li>
	<li>Coloque el ratón en una plataforma de disección y fije las patas con cánulas para mantenerlo en su lugar. Limpie el pecho y el abdomen con etanol; abra el abdomen y el pecho con unas tijeras. Con pequeñas tijeras quirúrgicas, corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo para exsanguinar el ratón. Perfunda el corazón con 10 mL de PBS frío 1x para eliminar la sangre del corazón.</li>
	<li>Cortar el corazón, y mantener 3 mm de la aorta ascendente como se muestra en la Figura 1B. Diseccione la válvula aórtica bajo un estereomicroscopio. Cortar el corazón horizontalmente en el centro de los ventrículos (Figura 1C). Cortar el ventrículo izquierdo hacia la aorta, y diseccionar cuidadosamente la válvula aórtica (Figura 1D-F). Acomente las válvulas en un pequeño plato de cultivo de tejidos de 35 mm.</li>
	<li>Lavar las válvulas aisladas en un plato de cultivo celular de 75 mm con 5 mL de HEPES frío (10 mM) suplementado con antibióticos (1% penicilina-estreptomicina) para eliminar la sangre(Figura 2). Prepare dos tubos de 15 mL de colagenasa 1 mg/mL y 4,5 mg/mL como se describió anteriormente en el paso 1.3. NOTA: Después de la disección, manipule las válvulas aisladas en una campana de bioseguridad estéril para minimizar la contaminación.</li>
	<li>Incubar las válvulas en colagenasa tipo I (1 mg/mL) durante 30 min a 37 °C con agitación continua (Figura 2). Centrifugar el tubo durante 5 min a 150 × g,lavar el pellet una vez con 2 mL de HEPES (10 mM), y vórtice durante 30 s a alta velocidad. Vierta el contenido de este tubo en un plato de cultivo de 35 mm y transfiera cuidadosamente los fragmentos de tejido utilizando pinzas delgadas a un nuevo tubo. NOTA: En esta etapa, los VICs todavía no están disociados del tejido, y el pellet contiene pedazos de tejido. Para evitar la contaminación con células endoteliales, no centrífuga después del vórtice en el paso 2.5.</li>
	<li>Incubar el pellet en un tubo de 15 mL con 5 mL de colagenasa tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C bajo agitación continua durante 35 min. Vuelva a suspender las células con una pipeta de 1 mL para separar las células y centrífuga a 150 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 mL de DMEM completo. Centrífuga a 150 × g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso dos veces para limpiar las celdas. NOTA: El pellet todavía tendrá algunos fragmentos de tejido.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo, y platee las células en un pozo de un plato de cultivo celular de 6 pozos en una cantidad mínima de medio para facilitar su fijación al plato de cultivo. Deje las células, sin ser molestadas, en una incubadora de 37 °C con un 5% de dióxido de carbono.</li>
	<li>Después de 3 días, revise las células bajo el microscopio para verificar un buen crecimiento cerca de los restos de tejido. Una vez que 1,000 células sean visibles bajo el microscopio, retire cuidadosamente los desechos de tejido con pinzas en autoclave y cambie el medio. NOTA: La placa no debe ser perturbada; si no se observa el número requerido de células, coloque el plato de cultivo celular de nuevo en la incubadora durante otros 2 días.</li>
	<li>Cuando las células son 70% confluentes (2,5 × 105), tripsinizar y luego transferirlos a un plato de cultivo de tejidos de 75 mm.</li>
</ol>3. Análisis de la identidad celular y morfología
NOTA: La coloración de la inmunofluorescencia fue utilizada para estudiar morfología de la célula y la contaminación endotelial de la célula.
<ol><li>Limpie la campana con etanol al 70% v/v/. Coloque las tapas estériles (22 mm x 22 mm) en placas de 6 pozos. NOTA: Para esterilizar las cubiertas, lávelas con etanol al 70% y manténgalas en el capó durante la noche bajo luz ultravioleta.</li>
	<li>Semilla de 100.000 células por pozo en una placa de 6 pozos. Después de 24 h, lave las células dos veces en 1x PBS, y fijarlas en paraformadehído al 4% (PFA) durante 20 min. Lave las células de nuevo dos veces con 1x PBS. NOTA: En este punto, las células podrían mantenerse en PBS a 4 °C hasta el inicio del procedimiento de tinción.</li>
	<li>Para verificar la pureza de los VICs, utilice actina alfa-músculo liso (αSMA), vimentina y racimo de diferenciación 31 (CD31) para detectar la contaminación con VÉS.</li>
