Uso del colorante fluorescente, rodamina B, para estudiar la competitividad del apareamiento en mosquitos machos Aedes aegypti

Este protocolo mide la competitividad del apareamiento de mosquitos machos, que es un requisito previo para los programas de supresión de la población de mosquitos basados en la liberación de machos. Este criterio de aptitud se evalúa como parte del control de calidad y la evaluación de la cepa. Este método reduce el tiempo experimental en un 90% y permite la comparación directa de la competitividad del apareamiento entre dos líneas estériles o infectadas por Wolbachia.

Realizando este procedimiento estarán Irene Li y Keng Wai Mak. Para comenzar, sexe a los mosquitos machos y hembras en la etapa pupal, de acuerdo con sus diferencias de tamaño. Para cada grupo de mosquitos, transfiera 100 pupas macho a una jaula preetiqueta para la alimentación con sacarosa o la alimentación con sacarosa Rhodamine B.

Coloque las pupas hembra en pequeños lotes de 40 a 50 por jaula. Tras la aparición de las imagos, revise las jaulas para detectar la presencia de mosquitos machos. Para preparar la solución de sacarosa de rodamina B al 0,2%, disuelva 200 miligramos de polvo de rodamina B por cada 100 mililitros de solución de sacarosa al 10%.

Mezclar bien para asegurarse de que todo el polvo se disuelva. Prepare 20 botellas de comedero de azúcar con una mecha. Agregue 10 mililitros de sacarosa al 10% a 10 botellas de alimentación y 10 mililitros de solución de sacarosa de rodamina B al 0,2% para las otras 10 botellas de alimentación.

Coloque cinco biberones de alimentación en cada jaula masculina preparada y permita que los mosquitos machos se alimenten durante tres días antes del experimento de apareamiento. Encienda la lámpara del quemador de mercurio y el microscopio estereoscópico. Permita que la fuente de luz de la lámpara del quemador de mercurio se estabilice durante 10 minutos.

Luego configure los filtros de fluorescencia para la proteína de fluorescencia roja uno. Aspire un pequeño número de mosquitos a la vez en el tubo de vidrio del aspirador oral. A través del tubo de vidrio, observe el cuerpo de los mosquitos machos bajo el microscopio estéreo fluorescente.

Use solo mosquitos machos marcados con rodamina B para el experimento. Transfiera el conjunto A mosquitos machos a 12 vasos de papel asegurados con redes. Coloque 10 mosquitos machos alimentados con sacarosa por taza en seis tazas, y 10 mosquitos machos alimentados con sacarosa rhodamine B por taza en las otras seis tazas.

Repita este paso para los mosquitos machos B establecidos. Establezca 12 jaulas para el ensayo de apareamiento. En cada una de las seis jaulas, incluya 10 mosquitos machos A que tienen marcado Rhodamine B, 10 mosquitos machos B no marcados y 10 mosquitos hembra vírgenes de tipo silvestre.

En las otras seis jaulas, se incluyen 10 mosquitos machos A sin marcar, 10 mosquitos machos de Rhodamine B marcados con B y 10 mosquitos hembra vírgenes de tipo silvestre. Etiquete estas jaulas para distinguir claramente entre las dos combinaciones de apareamiento. Coloque las respectivas copas de los machos en las jaulas de apareamiento de acuerdo con las etiquetas.

Retire la red y golpee suavemente la taza para empujar a los machos fuera de la taza. Retire con cuidado el vaso de papel y la red de la jaula para asegurarse de que no se escapen mosquitos de la jaula. Permita que los mosquitos machos se aclimaten en la jaula de apareamiento durante al menos una hora.

Usando un aspirador oral, transfiera mosquitos hembra vírgenes de tipo silvestre a 12 vasos de papel, cada taza contiene 10 mosquitos. Después del período de aclimatación para los mosquitos machos, transfiera una taza de hembras a cada jaula de apareamiento y retire la red. Empuje suavemente la taza para alentar a los mosquitos hembra restantes a salir de la taza, luego retire cuidadosamente el vaso de papel y la red de la jaula para asegurarse de que ningún mosquito escape de la jaula.

Permita que el apareamiento tenga lugar durante tres horas y luego termine el experimento de apareamiento eliminando todos los mosquitos de cada jaula con un aspirador mecánico. Anestesiar en frío a los mosquitos en hielo durante al menos cinco minutos. Cuando los mosquitos estén completamente anestesiados, recoja suavemente a los mosquitos hembra y acomótelos en un vaso de papel separado asegurado con una red.

Etiquete el vaso de papel transfiriendo la etiqueta respectiva de la jaula de apareamiento a la taza. Para puntuar la espermateca femenina, anestesiar en frío a los mosquitos hembra en hielo durante al menos cinco minutos antes de la disección bajo un microscopio estereoscópico. Diseccionar el mosquito hembra bajo el microscopio estereoscópico.

Examine las espermatecas bajo el microscopio. Si la hembra no está inseminada, las tres espermatecas estarían vacías, y si se inseminan, dos o tres de las espermatecas se llenarían con espermatozoides móviles. Para los individuos inseminados, determine si las espermatecas contienen líquido seminal marcado con rodamina B examinándolas bajo el microscopio estéreo fluorescente equipado con un filtro RFP1.

Si la espermateca está llena de líquido seminal que no está marcado con rodamina B, no se observa fluorescencia. Por otro lado, si la espermateca contiene líquido seminal marcado con rodamina B, fluoresce naranja. El objetivo de este ensayo de competitividad de apareamiento fue determinar si podría haber una pérdida en la aptitud de apareamiento masculino después de varias generaciones de endogamia.

Se realizaron triplicados experimentales del ensayo de competitividad de apareamiento, y los datos de inseminación se muestran aquí. Las hembras de tipo salvaje fueron inseminadas por los machos endogámicos o cruzados, con marcas recíprocas. Los resultados muestran que la proporción de hembras inseminadas por los machos endogámicos o cruzados no se vio afectada por la marca Rhodamine B.

Un porcentaje significativamente mayor de hembras se aparearon con los machos cruzados que con los machos endogámicos en los tres replicantes, lo que indica que la endogamia podría conducir a la pérdida de la aptitud de apareamiento. Es importante preparar jaulas adicionales de mosquitos hembra. No use mosquitos hembra de una jaula que haya sido contaminada por mosquitos machos, ya que las hembras preinseminadas harían que todos los datos no sean válidos.

Aparte del ensayo de competitividad de apareamiento basado en laboratorio, este procedimiento se puede utilizar en experimentos de liberación y recaptura de marcas para estudiar la biología del apareamiento de insectos, la dinámica de la población y su dispersión.