Name: Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprende a preparar homogeneizados de músculo esquelético de rata para medir nitratos y nitritos, comparando tres métodos de homogenización. Esta técnica permite cuantificar metabolitos del óxido nítrico en tejido muscular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la subvención intramuros de NIH / NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.

El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIDDK (ASP K049-MMB-20). Los animales fueron manejados y tratados de acuerdo con la Guía actual para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio disponible gratuitamente en el sitio web de AAALAC.
1. Colección de músculo esquelético de rata
<ol><li>Mientras una rata está bajo anestesia profunda (isoflurano al 5%, confirmado por la ausencia de reacción al pellizco de la cola / pierna), comience la perfusión con solución salina que contenga heparina colocando una aguja de 19 G en un ápice del ventrículo izquierdo y haciendo un corte en la aurícula derecha. Permita que la solución salina con heparina perfunda a través de los órganos internos hasta que al menos 1,5 litros/kg hayan fluido a través del tejido. En este punto, los animales están muertos por exsanguinación y los cadáveres están listos para ser procesados para la recolección de muestras. NOTA: Lograr una buena perfusión es crítico, especialmente para mediciones precisas de nitrito, porque el nitrito se oxida en nitrato por cualquier hemoglobina restante.</li>
	<li>Identificar los tejidos musculares objetivo y extirparlos de las patas traseras22 utilizando instrumentos quirúrgicos limpios. Retire tanta grasa y tejidos conectivos de los tejidos musculares como sea posible.</li>
	<li>Coloque la cantidad deseada de músculo en un tubo de microcentrífuga y luego colóquela en hielo seco. Guarde los tubos llenos de pañuelos de papel en el congelador a -80 °C. NOTA: En el caso de muestras de biopsia humana, séquelas completamente inmediatamente después de la recolección con una gasa limpia para eliminar el exceso de sangre.</li>
</ol>2. Preparación para la homogeneización
<ol><li>Preparación de solución conservadora de nitrito (solución de parada)<ol><li>Preparar una solución amarilla transparente que contenga 890 mM de ferricianuro de potasio (K3Fe(CN)6) y 118 mM de NEM (N-etilmaleimida) en agua destilada, asegurándose de que no haya cristales. Agregue surfactante no iónico (detergente) en una proporción de 1: 9 (v / v, Tabla de materiales) y mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.</li>
		<li>Diluir la solución de parada en una proporción de 1:9 con agua destilada. Coloque la solución de parada diluida (proporción 1:5 de tejido muscular a solución de parada diluida) en el tubo de homogeneización. NOTA: Veinte miligramos de tejido requerirán 100 μL de solución de parada, y 200 mg de tejido requerirán 1000 μL de solución de parada en el tubo. La presencia de detergente en la solución añadida es crítica para la interrupción de las membranas celulares. Se puede usar cualquier detergente no iónico, pero se debe tener cuidado para verificar que no interfiera con el método de quimioluminiscencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de tejidos<ol><li>Saque el tejido del congelador a -80 °C y descongele lentamente en hielo. Retire la grasa restante y el tejido conectivo del músculo esquelético. Corte los trozos de músculo esquelético y seque la gasa para que se seque.</li>
		<li>Pese la cantidad de tejido (20, 50 y 200 mg). Coloque el músculo esquelético previamente pesado en la solución de parada en los tubos de homogeneización o coloque el tejido prepesado en un tubo de microcentrífuga limpio para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Homogeneización
<ol><li>Homogeneizador rotativo (Figura 1)<ol><li>Coloque el tubo tipo M que contiene el músculo esquelético previamente pesado y la solución de parada premedida en la máquina. Homogeneice cada muestra dos veces (fijando en el ciclo de homogeneización más destructivo) y coloque el tubo en hielo inmediatamente después de cada homogeneización durante 5 minutos para que se enfríe.</li>
		<li>Centrifugar brevemente a 2.000 × g y 4 °C durante 5 min. Vuelva a colocar el tubo lleno sobre hielo y añada el volumen adecuado de metanol (≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vórtice a fondo durante 15 s. NOTA: Para 20 mg de tejido, utilice 200 μL de metanol. El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia.</li>
