Name: Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprende a evaluar agregados bacterianos de Pseudomonas aeruginosa en tiempo real mediante microscopía confocal y medio SCFM2. Este protocolo permite estudiar la resistencia antibiótica con alta resolución.

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S.E.D cuenta con el apoyo de fondos iniciales proporcionados por el Departamento de Medicina Molecular de la Universidad del Sur de Florida, así como una subvención de investigación CFF (DARCH19G0), el N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) y el Instituto de Microbiomas de la USF. Agradecemos al laboratorio de Whiteley por la colaboración continua que involucra conjuntos de datos relacionados con este manuscrito. Agradecemos al Dr. Charles Szekeres por facilitar la clasificación de FACS. Las figuras fueron creadas por A.D.G y S.E.D utilizando Biorender.com.

1. Preparar un medio sintético de fibrosis quística (SCFM2)
NOTA: La preparación de SCFM2 comprende tres etapas principales que se describen a continuación(Figura 2). Para más detalles y referencias, véase9,10,12.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig02.jpg"> Figura 2: Preparación e inoculación del medio SCFM2. (A) La base tamponada se prepara utilizando sales y aminoácidos enumerados en los cuadros 1 y 2. La base tamponada se puede almacenar a 4 °C durante un tiempo de hasta 30 días, pero debe protegerse de la exposición a la luz. (B) La mucina y el ADN se añaden a una alícuota de base tamponada y se disuelven en solución durante la noche a 4 °C. (C) Los lípidos y las existencias adicionales se agregan a la solución durante la noche y se incuban a 37 °C con agitación a 250 rpm durante 20 min. SFCM2 se inocula con células lavadas en fase logarítuga a un OD600 = 0,05. Abreviaturas: SCFM2 = medio sintético de esputo de fibrosis quística. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Esterilización de mucina porcina<ol>
<li>Preparar mucina estéril a una concentración final de 5 mg/ml en SCFM2. Por ejemplo, para un volumen de 5 ml de SCFM2, pese 25 mg de mucina tipo II en una placa de Petri estéril y colóquela en un esterilizador ultravioleta (UV) durante 4 h, agitando suavemente cada hora.</li>
		<li>Después de 4 h, transfiera la mucina tratada con UV a tubos de 1,7 ml en autoclave en condiciones estériles y guárdelo a -20 °C.</li>
		<li>Para confirmar la esterilización completa, disuelva una muestra de mucina en un líquido estéril, como agua o caldo Luria Bertani (LB), y observe bajo un microscopio. NOTA: La mucina esterilizada se puede almacenar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la base tamponada<ol>
<li>Preparar soluciones de caldo de sal y aminoácidos añadiendo las cantidades apropiadas en peso al agua desionizada como se indica en la Tabla 1. Esterilizar con filtro todas las soluciones de stock con un filtro de 0,22 μm, envolver en papel de aluminio para proteger de la degradación de la luz y almacenar a 4 °C durante un mes.</li>
		<li>Preparar la base tamponada combinando 190 ml de agua desionizada con soluciones de almacenamiento de aminoácidos y sal por volúmenes enumerados en la Tabla 1. Ajuste la solución a pH 6.8 y aumente a un volumen final de 250 ml. Esterilizar con filtro con un filtro de 0,22 μm y conservar a 4 °C durante un plazo de hasta 30 días.</li>
		<li>En la noche anterior al experimento, alícute la cantidad deseada de base tamponada en un matraz de cultivo de vidrio y agregue mucina (5 mg / ml como se describe en el paso 1.1.1) y ADN purificado de esperma de salmón (0.6 mg / ml). Agitar suavemente, envolver en papel de aluminio y dejar a 4 °C durante la noche para permitir que la mucina y el ADN se disuelvan en solución. NOTA: Las alícuotas de ADN de los espermatozoides de salmón deben descongelarse en hielo, vórtice y agregarse a la base tamponada y la mucina. Las soluciones de stock de triptófano, asparagina y tirosina deben prepararse en soluciones de NaOH (ver Tabla 1 para concentraciones) en lugar de agua desionizada. Mantenga la base amortiguada y todas las soluciones de stock envueltas en papel de aluminio para proteger de la exposición a la luz. La mayoría de las acciones serán estables hasta por un mes. Las existencias que se decoloran no deben usarse y deben reemplazarse antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adición de existencias suplementarias<ol>
<li>El día del experimento, agregue las acciones enumeradas en la Tabla 2 a la base amortiguada que contiene mucina y ADN. NOTA: Prepare una solución fresca de FeSO4 el día del experimento, pero todas las demás existencias se pueden hacer con anticipación y almacenarse durante 30 días a 4 ° C. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) contiene cloroformo. Manipule con precaución y no lo use cerca de llamas abiertas. Después de la adición de DOPC, incubar SCFM2 a 37 °C con agitación (250 rpm) durante al menos 20 min (para cultivo de 5 ml). Este período de incubación permite que el cloroformo en el DOPC se evapore. El matraz no debe ser hermético; en su lugar, cubra la abertura del matraz libremente con papel de aluminio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Evaluación en tiempo real de la tolerancia a los antimicrobianos en agregados bacterianos
<ol><li>Preparar cultivos nocturnos<ol>
