Name: Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a utilizar la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas bacterianas heterogéneas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Este método eficiente elimina ácidos nucleicos y proteínas, ofreciendo una técnica reproducible para el análisis de vesículas de membrana externa.

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Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (1554417) y los Institutos Nacionales de Salud (DE027769).

1. Preparación de tampones
<ol><li>Para preparar el tampón de lavado ELISA, agregue 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl y 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 1 L de agua desionizada (DI). Añadir 500 μL de polisorbato-20. Ajuste el pH a 7.2 usando HCl o NaOH.</li>
	<li>Para preparar el búfer de bloqueo, agregue 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl y 10 g de BSA. Agregue 500 μL de polisorbato-20 a 1 L de agua DI. Ajuste el pH a 7.2 usando HCl o NaOH.</li>
	<li>Para preparar el tampón de elución (PBS), agregue 8.01 g de NaCl, 2.7 g de KCl, 1.42 g de Na2HPO4y 0.24 g de KH2PO4 a 1 L de agua DI. Ajuste el pH a 7.4 usando HCl o NaOH. NOTA: Se puede hacer una solución 10x de este tampón y diluirla con agua DI según sea necesario.</li>
</ol>2. Preparación de la muestra OMV
<ol><li>Cultivar células de A. actinomycetemcomitans hasta la fase exponencial tardía (densidad óptica a 600 nm de 0,7). Pelletar las células centrifugando dos veces a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 μm.</li>
	<li>Concentre el sobrenadante libre de bacterias utilizando filtros de corte de peso molecular de 50 kDa. Ultracentrífuga la solución concentrada a 105.000 x g a 4 °C durante 30 min.</li>
	<li>Vuelva a colocar el pellet en PBS y ultracentrífuga de nuevo (105.000 x g a 4 °C durante 30 min.) Resuspend el pellet en 2 mL de PBS.</li>
</ol>3. Embalaje de la columna S-1000
<ol><li>Mezcle la botella de caldo del medio de filtración de gel con una varilla de agitación de vidrio y vierta en una botella de vidrio el volumen necesario para llenar la columna, más aproximadamente un 50% de exceso (aproximadamente 135 ml). Deje que estas cuentas se asienten hasta que se hayan asentado y luego decante el exceso de líquido. Resuspenda las perlas en tampón de elución, de modo que la solución final sea aproximadamente 70% (por volumen) de gel, 30% de tampón. Desgasificación de la solución al vacío.</li>
	<li>Monte la columna de vidrio verticalmente usando un soporte de anillo y llene con tampón de elución para humedecer las paredes de la columna. Drene el búfer hasta que solo quede aproximadamente 1 cm de tampón en la columna.</li>
	<li>Sin crear burbujas, pipetee cuidadosamente las cuentas en la columna, llenando la columna hasta la parte superior. Continúe drenando el exceso de amortiguación durante todo este proceso. Asegúrese de no dejar que las cuentas se asienten por completo antes de agregar cuentas adicionales a la parte superior de la columna. La columna debe embalarse a una altura de aproximadamente 2 cm por debajo de la parte inferior del depósito de la columna.</li>
</ol>4. Carga de la muestra y recogida de fracciones
<ol><li>Desgasificación del tampón de elución al vacío. Lave la columna con dos volúmenes de columna (180 ml) de tampón de elución.</li>
	<li>Permita que el búfer restante entre completamente en la columna. Una vez que el tampón haya alcanzado la parte superior de la capa de gel, pipetee cuidadosamente una muestra de 2 ml que contenga OMV (a una concentración de lípidos de aproximadamente 100 - 200 nmol / L) en la superficie de las perlas, teniendo cuidado de no molestar ninguna de las perlas en la parte superior de la columna. Permita que la muestra entre completamente en el gel, es decir, cuando no quede líquido por encima de la capa de gel.</li>
	<li>Agregue con cuidado y lentamente el tampón de elución en la parte superior de la columna de gel. No perturbe la capa superior del gel, ya que esto causará la dilución de la muestra.</li>