		<li>Homogeneizar una vez más e incubar en hielo durante 30 min. Centrifugar las muestras durante 35 min a 4 °C y 3.500 × g. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneizador de cuentas (Figura 2)<ol><li>Coloque el tejido muscular esquelético en un tubo que contenga perlas (proporción 1:5 para tejido: solución de parada diluida) y homogeneice dos veces durante 45 s a la velocidad más alta disponible en el instrumento utilizado. Coloque el tubo en hielo inmediatamente después de cada homogeneización durante 5 minutos para que se enfríe.</li>
		<li>Centrifugar brevemente con una centrífuga de escritorio pequeña (2.000 x g) durante 5 segundos. Vuelva a colocar el tubo sobre hielo y añadir un volumen adecuado de metanol (pureza ≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vórtice a fondo durante 15 s. NOTA 1: Para 20 mg de tejido, utilizar 200 μL de metanol. NOTA 2: El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia.</li>
		<li>Homogeneizar una vez más durante 45 s a la velocidad más alta disponible en el instrumento utilizado. Incubar en hielo durante 30 min. Centrífuga a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulverizador (Figura 3)<ol><li>Prepare tubos que contengan solución de parada diluida (5 veces el peso del tejido) y péselos. Registre el peso (tubo + solución de parada).</li>
		<li>Coloque la herramienta pulverizadora de nitrógeno líquido en hielo seco y espere aproximadamente 30 minutos para que alcance la temperatura deseada.</li>
		<li>Usando pinzas enfriadas en nitrógeno líquido, transfiera una muestra (el peso del tejido ya se ha medido) al pulverizador. Agregue una cucharada pequeña de nitrógeno líquido para asegurarse de que el tejido esté a temperatura de nitrógeno líquido.</li>
		<li>Después de que el 95% del nitrógeno líquido se haya vaporizado, coloque la herramienta de trituración sobre el tejido y presione firmemente. Deberías sentir el aplastamiento de la muestra. Usando el mazo, golpee la herramienta de trituración 3-5x.</li>
		<li>Revise la muestra en busca de trozos restantes con una cuchara enfriada en nitrógeno líquido. Después de enfriar en nitrógeno líquido, use un pedazo de papel de seda para limpiar el agua congelada antes de tocar el pañuelo. Si hay un trozo presente, muévalo hacia el centro y luego golpea 5-6 veces más con el mazo.</li>
		<li>Cuando se haya pulverizado toda la muestra, utilizar la cuchara líquida refrigerada por nitrógeno para transferir directamente el tejido triturado al tubo previamente pesado que contiene la solución de parada diluida (paso 3.3.1). Asegúrese de realizar este paso rápidamente, ya que cuando el músculo esquelético aplastado se calienta, se vuelve pegajoso y difícil de transferir.</li>
		<li>Vórtice durante 15 s. Verifique que no haya tejido atascado en la parte superior del tubo abriendo el tubo. Si lo hay, trate de desalojarlo y luego vuelva a vomarcar.</li>
		<li>Centrifugar la muestra durante 2-3 s utilizando una pequeña centrífuga de escritorio. Vuelva a pesar el tubo. Calcule el peso del tejido deduciendo el peso original del tubo (paso 3.3.1) de este nuevo peso. Coloque el tubo sobre hielo. NOTA: Los pesos exactos ayudarán a determinar el peso exacto del tejido y la cantidad de tejido que se perdió durante la pulverización.</li>
		<li>Una vez que todas las muestras hayan sido procesadas hasta el paso 3.3.8, añadir un volumen adecuado de metanol (≥ 99,9 %, 10 veces el peso del tejido). Vortex a fondo durante 15 s, e incubar en hielo durante 30 min. NOTA: Para 20 mg de tejido, utilice 200 μL de metanol. El metanol se utiliza para precipitar proteínas del homogeneizado tisular y no interfiere con el método de quimioluminiscencia. Si se utiliza otro método de precipitación de proteínas, pruebe su compatibilidad con la quimioluminiscencia.</li>
		<li>Centrífuga a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirar el sobrenadante y medir los niveles de nitrito/nitrato, o almacenar a -80 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medición de nitrito/nitrato con analizador de óxido nítrico (NOA)
<ol><li>Prepare todas las muestras mediante cualquiera de los tres métodos de homogeneización descritos anteriormente e inyéctelas en un NOA para la medición de nitratos y nitritos. NOTA: Los protocolos detallados para el uso de NOA se publicaron anteriormente19.</li>
</ol>