<li>La noche anterior al experimento, inocular 5 ml de caldo LB con varias colonias de Pa PAO1-pMRP9-113 de una placa de agar LB que contiene antibiótico (carbenicilina 300 μg/mL). Cultivar durante la noche a 37 °C con agitación a 250 rpm. NOTA: Cultive cultivos durante la noche con la adición de antibióticos necesarios para la selección de plásmidos requeridos (aquí, el plásmido de expresión de proteína fluorescente verde (GFP), pMRP9-1). Tenga en cuenta que las células Pa deben lavarse antes de que se inocule SCFM2. LB puede ser sustituido por otros medios de laboratorio ricos para cultivos nocturnos. Todos los aislamientos bacterianos deben manipularse utilizando las pautas apropiadas de BSL-2 a lo largo de este protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular SCFM2<ol>
<li>El día del experimento, vuelva a diluir los cultivos nocturnos de Pa 1:10 (cultivo: medios líquidos) inoculando 500 μL en 5 ml de caldo LB fresco. Cultivar células hasta la fase logaríts (60-90 min) a 37 °C con agitación a 250 rpm.</li>
		<li>Cultivos en fase logarítuga centrífuga a 10.000 × g durante 5 min. Lave las células retirando el sobrenadante y resuspiéndolo en 3 ml de solución salina tamponada con fosfato esterilizada por filtro (PBS, pH 7.0). Repita dos veces y vuelva a gastar el pellet en un volumen final de 1 ml de PBS.</li>
		<li>Mida la absorbancia de las células lavadas utilizando un espectrofotómetro a 600 nm (OD600), y calcule el volumen de cultivo requerido para un OD600 inicial de 0.05 en 5 mL de SCFM2. Inocular Pa en el SCFM2, y vórtice suavemente para distribuir las células por todas partes. Pipetee 1 ml del SCFM2 inoculado en cada cámara de un plato óptico de 4 pozos, fondo de vidrio, e incube durante 4 h estáticamente a 37 °C. NOTA: El tiempo de duplicación de los cultivos de Pa depende de la tensión y la disponibilidad de oxígeno. En SCFM2, en las condiciones descritas aquí, el tiempo de duplicación de Pa es de ~1.4 h10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Visualización de agregados durante el tratamiento antibiótico con microscopía de barrido láser confocal (CLSM)
NOTA: Esta sección describe el uso del microscopio de barrido láser confocal y el software de captura de imágenes para la obtención de imágenes de agregados pa en SCFM2. El objetivo es observar y caracterizar la biomasa bacteriana restante (tolerante) después del tratamiento con antibióticos. Los pasos descritos se pueden realizar con éxito en otros microscopios confocales, aunque se debe hacer referencia al manual de operación del instrumento para obtener una orientación específica.
<ol><li>Cultivos de Pa de imagen utilizando una cámara calentada o una microplaca calentada instalada en el escenario del microscopio para mantener una temperatura ambiente de 37 °C. Inicie el módulo de incubación al menos 2 h antes del comienzo del experimento para permitir que todos los aparatos alcancen la temperatura deseada y reduzcan la expansión y el movimiento adicionales durante la recopilación de datos.</li>
	<li>Después de 4 h, transfiera los cultivos SCFM2 que contienen células Pa a la etapa de microscopio calentado. Designar 3 de cada 4 pozos como réplicas técnicas para el tratamiento con antibióticos, y considerar el4º pozo como un control sin tratamiento, que contiene solo células Pa en SCFM2, sin antibiótico. Identifique los agregados mediante microscopía de campo brillante dentro de la pestaña Localizar antes de cualquier excitación de los reporteros fluorescentes. Defina un área para obtener imágenes dentro de cada pozo y almacene su posición (coordenadas x-y-z) utilizando el módulo Posiciones en el software de imágenes.</li>
	<li>Utilice un objetivo de inmersión en aceite 63x para visualizar cultivos pa que contienen el plásmido de expresión GFP pMRP9-1 en SCFM2 con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 509 nm. Tome imágenes utilizando la opción z-stack dentro del módulo Adquisición a intervalos de 1 μm (total de 60 cortes). Utilice el módulo de promediado de línea para reducir la fluorescencia de fondo en el canal GFP dentro del volumen total de las imágenes z-stack de 60 μm (1.093,5 mm3). Tome imágenes de control de SCFM2 no ininoculado utilizando configuraciones idénticas para determinar la fluorescencia de fondo para el análisis de imágenes. NOTA: Las imágenes se adquieren produciendo imágenes de pila z de 8 bits de 512 píxeles x 512 píxeles (0,26 μm x 0,26 píxeles de μm) que están a 60 μm de la base de la cubierta.</li>
	<li>Utilice la opción de series temporales dentro del software de imágenes para capturar 60 cortes en cada posición (pozo) a intervalos de 15 minutos durante un período de 18 h. Utilice la estrategia de enfoque definido dentro del software para almacenar un plano focal para cada posición, que se devuelve en cada punto de tiempo a lo largo del experimento.</li>
	<li>Después de un total de 4,5 h de incubación, imagine cada posición utilizando los ajustes anteriores para determinar la biomasa agregada dentro de cada uno de los cuatro pozos antes de la adición de antibiótico.</li>
	<li>Después de 6 h de incubación total, agregue antibiótico a una concentración inhibitoria (CMI) 2 veces inferior a la mínima a cada réplica. Pipete directa y suavemente en el centro del pozo, justo debajo de la interfase aire-líquido. Mantenga todos los cultivos en la cámara confocal calentada. NOTA: Aquí, se utilizó sulfato de colistina a una concentración de 140 μg/ml.</li>
	<li>Comience el tratamiento con imágenes después de los antibióticos haciendo clic en la opción Iniciar experimento dentro del programa de imágenes. NOTA: La concentración de antibióticos utilizada depende del antibiótico, el aislado de Pa y si el usuario desea examinar los efectos de matanza o tolerancia. Este experimento utiliza una sola dosis. Se pueden agregar dosis adicionales sin interrumpir los cultivos si es necesario.</li>