	<li>Preparar una alícuota de tampón de bloqueo mezclando 500 μL de suero normal (la misma especie que el anticuerpo secundario), 9,5 mL de 1x PBS y 30 μL de Triton X-100. Incubar las células en 2 mL del tampón bloqueador durante 1 h.</li>
	<li>Preparar el tampón de dilución de anticuerpos que contenga 30 μL de Tritón X-100, 10 mL de 1x PBS y 0,1 g de albúmina sérica bovina (BSA).</li>
	<li>Tome una caja de puntas vacía, llene la mitad de la caja con agua para crear una cámara húmeda. Cubra el soporte de la punta con un pañuelo húmedo y luego con una hoja de parafilm.</li>
	<li>Tomar 1 μL del anticuerpo primario y mezclarlo con 100 μL del tampón de dilución preparado en el paso 3.5. Coloque 50 μL del anticuerpo diluido en la parapelícula. Tome las cubiertas de los pozos, voltéelos y colótelos en la parte superior de las gotas de anticuerpos; incubar las células durante la noche con el anticuerpo.</li>
	<li>Agregue 1 mL de PBS en la placa de 6 pozos. Saque cuidadosamente el cubrebocas del parafilm, voltéalo y colóquelo en el pozo. Lave las células con una agitación suave continua durante 5 min. Sustitúyase el SBP por un SBP fresco; lave las células 3 veces.</li>
	<li>Incubar las células con el anticuerpo secundario diluido (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) durante 1 h. Añadir 1 μL del anticuerpo secundario a 500 μL del tampón de dilución del anticuerpo (preparado en el paso 3.5). Cubra la placa con papel de aluminio. Lavar las células 3 veces con 1 mL de 1x PBS con agitación continua.</li>
	<li>Monte las cubiertas con 50 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)-medio de montaje, y observe las células bajo el microscopio para analizar la morfología de las células y la contaminación por VEC.</li>
</ol>4. Ensayo de calcificación in vitro
<ol><li>Limpie la campana con etanol al 70%, caliente el medio DMEM a 37 °C.</li>
	<li>Semilla 100.000 células/condición en placas de 6 pozos en DMEM completo, y cultivo durante 24 h a 37 °C.</li>
	<li>Preparar el medio calcificante mezclando 2 mM de NaH2PO4,10-7 M de insulina y 50 μg/mL de ácido ascórbico en DMEM con FBS al 5%. Para 93 mL de DMEM, añadir 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentración final 1%), 1 mL de piruvato de sodio (100 mM), 27,5 mg de NaH2PO4, 5,8 μL de insulina y 5 mg de ácido ascórbico. NOTA: Filtre la solución con un filtro de 0,22 μm antes de su uso.</li>
	<li>Después de 24 h, substituya el medio sobrenadante por el medio calcificante. Incubar las células durante 7 días a 37 °C. En el3er día, reemplazar con medio calcificante fresco, y colocar la placa de nuevo en la incubadora para completar los 7 días de tratamiento.</li>
	<li>Después de 7 días, retire el medio y lave las células dos veces con 2 mL de 1x PBS. Incubar las células en 1 mL de ácido clorhídrico (HCl) de 0,6 N durante 24 h a 37 °C. Recoger el HCl en un tubo de 1,5 mL, y evaporarlo en un evaporador rotatorio. Vuelva a suspender el contenido de todos los tubos en 60 μL de HCl. NOTA: El procedimiento de secado es importante para concentrar la solución y tener el mismo volumen para cada condición.</li>
	<li>Use una placa de 96 pozos para medir la concentración de calcio mediante el uso del reactivo Arsenazo III, disponible en un kit listo para usar (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).</li>
	<li>Prepare una solución estándar de calcio de 10 mg/dL de concentración. Pesar 10 mg de hidróxido de calcio (Ca(OH)2)y disolver en 100 mL de agua destilada.</li>
	<li>En una placa transparente de 96 pozos, pipeta 2 μL de solución en blanco (HCl, 0,6 N), la solución estándar, la muestra por pozo (10 mg/dL) y las muestras. Realice el experimento por triplicado para verificar la variabilidad del pipeteo. Agregue 200 μL del reactivo para cada afección. NOTA: Las muestras por encima de 15 mg/dL deben diluirse 1:1 con solución salina, volver a ensayarse y el resultado debe multiplicarse por dos.</li>
	<li>Incubar la reacción durante 15 min a temperatura ambiente. NOTA: La reacción es estable durante 60 min.</li>
	<li>Lea y registre la absorbancia de la placa a 650 nm. Utilice la siguiente fórmula para calcular la cantidad de calcio en las muestras: Calcio (mg/mL) = (Absorbancia de la muestra/absorbancia de la norma) × Concentración de la norma</li>
</ol>