<ol><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).</li>
<li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-arginine-nitric+oxide+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li>
<li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li>
<li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li>
<li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomach+NO+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502(1994).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans%3A+measurements+in+expelled+air%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li>
<li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li>
<li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans%3A+role+for+nitrite-derived+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li>
<li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).</li>
<li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li>
<li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+nitrate+store%3A+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li>
<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Nitrite+and+Nitrate%2C+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway%2C+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).</li>
<li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li>
<li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li>
<li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li>
<li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA%28y%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses. Alan N. Schechter figura como coinventor en varias patentes emitidas a los Institutos Nacionales de Salud para el uso de sales de nitrito para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Recibe regalías basadas en la licencia de los NIH de estas patentes para el desarrollo clínico, pero ninguna otra compensación. Estos arreglos no afectan su adhesión a las políticas de la revista JoVE.

Para monitorear los cambios en los metabolitos de NO, nitrato y nitrito, en función de las intervenciones fisiológicas, es imperativo medir los niveles de estos iones en los diferentes órganos que son críticos en su metabolismo. Como la hemoglobina en la sangre reaccionará con el NO y sus metabolitos, también es importante eliminar la sangre rápidamente de las muestras de tejido tanto como sea posible. Por lo tanto, los animales fueron perfundidos con solución salina antes de recolectar tejidos del músculo esquelético (g...