</ol>4. Tinción de yoduro de propidio de agregados de Pa
NOTA: El yoduro de propidio (PI) se utiliza comúnmente como reactivo de tinción para identificar células bacterianas no viables (muertas) en cultivo. Aquí, se utiliza para identificar agregados sensibles al tratamiento antibiótico aplicado en la sección 3. A lo largo de este protocolo, la expresión y detección de GFP en células Pa se utiliza como el principal proxy para la viabilidad celular. Este paso final permite que las imágenes confocales se utilicen una vez más para identificar el posicionamiento espacial de los agregados vivos / muertos en relación entre sí. Además, los agregados se identifican como vivos/muertos para una mayor clasificación de células aguas abajo en la sección 5.
<ol><li>Después de 18 h, agregue PI a cada pozo del plato inferior óptico de cuatro cámaras que contiene cultivos SCFM2. Siga las instrucciones del fabricante para el volumen de PI y el tiempo de incubación(por ejemplo,~ 2 μL por ml de cultivo, ~ 20-30 min).</li>
</ol>5. Aislar células vivas de agregados utilizando un enfoque FACS
NOTA: FACS presenta una poderosa plataforma para clasificar y aislar grupos de células de acuerdo con un fenotipo marcado fluorescentemente. Aquí, FACS se utiliza para aislar agregados vivos (tolerantes a antibióticos) de agregados no viables.
<ol><li>Después de la tinción con yoduro de propidio, retire los cultivos de la incubación y transfiéralos a un instrumento FACS en un recipiente aislado para mantener 37 ° C.</li>
	<li>Ejecute alícuotas de 1 ml de SCFM2 que contenga agregados de Pa al caudal más bajo. NOTA: Cada alícuota contendrá ~15,000 agregados.</li>
	<li>Para detectar GFP, ilumine las células con un láser de 488 nm y registre la altura de la señal fluorescente a 530/30 nm. Visualice la tinción PI por excitación con un láser de 561 nm y registre la altura de la señal fluorescente a 610/20 nm. Realice la clasificación utilizando una boquilla de 70 u. NOTA: Los agregados ordenados se pueden agrupar de varias maneras dependiendo de la aplicación del usuario. En este caso, se utilizó FACS para clasificar agregados de Pa viables para la secuenciación de ARN aguas abajo. Las aplicaciones alternativas se discuten a continuación.</li>
</ol>6. Análisis de imágenes
NOTA: La microscopía de lapso de tiempo genera grandes cantidades de datos. Un experimento de 18 horas para la observación de agregados de Pa en SCFM2 identifica ~ 50,000 agregados a lo largo del tiempo, que tienen el potencial de caracterizarse para el volumen y el posicionamiento espacial. Utilice un software de análisis de imágenes para cuantificar la dinámica agregada en SCFM2:
<ol><li>Para estudios agregados en SCFM2, cuantificar la fluorescencia GFP de fondo mediante la creación de un histograma de recuentos en el canal GFP que se produce para SCFM2 no inoculados y SCFM2 inoculados con la cepa PaO1 portadora de pMRP9-1. Para garantizar que los vóxeles GFP detectados se correlacionen con la biomasa de Pa, defina un vóxel GFP+ como ≥1,5 veces el valor del recuento de fondo de GFP. NOTA: La fluorescencia de fondo se define como el valor de vóxel más alto de tres posiciones elegidas al azar, promediadas. Los recuentos de fondo son, como medida estándar, restados de todos los píxeles en imágenes experimentales por el software de análisis de imágenes.</li>
	<li>Después de la resta de fondo en el módulo Surpass, produzca isosuperficies para todos los vóxeles restantes.</li>
	<li>Para detectar agregados individuales, habilite la opción Dividir objetos y defina los agregados como objetos con volúmenes de ≥5 μm3. Utilice el módulo Vantage en el software de análisis de imágenes para calcular el volumen, x-y-z y la suma de vóxeles GFP para cada objeto individual. Exporte estos datos a una plataforma estadística externa. NOTA: Algunos software de análisis de imágenes permiten la exportación de múltiples phentoypes cuantitativos a la vez, lo que permite calcular las correlaciones.</li>
	<li>Filtre los datos exportados desde el módulo Vantage por tamaño para garantizar que no queden objetos de &lt;0,5μm 3 (biomasa dispersa). Para cada objeto individual dentro de la imagen, calcule la distancia desde sí mismo en relación con otros objetos (agregados) utilizando el módulo Vantage del software de análisis de imágenes o manualmente con la siguiente ecuación. d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1)</li>
	<li>Utilice los cálculos SUM y AVERAGE para encontrar la biomasa total y el volumen agregado promedio. Alternativamente, exporte datos a otras plataformas estadísticas o scripts, por ejemplo,la distribución de agregados a través de la biomasa como se discute en los resultados representativos (script no publicado en colaboración con el laboratorio Whiteley, Instituto de Tecnología de Georgia).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Este trabajo ha introducido metodologías que se pueden combinar para estudiar poblaciones agregadas bacterianas en presencia y ausencia de tratamiento antibiótico. El CLSM de alta resolución permite la visualización de los cambios en la biomasa agregada y la orientación estructural de los agregados en tiempo real cuando se exponen a antibióticos. Además, se pueden cuantificar las características físicas y estructurales de la biomasa que quedan después del tratamiento con antibióticos, con el objetivo de correlacionar est...