<ol><li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+disease+in+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li>
<li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li>
<li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+treatment+of+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li>
<li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stenosis+and+heart+failure%3A+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Failure+Review%22%5BJournal%5D)">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li>
<li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li>
<li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Healthcare+Engineering%22%5BJournal%5D)">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li>
<li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li>
<li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve+interstitial+cells%3A+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li>
<li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics%3A+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li>
<li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures%3A+Incidence%2C+sources%2C+effects%2C+detection%2C+elimination%2C+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li>
<li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification%3A+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li>
<li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA%2FROCK-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li>
<li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li>
<li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenazo+III%3A+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Chemistry+and+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li>
<li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Disease%22%5BJournal%5D)">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li>
</ol>

Este artículo presenta un protocolo detallado del aislamiento de la célula de la válvula del ratón para la cultura primaria. Tres válvulas aórticas de ratones de 8 semanas de edad se agruparon para obtener un número adecuado de células. Además, este protocolo describe la caracterización del fenotipo VIC y el ensayo de mineralización in vitro. El método fue adaptado del protocolo previamente descrito de Mathieu et al.7.
Durante el aislamiento de las vá...

La valvulidad aórtica calcificada (CAVD) es la cardiopatía valvular más prevalente en poblaciones occidentales, afectando a casi el 2,5% de los ancianos mayores de 65 años1. CAVD afecta a sobre seis millones de americanos y se asocia a los cambios en las propiedades mecánicas de los prospectos que empeoran la sangre normal fluir-a través1,2. Actualmente, no existe ningún tratamiento farmacológico para detener la progresión de la enfermedad o para activar la regresión mineral. La única terapia eficaz para tratar la CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica por cirugía o el reemplazo de la válvula aórtica transcatéter3. Por lo tanto, es imperativo investigar los mecanismos moleculares que conducen a la mineralización valvular para identificar nuevas dianas farmacológicas. De hecho, la estenosis aórtica no tratada tiene varias consecuencias adversas como la disfunción del ventrículo izquierdo y la insuficiencia cardíaca4.
La válvula aórtica consta de tres capas conocidas como fibrosa, espongiosa y ventricularis, que contienen VICs como la célula predominante tipo5. La fibrosa y la ventricularis están cubiertas por una capa de células endoteliales vasculares (BIC)5. Los VÉS regulan la permeabilidad de las células inflamatorias, así como las señales paracrinas. El aumento del estrés mecánico puede afectar la integridad de los VE Y perturbar la homeostasis de la válvula aórtica, llevando a la invasión inflamatoriacelular 6. Los análisis de microscopía electrónica de barrido mostraron endotelio interrumpido en una válvula aórtica calcificada humana7. 
Los análisis histológicos del tejido calcificado revelan la presencia de osteoblastos y de osteoclasts. Además, se observó diferenciación osteogénica de los VICs tanto in vitro como en el tejido valvular humano8. Este proceso está orquestado principalmente por el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2) y las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)8,9.