El óxido nítrico (NO), una pequeña molécula de señalización gaseosa, desempeña un papel crítico en los procesos fisiológicos y fisiopatológicos1. El NO puede ser producido a partir de L-arginina por enzimas endógenas de la familia de la óxido nítrico sintasa (NOS) antes de someterse a una rápida oxidación a nitrato (NO 3-) y, posiblemente, nitrito (NO2-) en sangre y tejidos 2,3. Recientemente, se ha demostrado que estos aniones se reducen de nuevo a NO en los sistemas de mamíferos4. El nitrato se convierte en nitrito, principalmente por nitrato reductasas bacterianas comensales en la cavidad oral que actúan sobre iones secretados por las glándulas salivales e ingeridos directamente 5, y en cierta medida, por enzimas de mamíferos como la xantina oxidorreductasa 6,7. El nitrito puede reducirse aún más a NO por varios mecanismos, incluyendo la desoxihemoglobina8, la desoximioglobina9, las enzimas que contienen molibdeno 10 y la reducción no enzimática en presencia de protones11,12.
Esta vía nitrato-nitrito-NO se mejora en condiciones hipóxicas en las que la actividad de NOS disminuye porque NOS requiere oxígeno para la generaciónde NO 4. Muchos estudios recientes han reportado efectos beneficiosos del nitrato dietético sobre la regulación de la presión arterial y el rendimiento del ejercicio, sugiriendo que las vías de reducción de nitrato contribuyen al aumento de la señalización de NO13,14,15. Estudios previos han demostrado que algunos músculos esqueléticos son probablemente los principales lugares de almacenamiento de nitrato en el cuerpo16. En comparación con la sangre u otros órganos internos como el hígado, el músculo esquelético (glúteo mayor) contiene niveles significativamente más altos de nitrato y tiene una masa sustancial en el cuerpo de los mamíferos. Se demostró que el ejercicio en cinta rodante mejora la reducción de nitratos a nitrito y NO en glúteos en un modelo de rata7. Estos resultados implican que algunos músculos esqueléticos podrían ser fuentes importantes de NO a través de vías de reducción de nitratos en situaciones fisiológicas. Estudios más recientes sugieren que estos hallazgos, incluyendo cambios en los niveles de nitrato muscular durante el ejercicio, también ocurren en humanos17.
Dos de los autores actuales habían establecido previamente un método para medir los niveles de nitrato y nitrito en muestras de sangre y otros líquidos18. Sin embargo, cuando se analizaron inicialmente los niveles de estos aniones en homogeneizados tisulares, no se disponía de protocolos detallados. Para comprender la dinámica nitrato-nitrito-NO en varios órganos diferentes, nuestro objetivo era desarrollar un método preciso y eficiente para medir los niveles de nitrato y nitrito en tejidos de mamíferos, incluido el músculo esquelético. En estudios anteriores, los tejidos de roedores fueron utilizados para desarrollar procesos de homogeneización confiables y luego analizar el contenido de nitrato y nitrito en esos homogeneizados 7,16,19. El uso de este método de homogeneización se extendió a muestras de biopsia de músculo esquelético humano, por lo que los valores fueron confirmados, y es importante destacar que los valores observados para el músculo en comparación con la sangre / plasma estaban en rangos y proporciones similares a los observados en roedores17. En los últimos años, otros grupos también comenzaron a medir los niveles de nitrato y nitrito en homogeneizados del músculo esquelético, reportando valores comparables a los reportados por nuestro grupo20,21.
El objetivo de este documento de protocolo es describir en detalle la preparación de homogeneizados del músculo esquelético utilizando tres métodos de homogeneización diferentes para la medición posterior de los niveles de nitrato y nitrito. Además, se examinaron los efectos del peso del tejido utilizado para la homogeneización sobre los valores de nitrato y nitrito en muestras de músculo esquelético. Creemos que estos métodos se pueden aplicar fácilmente a otros tipos de tejidos de mamíferos. Recientemente, especialmente en el campo de la fisiología del ejercicio, se había prestado atención a las posibles diferencias en la fisiología de nitrato/nitrito/NO según los grupos musculares. También informamos las cantidades de nitrato y nitrito en cuatro músculos roedores diferentes y encontramos una distribución no uniforme de ambos iones entre estos músculos diferentes; una observación que requiere más estudio.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS disociador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS M tubo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td>Longitud: 87 mm; Diámetro: 30 mm</td></tr><tr><td>Heparina Sódica</td><td>Hospira</td><td>NDC-0409-7620-13</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>646377</td><td></td></tr><tr><td>Minilys homogeneizador de perlas</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de óxido nítrico</td><td>GE</td><td>Sievers NOA 280i</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-nonilfenilpolietilenglicol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro de potasio; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Precellys kit de lisado</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td>contiene tubos de 2 mL con perlas cerámicas (óxido de circonio) de 2,8 mm para la homogeneización</td></tr><tr><td>Kit pulverizador</td><td>Trituradora de células</td><td>Kit</td><td></td> de trituradora de células</tr></tbody></table>

preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Alguna vez se pensó que los iones de nitrato (NO3-) eran productos finales inertes del metabolismo del óxido nítrico (NO). Sin embargo, estudios previos demostraron que los iones de nitrato pueden convertirse de nuevo en NO en mamíferos a través de un mecanismo de reducción de dos pasos: el nitrato se reduce a nitrito (NO2-) principalmente por bacterias comensales orales, luego el nitrito se reduce a NO por varios mecanismos, incluso a través de proteínas que contienen hemo o molibdeno. Esta vía reductora del nitrato contribuye a mejorar las vías de señalización mediadas por NO, particularmente en el sistema cardiovascular y durante el ejercicio muscular. Los niveles de nitrato en el cuerpo antes de tal utilización están determinados por dos fuentes diferentes: oxidación endógena de NO y la ingesta de nitrato en la dieta, principalmente de plantas. Para dilucidar el ciclo complejo de NO en circunstancias fisiológicas, hemos examinado más a fondo la dinámica de sus metabolitos, iones de nitrato y nitrito, que son relativamente estables en comparación con NO. En estudios previos se identificó el músculo esquelético como un importante órgano de almacenamiento de iones de nitrato en mamíferos, así como una fuente directa de NO durante el ejercicio. Por lo tanto, establecer una metodología confiable para medir los niveles de nitrato y nitrito en el músculo esquelético es importante y debería ser útil para extender su aplicación a otras muestras de tejido. Este artículo explica en detalle la preparación de muestras de músculo esquelético, utilizando tres métodos de homogeneización diferentes, para mediciones de nitratos y nitritos y discute cuestiones importantes relacionadas con los procesos de homogeneización, incluido el tamaño de las muestras. Las concentraciones de nitrato y nitrito también se han comparado en cuatro grupos musculares diferentes.