Pseudomonas aeruginosa (Pa) es un patógeno oportunista que establece infecciones crónicas en individuos inmunocomprometidos. Para aquellos con la enfermedad genética fibrosis quística (FQ), estas infecciones pueden abarcar el curso de toda la vida. La FQ causa la acumulación de un esputo viscoso y rico en nutrientes en las vías respiratorias, que se coloniza por una variedad de patógenos microbianos con el tiempo. Pa es uno de los patógenos de la FQ más prevalentes, colonizando las vías respiratorias en la primera infancia y estableciendo infecciones difíciles de tratar1. La PA sigue siendo un problema clínico significativo y se considera una de las principales causas de mortalidad en las personas con FQ, a pesar de la mejora de los regímenes terapéuticos en los últimos años2,3. Este fenotipo de persistencia y el aumento de la tolerancia a los antibióticos le han valido a Pa un lugar en un grupo de patógenos identificados tanto por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) como por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como prioridades de investigación para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas: los patógenos ESKAPE4.
Al igual que otros patógenos ESKAPE, la resistencia a los antibióticos adquirida es común en Pa,pero también hay muchas propiedades intrínsecas que contribuyen a la tolerancia antimicrobiana de Pa. Entre estos se encuentra la capacidad de Pa para formar agregados, grupos altamente densos de ~ 10-1,000 células, que se pueden observar en múltiples infecciones, incluido el esputo del paciente con FQ5,6. Al igual que el Pa estudiado en otros sistemas de biopelículas, los agregados de Pa muestran fenotipos clínicamente relevantes, como el aumento de la resistencia a los antibióticos y la activación de la comunicación célula-célula (detección de quórum (QS)). Por ejemplo, se ha demostrado que los agregados de Pa utilizan comportamientos regulados por QS para combatir otros microbios, así como tolerar tratamientos antimicrobianos como la producción de piocianina7. La capacidad de estudiar tales comportamientos ofrece una visión emocionante de los ecosistemas bacterianos en un entorno similar a aquel en el que existen en el cuerpo humano.
Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Gran parte de lo que se sabe sobre Pa se ha descubierto utilizando sistemas in vitro en los que las células crecen planctonicamente o en una arquitectura característica de "hongo" unida a la superficie que no se ha observado in vivo8. Si bien los modelos clásicos de crecimiento de biopelículas, como las células de flujo o el agar sólido, han producido un conocimiento extenso y valioso sobre los comportamientos bacterianos y los mecanismos de tolerancia a los antibióticos, estos hallazgos no siempre se traducen in vivo. Muchos modelos in vitro tienen una capacidad limitada para imitar el entorno de crecimiento del sitio de infección humana, lo que requiere costosos estudios in vivo. A su vez, muchos modelos in vivo carecen de la flexibilidad y resolución que ofrecen las técnicas in vitro. 
El esputo sintético de fibrosis quística (SCFM2) está diseñado para proporcionar un entorno para el crecimiento de Pa similar al experimentado durante la infección crónica en el pulmón de la FQ. SCFM2 incluye fuentes nutricionales identificadas en la sputa de FQ expectorada, además de mucina, lípidos y ADN. El crecimiento de Pa en SCFM2 requiere un conjunto de genes casi idéntico al requerido para el crecimiento en esputo real y apoya la formación natural de agregados de Pa 9,10. Después de la inoculación, las células planctónicas forman agregados que aumentan de tamaño a través de la expansión. Las células individuales (denominadas migrantes) se liberan de los agregados, migran a áreas no coloreadas y forman nuevos agregados10. Esta historia de vida se puede observar utilizando CLSM y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Los agregados de Pa formados en SCFM2 son de tamaños similares a los observados en la FQ pulmonar10. Este modelo permite la observación de múltiples agregados de tamaño variable en tiempo real y en tres dimensiones a escala de micras. La microscopía de lapso de tiempo permite el seguimiento de miles (~ 50,000) de agregados en un experimento. El uso de software de análisis de imágenes permite la cuantificación de fenotipos agregados a partir de micrografías, incluido el volumen agregado, el área de superficie y la posición en tres dimensiones hasta los 0,1 μm más cercanos, tanto a nivel de agregado individual como de población. Tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición permite la diferenciación de agregados en diferentes etapas de desarrollo con precisión, así como su respuesta a un microambiente cambiante6,11.
La aplicación de SCFM2 para estudiar agregados de Pa en ensayos de bajo volumen y alto rendimiento lo convierten en un modelo flexible y rentable. Como medio definido, SCFM2 ofrece uniformidad y reproducibilidad a través de múltiples plataformas, proporcionando un método nutricional y físicamente relevante para estudiar agregados de Pa in vitro9. Las aplicaciones incluyen su uso en combinación con CLSM para observar la organización espacial y la tolerancia a los antibióticos a alta resolución (como se describe en este documento de métodos). La capacidad de realizar experimentos que proporcionan datos en tiempo real a escala de micras permite el estudio de las interacciones intra-especie e inter-especie a medida que pueden ocurrir in vivo. Por ejemplo, SCFM2 se ha utilizado previamente para estudiar la dinámica espacial de la comunicación célula-célula en poblaciones agregadas a través de una red de sistemas utilizados por Pa para regular múltiples genes que contribuyen a la virulencia y patogénesis6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/62420fig01.jpg"> Figura 1: Representación gráfica de los principales pasos experimentales. (A) SCFM2 se inocula con células Pa y se le permite formar agregados en un plato de cultivo con fondo de vidrio. (B) Los agregados se transfieren al microscopio confocal y se agrega antibiótico. Se representan tres réplicas técnicas (cámaras 1-3) y un pozo de control (4) de SCFM2 inoculado sin tratamiento antibiótico. Los agregados se visualizan utilizando CLSM en el transcurso de 18 h. (C) Después de