<table><tbody><tr><td>Tijera de corte de 3 mm</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa músculo liso anticuerpo de actina</td><td>abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Cell Signaling</td><td>4412</td><td></td></tr><tr><td>Arsenazo-III set de reactivos</td><td>POINT SCIENTIFIC</td><td>C7529-500</td><td>A Kit para medir la concentración de calcio</td></tr><tr><td>Tijeras Bonn</td><td>F.S.T</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de calcio</td><td>SIGMA -Aldrich 31219</td><td>31219</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Novusbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo I&nbsp; (125 unidades/mg)</td><td>Thermofisher Scientific 17018029</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Tthermofisher 11965092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza de graefe extrafina</td><td>F.S.T</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco 16000044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina</td><td>F.S.T Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solución</td><td>STEMCELLS TECNOLOGÍAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>Mycozap</td><td>Lanza</td><td>VZA-2011</td><td>Reactivo de eliminación de micoplasmas</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicilina estreptomicina 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio 100 mM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>11360070</tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>&nbsp; F.S.T</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas - Afiladas-romas</td><td>F.S.T</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.05%</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>abcam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células de la válvula intersticial de ratón para estudiar la calcificación de la válvula aórtica in vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

La calcificación de las células de la válvula aórtica es el sello de la estenosis aórtica y se asocia a fibrosis de la cúspide de la válvula. Las células intersticiales valvulares (VIC) juegan un papel importante en el proceso de calcificación en la estenosis aórtica a través de la activación de su programa de desdiferenciación a células osteoblasto-similares. Los VICs de ratón son una buena herramienta in vitro para la elucidación de las vías de señalización que impulsan la mineralización de la célula de la válvula aórtica. El método descrito aquí, utilizado con éxito por estos autores, explica cómo obtener células recién aisladas. Un procedimiento de dos pasos de la colagenasa fue realizado con 1 mg/mL y 4.5 mg/mL. El primer paso es crucial para eliminar la capa de células endoteliales y evitar cualquier contaminación. La segunda incubación de colagenasa es para facilitar la migración de los VIC del tejido a la placa. Además, un procedimiento de coloración de la inmunofluorescencia para la caracterización del fenotipo de las células aisladas de la válvula del ratón se discute. Además, el análisis de la calcificación fue realizado in vitro usando el procedimiento de la medida del reactivo del calcio y la coloración roja del alizarin. El uso del cultivo primario de células de válvulas de ratón es esencial para probar nuevas dianas farmacológicas para inhibir la mineralización celular in vitro.

Como las válvulas aórticas murinas tienen típicamente 1 mm de diámetro, se deben agrupar al menos tres válvulas para recolectar un millón de células viables para diferentes procedimientos experimentales. Los diferentes pasos del proceso de aislamiento de VIC se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Como es difícil raspar manualmente el tejido de la válvula, es preferible utilizar la tensión de cizallamiento creada por el vórtice para eliminar los VÉS. De hecho,...

Este artículo describe el aislamiento de las células de la válvula aórtica del ratón por un procedimiento de dos pasos de la colagenasa. Las células aisladas de la válvula de ratón son importantes para realizar diferentes ensayos, como este ensayo de calcificación in vitro, y para investigar las vías moleculares que conducen a la mineralización de la válvula aórtica.

Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

El uso de células aisladas de la válvula del ratón es esencial investigar el camino de la señalización que lleva a la calcificación de la válvula en el uso de células modificadas genético de ratones transgénicos. La digestión en dos pasos es un método rápido y eficiente. La parte más desafiante de este protocolo es el aislamiento de la válvula aórtica a partir de ratones de ocho semanas.Es mejor practicar en ratones mayores para visualizar mejor la válvula aórtica. Antes de comenzar el experimento, limpie y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y el espacio de trabajo con etanol al 70% y autoclave los instrumentos quirúrgicos durante 30 minutos. Cuando la configuración inicial esté lista, comience con la limpieza del pecho y la región del abdomen de un ratón eutanásico de ocho semanas de edad con etanol.Usando tijeras, abra el abdomen y el pecho del ratón, luego corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo con pequeñas tijeras quirúrgicas. Retire la sangre del corazón perfundiendo 10 mililitros de PBS frío y corte el corazón, manteniendo tres milímetros de la aorta ascendente. Debajo de un estereomicroscopio, diseccione la válvula aórtica cortando el corazón horizontalmente en el medio de los ventrículos y cortando el ventrículo izquierdo hacia la aorta, luego diseccione cuidadosamente la válvula aórtica.Aglutica las válvulas en un pequeño plato de cultivo de tejidos de 35 milímetros. Lave las válvulas aisladas en un plato de cultivo celular de 75 mililitros con cinco mililitros de HEPES frío de 10 milimolares recién preparados suplementado con antibióticos e incube en cinco mililitros de colagenasa tipo uno durante 30 minutos a 37 grados Centígrados con agitación continua. Después de la incubación, centrifugar el tubo durante cinco minutos, a 150 veces G y lavar el pellet una vez con dos mililitros de 10 milimolares HEPES con vórtice a alta velocidad durante 30 segundos.Recoja la suspensión resultante del tubo en un plato de cultivo de 35 milímetros y use pinzas delgadas para transferir cuidadosamente los fragmentos de tejido a un tubo fresco. Luego incubar el pellet en un tubo de 15 mililitros con cinco mililitros de colagenasa tipo uno a 37 grados Centígrados bajo agitación continua durante 35 minutos. Separe las células reutilizando con una pipeta de un mililitro y centrífuga a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Limpie las células dos veces reutilizando el pellet separado en dos mililitros de DMEM completo y centrifugando a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados. Para el revestimiento, resuspend el pellet en un mililitro de medio completo y añadirlo a un pozo de un plato de cultivo celular de seis pozos en una cantidad mínima de medio. Mantenga las placas sin ser molestadas a 37 grados Centígrados con un 5% de dióxido de carbono.Después de tres días de incubación, confirme el crecimiento cerca de los restos de tejido observando las células bajo el microscopio. Una vez que 1, 000 células son visibles, retire cuidadosamente los restos de tejido con pinzas en autoclave y cambie el medio. Tripsinizar las células después de alcanzar el 70% de confluencia y transferirlas a un plato de cultivo de tejido de 75 mililitros.Antes de comenzar el ensayo, limpie la campana de bioseguridad con etanol al 70% y caliente el medio DMEM a 37 grados Centígrados. A continuación, sembrar 100, 000 células por condición en seis placas de pozo en DMEM completo y cultivo a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, reemplace el medio sobrenadante con el medio calcificante e incube las células durante siete días a 37 grados Celsius, reemplazando el medio en el tercer día.Después de siete días, mida la concentración de calcio en una placa de 96 pozos utilizando el reactivo Arsenazo III y registrando la absorbancia a 650 nanómetros. En el análisis representativo, varios fenotipos de la célula de la válvula fueron identificados con la coloración inmunofluorescente después de tres a cinco días de cultura. Ratón VIC de vimentina expresada y alfa SMA, los marcadores significativos de las células valvulares.Además, la coloración inmunofluorescente CD31 no verificó ninguna contaminación de las células endoteliales en cultura de VIC. El cultivo de VIC con medio calcificante rico en fosfato estimula una calcificación en las células, confirmada aún más con la tinción positiva roja para los ganglios de calcio. El protocolo se basa en un pool de tres a cinco válvulas de diferentes ratones.El uso de pareja de camada y tres réplicas biológicas diferentes es importante para validar los hallazgos. El uso de células de válvula de ratón es vital para comprender la vía molecular que conduce a la estenosis aórtica mediante el aislamiento de células de ratones transgénicos. Este protocolo se ha utilizado previamente para investigar la implicación del camino al receptor en la regresión mineral de la válvula aórtica calcificada.