Para obtener resultados representativos, se utilizaron tejidos del músculo esquelético de 8 ratas Wistar (machos y hembras, peso 250 ± 50 g). Los homogeneizados del músculo esquelético de rata (50 mg de músculo glúteo mayor para cada método) se prepararon mediante tres herramientas de homogeneización diferentes (homogeneizador rotativo, homogeneizador de perlas y pulverizador). Los contenidos de nitrato y nitrito de estos homogeneizados se determinaron utilizando un analizador de óxido nítrico (NOA) (<strong class="xfig"...

Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

El músculo esquelético sirve como un importante reservorio de nitrato que, después de su conversión en nitrito, sirve como fuente de NO durante el ejercicio. Aquí presentamos la metodología para medir estos iones en el músculo y otros tejidos. Para comenzar, prepare la solución de preservación o parada de nitrato combinando ferricianuro de potasio de 890 milimolares y n-metilmaleimida de 118 milimolares en agua destilada, asegurándose de que no queden cristales en solución, luego agregue un surfactante no iónico en una proporción de 1 a 9 y mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.Diluya la solución de parada en una proporción de 1 a 9 con agua destilada y agregue la solución de parada diluida al tubo de homogeneización. A continuación, descongele el tejido muscular de rata aislado y congelado anterior en hielo. Una vez que el tejido se haya descongelado, retire la grasa restante y el tejido conectivo del músculo esquelético.Corte pedazos del músculo esquelético y séquelos en una gasa para que se sequen. Pese la cantidad adecuada de tejido muscular esquelético, luego coloque el tejido de prepeso en los tubos de homogeneización que contienen la solución de parada. Para la homogeneización en un homogeneizador rotativo, coloque el tubo tipo M que contiene el músculo esquelético previamente pesado y la solución de parada premedida en la máquina.Homogeneice cada muestra dos veces, y después de cada homogeneización, coloque el tubo en hielo inmediatamente durante 5 minutos para que se enfríe. Después de la homogeneización, centrifugar el tubo brevemente. Vuelva a colocar el tubo sobre hielo y agregue el volumen apropiado de metanol antes de vomitear durante 15 segundos.Homogeneizar la muestra de nuevo e incubarla en hielo durante 30 minutos, luego centrifugar la muestra, aspirar el sobrenadante y proceder a medir los niveles de nitrito y nitrato. Para la homogeneización de cuentas, coloque el tejido muscular esquelético en un tubo que contenga cuentas y homogeneice dos veces durante 45 segundos a la velocidad más alta disponible en el instrumento. Después de cada homogeneización, coloque inmediatamente el tubo sobre hielo durante 5 minutos para que se enfríe, luego centrifugue el tubo, vuelva a colocar el tubo sobre hielo y agregue el volumen apropiado de metanol antes de vomitear durante 15 segundos.Homogeneice la muestra una vez más durante 45 segundos y luego incube en hielo durante 30 minutos. Centrifugar la muestra, aspirar el sobrenadante y proceder a medir los niveles de nitrito y nitrato. Para la homogeneización basada en pulverizador, prepare tubos que contengan la solución de parada diluida, luego pese y registre el peso de los tubos.Después de enfriar la herramienta pulverizadora en hielo seco durante 30 minutos, usando pinzas enfriadas en nitrógeno líquido, transfiera la muestra de tejido previamente pesada al pulverizador, luego agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para asegurarse de que el tejido esté a temperatura de nitrógeno líquido. Después de que el 95% del nitrógeno líquido se haya vaporizado, coloque la herramienta de trituración sobre el tejido y presione firmemente para sentir el aplastamiento de la muestra, luego usando un mazo, golpee la herramienta de trituración de 3 a 5 veces. Cuando toda la muestra haya sido pulverizada, utilizando una cuchara líquida enfriada con nitrógeno y pinzas, transfiera directamente el tejido triturado al tubo previamente pesado que contiene la solución de parada diluida.A continuación, haga un vórtice en el tubo durante 15 segundos, luego abra el tubo para verificar si hay tejido atascado en la tapa. Si lo hay, trate de desalojarlo, luego vuelva a vorágerse. Centrifugar brevemente la muestra durante 2 a 3 segundos.Pese el tubo de nuevo y calcule el peso del tejido deduciendo el peso original del tubo de este nuevo peso. Coloque el tubo sobre hielo. Agregue un volumen apropiado de metanol al tubo y vórtice el tubo a fondo durante 15 segundos antes de incubarlo en hielo durante 30 minutos, luego centrifugar la muestra, aspirar el sobrenadante y proceder a medir los niveles de nitrito y nitrato.Los niveles de nitrato y los homogeneizados del músculo esquelético de rata preparados con un homogeneizador rotatorio, homogeneizador de perlas y pulverizador fueron similares. Curiosamente, para los niveles de nitrito, la muestra homogeneizada preparada por un pulverizador mostró el valor más alto, que fue estadísticamente diferente de los otros dos valores de muestra. Una comparación de los niveles de nitrito y nitrato en homogeneizados de glúteos preparados a partir de 20, 50 y 200 miligramos de tejido utilizando un homogeneizador de perlas mostró que ni los niveles de nitrato ni de nitrito eran significativamente diferentes entre los tamaños de muestra muscular.La comparación de los niveles de nitrato en diferentes tejidos del músculo esquelético de las patas de roedores reveló que el músculo glúteo tenía niveles de nitrato aproximadamente dos veces más altos que los otros tres tejidos musculares. Sin embargo, estas diferencias no alcanzaron significación estadística. Similar a los niveles de nitrato, la concentración de nitrato en el músculo glúteo también fue mayor que en los otros tres tejidos musculares y fue significativamente mayor que en la muestra de gastrocnemio.Nuestro método es relativamente simple y adecuado para muestras pequeñas, preservando el nitrato y el nitrito durante la preparación de la muestra.