	<li>Coloque un solo tubo de 50 ml debajo de la columna y abra la columna. Recoge los primeros 20 mL del eluyente. Agregue un búfer de elución adicional a la parte superior de la columna, con cuidado, según sea necesario para garantizar que la columna nunca esté seca.</li>
	<li>Coloque una serie de tubos de 1,5 ml debajo de la columna. Inicie la columna y recoja una serie de muestras de 1 ml en cada tubo. A medida que se recolectan las muestras, continúe agregando un búfer de elución a la parte superior de la columna, según sea necesario. Repetir hasta que se hayan recogido 96 fracciones. Detenga la columna. NOTA: Las muestras deben almacenarse a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo o 4 °C para el almacenamiento a corto plazo hasta un análisis adicional.</li>
	<li>Para limpiar la columna, ejecute un volumen de columna (90 ml) de 0,1 M NaOH a través de la columna. Ejecute dos volúmenes de columna (180 ml) de búfer de elución a través de la columna.</li>
</ol>5. Análisis de muestras
<ol><li>Para medir la concentración de lípidos en cada fracción, pipetee 50 μL de cada fracción en un solo pozo de una placa de 96 pozos. A cada pozo, agregue 2.5 μL de tinte lipofílico. Incubar durante 15 s. Mida la intensidad de fluorescencia en un lector de placas con una longitud de onda de excitación de 515 nm y una longitud de onda de emisión de 640 nm. Para calcular la fracción de todos los lípidos en cada muestra, sume todas las intensidades de emisión y divida cada intensidad individual por el total.</li>
	<li>Para medir la concentración de una proteína en particular, pipetee 100 μL de cada fracción en un solo pozo de una placa de inmuno-placa ELISA. Incubar a 25 °C durante 3 h.<ol>
<li>Decantar las muestras. Añadir 200 μL de tampón de lavado ELISA a cada pozo y decantar. Repetir cuatro veces para un total de cinco lavados.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón de bloqueo a cada pozo e incubar durante 1 h a 25 °C. Decantar.</li>
		<li>Incubar placas con tampón de bloqueo de 100 μL más anticuerpo primario (1:10.000 para anticuerpos purificados; 1:10 para anticuerpos no purificados) durante la noche a 4 °C. Decantar.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón de lavado ELISA a cada pozo y decantar. Repetir cuatro veces para un total de cinco lavados.</li>
		<li>Agregue 100 μL de tampón de lavado ELISA más anticuerpo secundario (1:30,000) a cada pozo. Incubar durante 1 h a 25 °C.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón de lavado ELISA a cada pozo y decantar. Repetir cuatro veces para un total de cinco lavados.</li>
		<li>Añadir 100 μL de la solución de un solo paso de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e incubar durante 15-30 min o hasta que se desarrolle un color azul. Detenga la reacción TMB con 50 μL de la solución de parada.</li>
		<li>En un lector de placas, lea la absorbancia de cada pozo a una longitud de onda de 450 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para medir la concentración total de proteínas, registre la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm (A280)de cada fracción, utilizando un espectrofotómetro UV-vis.</li>
</ol>Un esquema del protocolo se muestra en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62429/62429fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del procedimiento SEC. La columna se empaqueta con un medio de filtración de gel desgasificado cuidadosamente para evitar burbujas y discontinuidades, luego se lava con dos volúmenes de columna de tampón de elución. A continuación, la muestra se pipetea cuidadosamente en la parte superior del gel, sin interrumpir el embalaje del gel. La columna se abre y se ejecuta hasta que la muestra entra completamente en el gel. En este punto, el búfer se coloca en la parte superior de la columna y se recogen los primeros 20 ml de eluido. A continuación, se recoge una serie de fracciones de 1 ml. Estas fracciones se colocan en una placa de 96 pozos o una placa de inmunoplaca de 96 pozos para el análisis del contenido de lípidos y proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62429/62429fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que informar.