isolation-mouse-interstitial-valve-cells-to-study-calcification

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Ofrecemos un método para aislar y cultivar las poblaciones puras de células endoteliales de la válvula del corazón (VEC). VEC puede ser aislada de uno y otro lado de la cúspide o el prospecto e inmediatamente después, las células intersticiales de base (CIV) aislada es muy sencillo.

Aislamiento de células endoteliales valvular

En este video, demostramos el aislamiento de células intersticiales de la válvula aórtica del corazón de un ratón adulto utilizando un procedimiento de colagenasa de dos pasos y su posterior cultivo en un medio de crecimiento de bajo volumen.

Aislamiento de células intersticiales de válvula de ratón: un método enzimático para aislar y cultivar VICs de válvula aórtica de ratón

Este video muestra una técnica de ensayo para evaluar la calcificación de las células intersticiales de la válvula aórtica in vitro. El ensayo ayuda a cuantificar la concentración de calcio utilizando el reactivo arsenazo III, un colorante sensible al calcio que reacciona con los iones de calcio para formar un complejo de calcio-arsenazo de color púrpura.

Ensayo de calcificación para medir la concentración de calcio en las células intersticiales de la válvula aórtica

La capacidad de aislar las células endoteliales de las válvulas cardíacas (VECs) es fundamental para comprender los mecanismos de desarrollo, mantenimiento y enfermedad de las válvulas.  En este trabajo describimos el aislamiento de VECs de ratones Tie2-GFP embrionarios y adultos utilizando FACS que permitirá realizar estudios que determinen la contribución de los VECs en los procesos de desarrollo y enfermedad.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

La calcificación vascular es un importante predictor y contribuyente a la enfermedad cardiovascular humana. Este protocolo describe los métodos para inducir la calcificación de células de músculo liso vascular primario cultivadas y para cuantificar la calcificación y la carga de macrófagos en aortas animales mediante imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano.

Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación

Este protocolo describe el aislamiento, la cultura y la calcificación de las células intersticiales de rata-derivado de la válvula, un modelo altamente fisiológica en vitro de enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD). Explotación de este modelo de rata facilita investigación CAVD en la exploración de la célula y los mecanismos moleculares que subyacen a este complejo proceso patológico.

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

En este estudio, describimos el proceso de aislamiento de linfocitos T a partir de muestras frescas de válvulas aórticas calcificadas y los pasos analíticos de la clonación de células T para la caracterización de los subconjuntos de leucocitos adaptativos mediante el análisis de citometría de flujo.

Investigación de la calcificación de la válvula aórtica a través del aislamiento y cultivo de linfocitos T utilizando células alimentadoras de la capa de Buffy irradiada

Este protocolo describe la colección de válvulas aórticas humanas extraídas durante procedimientos quirúrgicos de reemplazo de válvula aórtica o de tejido cadavérico, y el posterior aislamiento, expansión y caracterización de células endoteliales e intersticiales de válvula primaria específicas del paciente. Se incluyen detalles importantes sobre los procesos necesarios para garantizar la viabilidad celular y la especificidad del fenotipo.

Aislamiento de células valvulares primarias humanas para el modelado de enfermedades in vitro

Este trabajo presenta la metodología para obtener y evaluar la calcificación vascular mediante el aislamiento de aortas murinas seguido de la extracción de vesículas extracelulares calcificadas para observar el potencial de mineralización.

Análisis de calcificación vascular mediada por vesícula extracelular utilizando modelos in vitro e in vivo

Aprende a aislar células de válvula aórtica de ratón mediante digestión con colagenasa en dos pasos para estudiar la calcificación valvular in vitro. Este método permite investigar vías moleculares en estenosis aórtica.

Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

Explorar más videos