preparation-rat-skeletal-muscle-homogenates-for-nitrate-nitrite

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este sentido, demuestran la fabricación de estructuras a base de colágeno del tejido, con mioblastos esqueléticos. Estas construcciones de ingeniería 3-D se puede utilizar para sustituir o reparar los...

Fabricación de construcciones de ingeniería tisular miogénica

Se describe el protocolo а para el aislamiento de corazón puro, una rata muy unido las mitocondrias de los estudios funcionales o estructurales de la bioenergética celular, mediciones biofísicas, la proteómica y el ADN mitocondrial y el análisis de los lípidos.

Preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias

Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de...

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Este video demuestra los procedimientos quirúrgicos y preparaciones necesarios para estudiar las respuestas contráctiles del músculo gastrocnemio medial de rata in situ. Esta preparación permite la medición de las propiedades contráctiles del músculo esquelético bajo condiciones fisiológicas. El animal se anestesia y el músculo se separa del tejido circundante en su extremo distal. El tendón de Aquiles se conecta a un transductor de fuerza, lo que permite medir la respuesta contráctil del...

Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.

Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

&lt; clase p = 'jove_content'&gt;El óxido nítrico (NO) es una molécula de señalización importante en la homeostasis vascular. La producción de NO in vivo es demasiado baja para la medición directa. La quimioluminiscencia proporciona información útil sobre el ciclo del NO a través de la medición de sus precursores y productos de oxidación, nitrito y nitrato. Se explica la determinación de nitrito/nitrato en tejidos y fluidos corporales.

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Aquí, se presenta un protocolo para análisis rápido de la fibra muscular, lo que permite mejorar la calidad de la tinción, y la adquisición de ese modo automático y la cuantificación de las poblaciones de fibra utilizando el ImageJ software disponible libremente.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

La regulación intacta de la absorción de glucosa muscular es importante para mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo. Este protocolo presenta una evaluación de la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en el músculo esquelético maduro aislado e incubado al delinear el impacto de varias intervenciones fisiológicas en el metabolismo de la glucosa en todo el cuerpo.

Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

Aprende a preparar homogeneizados de músculo esquelético de rata para medir nitratos y nitritos, comparando tres métodos de homogenización. Esta técnica permite cuantificar metabolitos del óxido nítrico en tejido muscular.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Explorar más videos