Aquí, hemos proporcionado un protocolo para la separación simple, rápida y reproducible de subpoblaciones bacterianas omv. Aunque la técnica es relativamente sencilla, hay algunos pasos que deben realizarse con mucho cuidado para garantizar que se produzca una separación eficiente en la columna. En primer lugar, es esencial que el gel se cargue en la columna con cuidado y lentamente para evitar burbujas de aire. Hemos observado que dejar el gel a temperatura ambiente durante varias horas antes de cargar la columna permit...

Las bacterias gramnegativas liberan vesículas derivadas de su membrana externa, las llamadas vesículas de membrana externa (OMV), a lo largo del crecimiento. Estos OMV desempeñan un papel importante en la comunicación de célula a célula, tanto entre las bacterias y el huésped como entre las células bacterianas, al transportar una serie de biomoléculas importantes, incluyendo ADN / ARN, proteínas, lípidos y peptidoglicanos1,2. En particular, el papel de los OMV en la patogénesis bacteriana ha sido ampliamente estudiado debido a su enriquecimiento en ciertos factores de virulencia y toxinas3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Se ha informado que los OMV varían en tamaño de 20 a 450 nm, dependiendo de la bacteria madre y la etapa de crecimiento, con varios tipos de bacterias que liberan OMVde tamaño heterogéneo8,12, 13,14,que también difieren en su composición proteica y mecanismo de entrada de la célula huésped12. H. pylori liberó OMVs que varían en diámetro de 20 a 450 nm, con los OMVs más pequeños que contienen una composición de proteínas más homogénea que los OMVs más grandes. Es importante destacar que se observó que las dos poblaciones de OMVs eran internalizadas por las células huésped a través de diferentes mecanismos12. Además, hemos demostrado que Aggregatibacter actinomycetemcomitans libera una población de OMV pequeños (<150 nm) junto con una población de OMV grandes (>350 nm), con los OMV que contienen una cantidad significativa de una toxina proteica secretada, leucotoxina (LtxA)15. Si bien el papel de la heterogeneidad omv en los procesos celulares es claramente importante, las dificultades técnicas para separar y analizar distintas poblaciones de vesículas han limitado estos estudios.
Además de su importancia en la patogénesis bacteriana, se han propuesto OMV para su uso en una serie de aplicaciones biotecnológicas, incluso como vacunas y vehículos de administración de medicamentos16,17,18,19,20. Para su uso traslacional en tales enfoques, se requiere una preparación limpia y monodispersa de vesículas. Por lo tanto, son necesarios métodos efectivos y eficientes de separación.
Más comúnmente, la centrifugación por gradiente de densidad (DGC) se utiliza para separar poblaciones de vesículas de tamaño heterogéneo de los desechos celulares, incluidos los flagelos y las proteínas secretadas21; el método también se ha reportado como un enfoque para separar subpoblaciones omv de tamaño heterogéneo12,13,14. Sin embargo, DGC consume mucho tiempo, es ineficiente y muy variable de usuario a usuario22 y, por lo tanto, no es ideal para escalar verticalmente. Por el contrario, la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) representa un enfoque escalable, eficiente y consistente para purificar OMVs21,23,24. Hemos encontrado que una columna SEC larga (50 cm), de flujo por gravedad, llena de medio de filtración de gel es suficiente para purificar y separar eficientemente las subpoblaciones de OMV. Específicamente, utilizamos este enfoque para separar los OMV de A. actinomycetemcomitans en subpoblaciones "grandes" y "pequeñas", así como para eliminar la contaminación de proteínas y ADN. La purificación se completó en menos de 4 h, y se logró la separación completa de las subpoblaciones de OMV y la eliminación de escombros.

<table><tbody><tr><td>Filtros Ultra TMB-ELISA de 1 paso</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 50 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Immuno Placas</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Thermo Scientific</td><td>T13320</td><td>1,5 x 50 cm</td></tr><tr><td>Vidrio Econo-Columna BioRad</td><td></td><td>7371552</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 Pro Lector de Placas</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Potasio (KCl)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0395-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potasio Monobásico Anhidro (KH2PO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>0497-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20</td><td>Acros Organics</td><td>23336-2500</td><td></td></tr></tbody></table>

cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

La pared celular de las bacterias Gram-negativas consiste en una membrana interna (citoplasmática) y externa (OM), separadas por una fina capa de peptidoglicano. A lo largo del crecimiento, la membrana externa puede sangrar para formar vesículas esféricas de la membrana externa (OMV). Estos OMV están involucrados en numerosas funciones celulares, incluida la entrega de carga a las células huésped y la comunicación con las células bacterianas. Recientemente, el potencial terapéutico de los OMV ha comenzado a ser explorado, incluyendo su uso como vacunas y vehículos de administración de medicamentos. Aunque los OMV se derivan del OM, durante mucho tiempo se ha apreciado que la carga de lípidos y proteínas del OMV difiere, a menudo significativamente, de la del OM. Más recientemente, se ha descubierto evidencia de que las bacterias pueden liberar múltiples tipos de OMV, y existe evidencia de que el tamaño puede afectar el mecanismo de su absorción por las células huésped. Sin embargo, los estudios en esta área están limitados por las dificultades para separar eficientemente los OMV de tamaño heterogéneo. La centrifugación por gradiente de densidad (DGC) se ha utilizado tradicionalmente para este propósito; sin embargo, esta técnica requiere mucho tiempo y es difícil de ampliar. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), por otro lado, es menos engorrosa y se presta a la escala futura necesaria para el uso terapéutico de omV. Aquí, describimos un enfoque SEC que permite la separación reproducible de vesículas de tamaño heterogéneo, utilizando como caso de prueba, OMVs producidos por Aggregatibacter actinomycetemcomitans, que varían en diámetro desde menos de 150 nm hasta más de 350 nm. Demostramos la separación de OMV "grandes" (350 nm) y OMV "pequeños" (<150 nm), verificados por dispersión dinámica de luz (DLS). Recomendamos las técnicas basadas en SEC sobre las técnicas basadas en DGC para la separación de vesículas de tamaño heterogéneo debido a su facilidad de uso, reproducibilidad (incluido el usuario a usuario) y la posibilidad de escalar.