la imagen inicial de 18 h, los agregados se tratan con yoduro de propidio para visualizar las células muertas y se visualizan utilizando CLSM (D) Los agregados con el fenotipo deseado se separan de SCFM2 utilizando FACS. Abreviaturas: SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopía de barrido láser confocal; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62420/62420fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aquí, se demuestra la utilidad de SCFM2 para estudiar el impacto del tratamiento antibiótico en los agregados de Pa en tiempo real, seguido por el uso de un enfoque de clasificación celular para aislar poblaciones de agregados con fenotipos distintos para el análisis posterior(Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Aminoácidos Alanina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acros Organics</td><td>56-41-7</td><td></td></tr><tr><td>Arginina HCl</td><td>MP</td><td>1119-34-2</td><td></td></tr><tr><td>Asparagina</td><td>Acros Organics</td><td>56-84-8</td><td>Preparado en 0,5 M NaOH</td></tr><tr><td>Cistina HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06328</td><td></td></tr><tr><td>Ácido glutámico HCl</td><td>Acros Organics</td><td>138-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Acros Organics</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Histidina HCl H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17627</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucina</td><td>Acros Organics</td><td>73-32-5</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12311</td><td></td></tr><tr><td>Lisina HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62099</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Acros Organics</td><td>63-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Ornitina HCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>Fenilalanina</td><td>Acros Organics</td><td>63-91-2</td><td></td></tr><tr><td>Prolina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10199</td><td></td></tr><tr><td>Serina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11179</td><td></td></tr><tr><td>Treonina</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Triptófano</td><td>Acros Organics</td><td>73-22-3</td><td>Preparado en 0,2 m NaOH</td></tr><tr><td>Tirosina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11141</td><td>Preparado en 1.0 M NaOH</td></tr><tr><td>Valina</td><td>Acros Organics</td><td>72-18-4</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J6194903</td><td></td></tr><tr><td>Existencias</td><td></td><td></td><td></td></tr> diarias <tr><td>CaCl2 * 2H2</td><td>O Fisher Chemical</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa (D-glucosa)</td><td>Fisher Chemical</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Fisher (Avanti Polar Lipids)</td><td>4235-95-4</td><td>agitar 15-20 min a 37 & deg; C para evaporar el cloroformo</td></tr><tr><td>FeSO4 * 7H2O</td><td>Acros Organics</td><td>7782-63-0</td><td>este stock equivale a 1 mg/mL, DEBE hacer</td></tr><tr><td>ácido L-láctico</td> fresco <td>Alfa Aesar</td><td>L13242</td><td>pH stock a 7 con NaOH</td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilglucosamina</td><td>&nbsp; TCI</td><td>A0092</td><td></td></tr><tr><td>Sólidos</td><td></td><td></td><td></td>preparados</tr><tr><td>Mucina porcina</td><td>Sigma</td><td>M1778-100G</td><td>Esterilización UV</td></tr><tr><td>Esperma de salmón DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Tinción</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66764MC</td><td></td></tr><tr><td>Sales K</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2SO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13975</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64189</td><td>añadir sólido directamente a la base tamponada</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Acros Organics</td><td>7757-79-1</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12914</td><td>añadir sólido directamente a la base tamponada</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td>añadir sólido directamente a la base amortiguada</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>RPI</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>RPI</td><td>S23120-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Acros Organics</td><td>12125-02-9</td><td>añadir sólido directamente a la base tamponada</td></tr><tr><td>Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos (15 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos (50 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo con tapón de flujo</td><td>de aire Olympus plastics</td><td>21-129</td><td></td></tr><tr><td>35 mm plato de cuatro cámaras con fondo de vidrio</td><td>CellVis</td><td>NC0600518</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) caldo</td><td>Genessee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (p200)</td><td>Olympus plastics</td><td>23-150RL</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de pipeta (p1000)</td><td>Olympus plastics</td><td>23-165RL</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (5 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (25 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (50 mL)</td><td>Olympus plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura (libre de RNasa/DNasa); agua nanopura</td><td>Genessee Scientific</td><td>18-194</td><td>Agua nanopura utilizada para la preparación de soluciones en la Tabla 1</td></tr><tr><td>Jeringas (10&nbsp; mL)</td><td>BD</td><td>794412</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas (50 mL)</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>0,22 mm Filtro de jeringa PES</td><td>Olympus plastics</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>PS cubeta semi-mico</td><td>Olympus plastics</td><td>91-408</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>Para preparar las figuras</td></tr><tr><td>FacsDiva6.1.3</td><td>Becton Dickinson, San José, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>versión 9.6</td></tr><tr><td>Zen Negro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FacsAriallu</td><td>Becton Dickinson, San José, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 microscopio de barrido láser confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por pseudomonas aeruginosa

