Análisis de todo el genoma de la distribución de modificaciones de histonas utilizando el método de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en Magnaporthe oryzae

Este método puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la regulación de los genes diana candidatos a través de modificaciones epigenéticas durante la patogénesis fúngica en la patología vegetal. La tecnología de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina puede detectar de manera eficiente segmentos de ADN que interactúan con histonas y factores de transcripción en todo el genoma. En comparación con otros métodos, puede mejorar la eficiencia y la resolución.

Comience agregando 100 microlitros de medio líquido completo a las placas de tomate de avena Agger usando una pipeta de 100 microlitros. Usando un lazo de inoculación, raspe el micelio de la cepa de tipo salvaje y la cepa knockout. Recoja los restos de micelio y transfiéralos a 250 mililitros de medio líquido completo.

Lave las hifas fúngicas con 500 mililitros de solución de cloruro de sodio 0,7 molares. Luego recoja el micelio fúngico y péselo. Añadir aproximadamente un mililitro de solución de permeación enzimática de lisis por cada gramo del micelio fúngico.

Coloque las hifas para rebanar a 28 grados centígrados durante tres o cuatro horas con agitación a 150 RPM. Lave las hifas en liced con 50 mililitros de solución de cloruro de sodio 0,7 molares. Centrifugar la muestra y desechar el sobrenadante con cuidado.

Vuelva a suspender el protoplasto en 20 mililitros de solución de cloruro de sodio 0,7 molar. Agregue 55 microlitros de formaldehído al 37% gota a gota a dos mililitros de tampón de cloruro de sodio que contienen protoplastos para la reticulación hasta que la concentración final sea del 1%Para apagar el formaldehído no reaccionado, agregue 20 microlitros de 10 veces glicina a cada tubo. Deseche el sobrenadante cuidadosamente después de la centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de cloruro de sodio 0,7 molares. Deseche el sobrenadante cuidadosamente después de la centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 750 microlitros de tampón RIPA. Añadir 37,5 microlitros de 20 veces inhibidor de la proteasa.

Corte la cromatina por sonicación durante ocho minutos utilizando un homogeneizador ultrasónico. Después de que la muestra se haya roto por ultrasonidos, saque una parte de la muestra como entrada que contenga todo el ADN y la proteína liberados después de que la muestra se sonice. Para analizar la longitud de los fragmentos de ADN, ejecute una electroforesis en gel de agarosa al 1% después de la sonicación.

Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante centrifugado a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros y guárdelo a 80 grados centígrados negativos para su uso posterior. Antes de realizar el experimento IP, diluya cada muestra de cromatina a una proporción de uno a 10 con una vez el búfer RIPA. Pipetee 50 microlitros de perlas de proteínas súper paramagnéticas en un tubo centrífugo de dos mililitros.

Coloque los tubos en un soporte magnético y deje que las perlas magnéticas precipiten. A continuación, retire el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón RIPA preenfriado una vez al tubo y lave las perlas de proteína súper paramagnética tres veces.

Coloque los tubos en un soporte magnético y retire el sobrenadante. Agregue 100 microlitros de un búfer RIPA a cada tubo. Agregue 30 microlitros de la muestra de cromatina, 100 microlitros de perlas de proteínas súper paramagnéticas y cuatro microlitros de anticuerpos H3K4me3 al tubo, mezclándolos bien.

Coloque las muestras en un agitador rotativo para incubarlas durante la noche a cuatro grados Celsius a 30 veces G.Lave el anticuerpo de perla de proteína súper paramagnética y el complejo de cromatina resuspiendo las perlas en un mililitro de una vez el tampón RIPA. Lave la muestra con un mililitro de tampón de lavado de complejo inmune bajo en sal, luego con un mililitro de tampón de lavado de complejo inmune de alta sal. Enjuague las perlas con un mililitro de tampón de cloruro de litio y retire el sobrenadante.

A continuación, agregue un mililitro de tampón TE al tubo. Coloque el tubo de nuevo con un mililitro de tampón TE y retire el sobrenadante con una pipeta. Agregue 100 microlitros de tampón de elución a cada tubo de centrífuga.

Realice la elución a 65 grados centígrados durante 15 minutos. Centrifugar durante un minuto a 10.000 veces G a cuatro grados Celsius y recoger el sobrenadante en nuevos tubos de centrífuga. Agregue ocho microlitros de cloruro de sodio de cinco molares a todos los tubos e incube a 65 grados Celsius durante cuatro a cinco horas o durante la noche para revertir los enlaces cruzados de proteínas de ADN.

Añadir un microlitro de Rnase A e incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Agregue cuatro microlitros de proteinasa K a cada tubo e incube a 45 grados Celsius durante una o dos horas. Agregue 550 microlitros de la mezcla de cloroformo fenal y alcohol isoamílico al tubo de la centrífuga.

Centrifugar durante 15 minutos a 10.000 veces G y aspirar el sobrenadante. Agregue 1/10 de volumen de solución de acetato de sodio molar tres, 2.5 volúmenes de etanol absoluto y tres microlitros de glucógeno al tubo. Coloque la muestra en un refrigerador a 20 grados centígrados negativos durante la noche para la precipitación.

Al día siguiente, centrifuga los tubos y desecha el sobrenadante. Lave el pellet tres veces con un mililitro de etanol 75% recién preparado a 10, 000 veces G.Agregue 50 microlitros de agua desionizada estéril para disolver suficientemente el precipitado. Repare los extremos del ADN para generar ADN romo utilizando un kit de reparación del extremo del ADN y las instrucciones mencionadas en el manuscrito de texto.

Para agregar base de adenina a los tres extremos primos, agregue 30 microlitros de ADN, dos microlitros de agua, cinco microlitros de 10 veces el tampón Taq, 10 microlitros de un dATP milimolar y tres microlitros de ADN polimerasa Taq a un tubo centrífugo PCR de 0.2 microlitros. Mézclalos y reacciona en una máquina de PCR a 72 grados centígrados durante 10 minutos. Realice la ligadura del enlazador mezclando 10 microlitros de ADN, 9.9 microlitros de agua, 2.5 microlitros de tampón de ligasa de ADN T4, 0.1 microlitros de oligo mezcla adaptadora y 2.5 microlitros de ligasa de ADN T4 en un tubo centrífugo PCR de 0.2 microlitros.

Incubar el tubo a 16 grados centígrados durante cuatro horas. Para amplificar el ADN utilizando cebadores de PCR, agregue 10.5 microlitros de ADN, 12.5 microlitros de mezcla maestra de dos veces alta fidelidad. un microlitro de imprimación PCR PE 1.0 y un microlitro de imprimación PCR PE 2.0 a un tubo centrífugo PCR de 0,2 microlitros y mezclar bien.

Las señales H3K4me3 de los mutantes de deleción mobre2, mospp1 y moswd2 disminuyeron significativamente en sus regiones diana funcionales. En comparación con la cepa de tipo salvaje P131, las señales de las lecturas de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina H3K4me3 enriquecida en los mutantes de deleción mobre2, mospp1 y moswd2 disminuyeron en gran medida. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar chip sobre chip y chip qPCR.

Por lo general, se utilizan para examinar el gen objetivo aguas abajo de una proteína y estudiar las interacciones del ADN de la proteína en los sitios de unión al genoma conocidos.