La Figura 2 muestra resultados representativos de este método. Los OMV producidos por A. actinomycetemcomitans cepa JP2 se purificaron por primera vez a partir del sobrenadante de cultivo utilizando ultracentrifugación15. Anteriormente encontramos que esta cepa produce dos poblaciones de OMVs, una con diámetros de unos 300 nm y otra con diámetros de unos 100 nm15. Para separar estas poblaciones de OMV, purificamos la muestra utilizando...

Las vesículas bacterianas desempeñan un papel importante en la patogénesis y tienen aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La heterogeneidad de las vesículas complica el análisis y el uso; por lo tanto, es necesario un método simple y reproducible para separar los diferentes tamaños de vesículas. Aquí, demostramos el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas heterogéneas producidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

La cromatografía de exclusión de tamaño es un enfoque útil para separar las subpoblaciones de vesículas bacterianas de tamaño heterogéneo y para eliminar ácidos nucleicos y proteínas de sobrenadantes bacterianos. La cromatografía de exclusión de tamaño es menos costosa, más rápida y más reproducible que otras técnicas de separación, incluida la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Hemos demostrado el potencial de este enfoque utilizando vesículas de A.actinomycetemcomitans, pero esperamos que también pueda aplicarse a otras poblaciones de vesículas bacterianas de tamaño heterogéneo.Asegúrese de desgascarar adecuadamente todas las soluciones tampón y de perlas y de pipetear la solución lentamente sin introducir burbujas, pero lo suficientemente rápido como para que las perlas se empaquetan de manera homogénea sin secarse. Para comenzar, use una varilla de vidrio para mezclar una botella de material de medio de filtración de gel y vierta el volumen requerido para llenar la columna más aproximadamente el 50% de exceso en una botella de vidrio. Deje que las perlas se asienten y decanten el exceso de líquido.Resuspend las perlas en tampón de elución a una solución final de aproximadamente 70% de gel y 30% de tampón y desgasifica la solución al vacío. Monte la columna en un soporte de anillo en la posición vertical y llene la columna con tampón de elución para humedecer las paredes antes de drenar el tampón hasta que solo quede aproximadamente un centímetro. Luego, pipetee cuidadosamente las perlas de gel en la columna mientras drena simultáneamente el exceso de tampón para evitar que las perlas se asienten hasta que la columna se empaquete a una altura de aproximadamente dos centímetros por debajo de la parte inferior del depósito de la columna.Antes de cargar la muestra, desgasifa el tampón de elución al vacío. Lave la columna con aproximadamente dos veces el volumen de columna del búfer de elución. Una vez que el tampón llegue a la parte superior de la capa de gel, agregue cuidadosamente dos mililitros de una muestra de vesícula de membrana externa de 100 a 200 nanomolares por litro en la parte superior de la capa de gel sin perturbar la superficie y deje que la muestra ingrese al gel.Agregue lentamente el tampón de elución a la columna sin perturbar la capa de gel y coloque un tubo de 50 mililitros debajo de la columna. Para evitar que la columna se seque, agregue simultáneamente un tampón de elución a la parte superior de la columna. Después de recolectar 20 mililitros de eluado, coloque un estante de tubos de 1.5 mililitros debajo de la columna.Recoge un total de 96 fracciones de un mililitro en cada tubo. Mientras recolecta las muestras, agregue continuamente un búfer de elución a la columna. Para limpiar la columna, ejecute un volumen de columna de hidróxido de sodio molar 0.1 a través de la columna seguido de dos volúmenes de columna de tampón de elución.Para medir las concentraciones de lípidos, pipetee 50 microlitros de cada fracción en una placa de 96 pozos. Agregue 2.5 microlitros de tinte lipofílico a cada pozo. Después de 15 segundos, mida la intensidad de la florescencia.Para medir la concentración de una proteína de interés, agregue 100 microlitros de cada fracción en los pozos individuales de una placa de inmuno ELISA. Después de tres horas a 25 grados centígrados, decantar el contenido de la placa. Lave la placa cinco veces con 200 microlitros de tampón de lavado ELISA por lavado decantando la placa después de cada lavado.Agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pozo durante una incubación de una hora a 25 grados centígrados. Al final de la incubación, decantar la placa y agregar 100 microlitros de anticuerpo primario en tampón de bloqueo para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, decantar la placa y lavar la placa cinco veces con tampón de lavado ELISA como se demuestra.Después del último lavado, agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario en tampón de lavado ELISA a cada pozo durante una incubación de una hora a 25 grados centígrados. Al final de la incubación, lave la placa como se ha demostrado y agregue 100 microlitros de solución TMB a cada pozo durante una incubación de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando se desarrolle un color azul, agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pozo y mida la absorbancia a 450 nanómetros.Después de la purificación de la columna de exclusión de tamaño de un sobrenadante de cultivo de A.actinomycetemcomitans como se demostró, se observaron dos picos lipídicos distintos, correspondientes a las vesículas de membrana externa grandes y pequeñas producidas por esta cepa. El análisis ELISA de las fracciones de la muestra reveló que la toxina se asocia principalmente con la subpoblación de grandes vesículas de membrana externa. El análisis de immuno blot dio resultados similares pero más ruidosos, lo que indica que este enfoque es menos sensible que el ELISA.Como se ha observado, esta técnica de cromatografía es capaz de eliminar cantidades significativas de proteínas libres de las preparaciones de las vesículas de la membrana externa. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la concentración total de proteínas no necesariamente se correlaciona con la concentración de proteínas específicas. Es importante tener mucho cuidado durante el embalaje y el funcionamiento de la columna para evitar burbujas y evitar que la columna se seque.La dispersión dinámica de la luz, el seguimiento de partículas y la bicroscopia se pueden realizar después de la cromatografía de exclusión de tamaño para determinar el tamaño y otras características de las vesículas de membrana externa separadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos.

Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Fuente: Watson, D. C., et al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño con perlas de resina porosa para aislar vesículas extracelulares (EV) bacterianas de un filtrado de cultivo bacteriano. Los EV más grandes eluyen temprano al evitar los poros de la resina, mientras que las proteínas más pequeñas ingresan a los poros y se eluyen más tarde.

Aislamiento de vesículas extracelulares bacterianas mediante cromatografía de exclusión por tamaño 

En este video, demostramos una técnica, la cromatografía de exclusión por tamaño, para separar una población heterogénea de vesículas de membrana externa o OMV derivadas de bacterias. Estas vesículas son estructuras esféricas de tamaño nanométrico y se separan en subpoblaciones grandes y pequeñas en función de su tamaño mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Separación de vesículas extracelulares bacterianas basadas en cromatografía de exclusión por tamaño: una técnica para separar poblaciones heterogéneas de vesículas de membrana externa bacterianas gramnegativas en función de su tamaño

En este video, demostramos una técnica de cromatografía de exclusión por tamaño de detección de fluorescencia para detectar la estabilidad de la proteína de membrana fusionada con proteína fluorescente verde (GFP) en Escherichia coli después de la solubilización con detergente. Las proteínas que exhiben un pico simétrico en el perfil de exclusión por tamaño con poca o ninguna GFP libre indican proteínas purificadas con una degradación y agregación mínimas, que posteriormente se pueden...

Cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia: una técnica para identificar la integridad de las proteínas de membrana fluorescentes tras la solubilización con detergente

Este video muestra la técnica de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para purificar vesículas extracelulares (EV) bacterianas del filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La técnica utiliza una columna porosa empaquetada de resina para obtener fracciones purificadas de EV. Las partículas porosas permiten selectivamente que las proteínas más pequeñas entren en los poros, lo que resulta en una elución más lenta. Al mismo tiempo, los EV están excluidos de entrar en los...

Una técnica de cromatografía de exclusión por tamaño para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento, la concentración y la caracterización de vesículas extracelulares de cultivos de cianobacterias. También se discuten los enfoques para purificar vesículas de cultivos a diferentes escalas, las compensaciones entre metodologías y las consideraciones para trabajar con muestras de campo.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

El protocolo aquí demuestra que las vesículas extracelulares pueden separarse adecuadamente de los medios de cultivo celular condicionados utilizando cromatografía de exclusión de tamaño.

Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende a utilizar la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas bacterianas heterogéneas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Este método eficiente elimina ácidos nucleicos y proteínas, ofreciendo una técnica reproducible para el análisis de vesículas de membrana externa.

Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

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