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) es uno de los patógenos oportunistas más comunes asociados con la fibrosis quística (FQ). Una vez que se establece la colonización por Pa, una gran proporción de las bacterias infectantes forman biopelículas dentro del esputo de las vías respiratorias. Se ha demostrado que las biopelículas de Pa aisladas del esputo de FQ crecen en agregados pequeños y densos de ~ 10-1,000 células que están organizadas espacialmente y exhiben fenotipos clínicamente relevantes, como la tolerancia a los antimicrobianos. Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Utilizando un medio sintético de esputo CF (SCFM2), se puede observar la historia de vida de los agregados de Pa utilizando microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Este sistema in vitro permite la observación de miles de agregados de tamaño variable en tiempo real, tres dimensiones y a escala de micras. A nivel individual y poblacional, tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición facilita la observación de agregados en diferentes etapas de desarrollo y su respuesta a cambios en el microambiente, como el tratamiento antibiótico, para diferenciarlos con precisión.

Este trabajo detalla métodos para observar agregados de Pa a alta resolución y en un ambiente similar al de la infección crónica de la FQ pulmonar9,10,12. SCFM2 proporciona un sistema in vitro que promueve la agregación natural de células Pa en tamaños similares a los observados durante la infección real10. La adaptabilidad de SCFM2 como medio definido se puede aprovechar para a...

El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.

Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Nuestro protocolo proporciona una forma de estudiar las bacterias resistentes a los antibióticos en un entorno nutricional y físico similar a cómo probablemente existan in vivo. Una de las mayores ventajas de esta técnica es la capacidad de capturar imágenes de alta resolución y datos fenotípicos de bacterias en tamaños de población relevantes para la infección. Eso es agregados de aproximadamente 10 a 1, 000 celdas.Demostrando el procedimiento estará Alexa Gannon, una asistente de investigación graduada de mi laboratorio. Para comenzar, esterilice el medio que contiene mucina bajo luz ultravioleta durante cuatro horas. Transfiera la mucina tratada con UV a tubos estériles de 1,7 mililitros en condiciones estériles y almacene los tubos a menos 20 grados centígrados.Después de preparar la base tamponada, agregue la solución de mucina en la base tamponada que contiene ADN como se describe en el manuscrito de texto. La noche anterior al experimento, inocular cinco mililitros de caldo LB con varias colonias de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 a partir de un antibiótico que contiene una placa de agar LB y cultivar la bacteria durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 250 revoluciones por minuto. A la mañana siguiente, al menos dos horas antes de comenzar el experimento, encienda el microscopio de barrido láser confocal y abra el módulo de incubación en el software de imágenes asociado.Diluir 500 microlitros del cultivo en cinco mililitros de caldo LB fresco e incubar la suspensión bacteriana a 37 grados centígrados y 250 revoluciones por minuto durante 60 a 90 minutos. Cuando las bacterias hayan entrado en la fase de registro, peletizar las células bacterianas por centrifugación y lavar las células tres veces con pbs esterilizados por filtro. Después del último lavado, vuelva a gastar el pellet en un mililitro de PBS.Mida la absorbancia de la suspensión celular bacteriana a 600 nanómetros para determinar el volumen de cultivo requerido para una densidad óptica de 0,05 en cinco mililitros de esputo sintético de fibrosis quística medio dos. Inocular el volumen calculado de suspensión celular bacteriana en el medio y el vórtice suavemente antes de agregar un mililitro de células a cada cámara de un plato de cultivo óptico de cuatro cámaras, luego incubar las bacterias durante cuatro horas en condiciones estáticas a 37 grados centígrados. Para obtener imágenes de los agregados de Pseudomonas aeruginosa mediante microscopio de barrido láser confocal, al final de la incubación, designe tres pomos de la placa de cultivo como réplicas del tratamiento antibiótico y uno bien como el control sin tratamiento y coloque la placa en la etapa calentada en el microscopio.Seleccione un objetivo de inmersión de aceite 63X y abra la pestaña de localización para identificar los agregados bacterianos en el campo brillante. Defina un área para obtener imágenes dentro de cada pozo y use el módulo de posiciones para almacenar la posición del área. Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros y la longitud de onda de emisión en 509 nanómetros.En el módulo de adquisición, seleccione la opción Z-stack para adquirir las imágenes y utilice el módulo de promedio de línea para reducir la fluorescencia de fondo en el canal GFP dentro del volumen total de las imágenes Z-stack. Establezca la opción de serie temporal para capturar 60 rebanadas en cada pozo a intervalos de 15 minutos durante 18 horas y use la estrategia de enfoque definida para almacenar un plano focal para cada posición que se volverá a imaginar en cada punto de tiempo a lo largo del experimento. 4-1/2 horas después de configurar el experimento de imágenes, imagine cada posición para determinar la biomasa agregada dentro de cada uno de los cuatro pozos antes de la adición del antibiótico.Después de seis horas, agregue suavemente el antibiótico dos veces por debajo de la concentración inhibitoria mínima al medio de cada pozo, simplemente sople la interfaz del líquido de aire y haga clic en iniciar el experimento para comenzar la imagen del tratamiento posterior al antibiótico. Para aislar las células vivas, al final del período de imágenes de 18 horas, etiquete las bacterias en cada pozo con el volumen apropiado de yoduro de propidio de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Al final de la incubación, use un recipiente aislado para transferir la placa al citómetro de flujo y configure el citómetro para detectar GFP y yoduro de propidio utilizando una boquilla de 70 micras, luego ejecute alícuotas de un mililitro de cada sobrenadante de cultivo a la tasa de flujo más baja para clasificar los agregados viables de Pseudomonas aeruginosa con yoduro de propidio positivos y no viables.Para cuantificar la dinámica agregada, cargue las imágenes en un programa de software de análisis de imágenes apropiado y cree histogramas de los recuentos producidos para los cultivos de control no tratados y tratados con antibióticos en el canal GFP para permitir la cuantificación de la fluorescencia de fondo. Para garantizar que los vóxeles GFP detectados se correlacionen con la biomasa bacteriana, defina un vóxel GFP positivo como mayor o igual a 1,5 veces el valor del recuento de fondo GFP. Produzca las superficies ISO para todos los vóxeles restantes y para detectar agregados individuales, habilite la opción dividir objetos y defina los agregados como objetos.Utilice el módulo vantage para calcular el volumen XYZ y la suma de los vóxeles GFP para cada objeto individual. Exporte estos datos a una plataforma estadística externa. Filtre los datos exportados por tamaño para definir objetos con volúmenes mayores o iguales a cinco micrómetros cúbicos.Elimine cualquier objeto de menos de 0,5 micrómetros cúbicos y utilice el módulo de vista para calcular la distancia de cada objeto en relación con otros objetos dentro de cada imagen. Alternativamente, la distancia se puede calcular utilizando la fórmula, luego use la suma y los cálculos promedio para determinar la biomasa total en el volumen agregado promedio. Aunque quedan múltiples agregados bacterianos viables después de cuatro horas de aplicación de antibióticos, la biomasa total de las poblaciones agregadas dentro de los cultivos tratados con antibióticos se reduce significativamente en comparación con la de los cultivos no tratados.La microscopía de series temporales se puede utilizar para determinar los patrones espaciales entre los agregados sensibles positivos para yoduro de propidio y los agregados tolerantes positivos para GFP después del tratamiento con antibióticos. Al calcular cómo los agregados de diferentes tamaños contribuyen a la población general, se pueden identificar patrones de cómo los agregados responden al tratamiento con antibióticos en relación con su tamaño, forma y posición. Después del tratamiento con antibióticos, los agregados viables y no viables se pueden separar con éxito de acuerdo con su expresión de señal fluorescente.Esperamos que este protocolo inspire a otros investigadores a estudiar su organismo de elección a una resolución similar. Nuestro objetivo es encontrar hilos biológicos comunes en estas comunidades complejas, independientemente del sitio de infección.

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Investigación

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Immunology and Infection

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Fuente: Chen, Y., et al. Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo muestra un ensayo de supervivencia utilizando C. elegans para modelar la patogénesis de Aeromonas , donde la ingestión oral de la bacteria provoca infección intestinal y mortalidad, permitiendo una evaluación cuantitativa de la virulencia bacteriana en un sistema huésped vivo.

Modelado de la patogénesis de Aeromonas en C. elegans mediante un ensayo de supervivencia

Este vídeo muestra una técnica in vitro para estudiar el impacto del tratamiento antimicrobiano en los agregados de Pseudomonas aeruginosa (Pa). Las células Pa marcadas con fluorescencia se cultivan como agregados, imitando el patrón de crecimiento durante la infección. Al desafiar los agregados con una concentración subletal del antibiótico colistina, la evaluación en tiempo real de la interacción bacteria-antibiótico se realiza mediante microscopía de fluorescencia.

Una técnica in vitro para el estudio de tratamientos antimicrobianos sobre agregados bacterianos

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Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

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P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Este flujo de trabajo se puede utilizar para realizar pruebas de susceptibilidad a los antibióticos utilizando un modelo ex vivo establecido de biopelícula bacteriana en los pulmones de individuos con fibrosis quística. El uso de este modelo podría mejorar la validez clínica de los ensayos de MBEC (concentración mínima de erradicación de biopelículas).

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