Análisis cuantitativo basado en microscopía de escaneo láser confocal de la distribución de conidios de Aspergillus fumigatus en pulmón de ratón ópticamente despejado de montaje entero

Nuestro enfoque nos permite realizar el análisis cuantitativo de una distribución de Aspergillus fumigatus Conidia en pulmón de ratón de montaje entero ópticamente despejado. Aspergillus fumigatus Conidia puede penetrar en el tracto respiratorio y causar enfermedades potencialmente mortales en pacientes inmunocomprometidos. El tracto respiratorio de los mamíferos es un sistema de vías respiratorias de diferentes generaciones.

Cada generación se caracteriza por las diferentes estructuras de las paredes de las vías respiratorias y las poblaciones de células inmunes. En las ramas bronquiales, aspergillus fumigatus Conidia se elimina por aclaramiento mucociliar. Sin embargo, en el espacio disponible, el aclaramiento mucociliar no funciona y los conidios deben ser eliminados por las células inmunes, como los macrófagos alveolares y los neutrófilos.

Al igual que los aspectos espaciales temporales de la distribución de los conidios en las vías respiratorias son importantes. Sin embargo, no se investigó adecuadamente la cuestión en la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Aquí presentamos una configuración experimental para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus Conidia en las vías respiratorias de ratones infectados.

Aplico 50 microlitros de Aspergillus fumigatus Conidia etiquetado al ratón. Seis horas después, cosecha el pulmón. Fijar durante la noche en 2% formaldehído y manchar con el conjugado de estreptavidina etiquetado.

A continuación, somete la muestra al despeje óptico. Coloque la muestra en la botella de vidrio llena con una solución de agua de metanol al 50% y colóquela en el mezclador de muestras a temperatura ambiente durante una hora. Reemplace el 50% de metanol con 100% de metanol y colócelo debajo del mezclador de muestras durante dos horas.

Prepare una mezcla que consista en una parte de alcohol bencílico y dos partes de benzoato de bencilo. Transfiera la muestra a la placa de 24 pozos y cúbrala con la mezcla de bencilo-benzoato durante al menos 30 minutos. La muestra está lista para la obtención de imágenes.

Coloca la muestra en el soporte de la muestra. Y coloque el soporte en el microscopio. Después de encender el sistema de microscopio y abrir el software, encienda la luz de transmisión y seleccione un objetivo X.

Ubique visualmente su muestra en la luz de transmisión y proceda a la pestaña de adquisición. Seleccione el modo Lambda de microscopía láser confocal. Encienda los láseres apropiados.

Establezca el rango espectral del detector y seleccione el espejo dicroico. Ajuste la ganancia del detector y estreche el agujero de alfiler a una unidad de área. Establezca la resolución de píxeles en 512 por 512.

Encienda el modo zed-stack e inicie la creación de imágenes en vivo. Encuentra el plano focal donde ambos dados son visibles. Expanda el panel zed-stack.

Usando la rueda de enfoque, busque y seleccione los planos más bajo y más alto de la muestra. Coloque el plano focal junto a la parte inferior de la muestra. Desactive el modo zed-stack y active el modo de escaneo de marcado.

Si es necesario, ajuste la posición X, Y y el número de mosaicos. Active los modos de escaneo zed-stack y dial. Establezca el paso de seccionamiento zed en cinco micras.

Establezca la velocidad de escaneo. Comience el experimento. Las imágenes suelen tardar varias horas dependiendo del tamaño de la tierra y la velocidad de escaneo.

La imagen obtenida se desmezcla espectralmente. Para la desmezcla espectral, utilice la opción de desmezcla lineal. Seleccione las regiones correspondientes a las áreas de tierra etiquetadas con estreptavidina y conidios.

Comience a desmezclar. Después de desmezclar, guarde el archivo sin mezclar. Para guisar los mosaicos de la imagen obtenida, abra la imagen.

Seleccionar métodos, costura geométrica. Seleccione la imagen en la ventana de entrada. En opciones de costura, seleccione la nueva opción de salida y fusionar mosaicos.

Utilice el modo de referencia con el canal seleccionado correspondiente a la fluorescencia de las vías respiratorias. Abra la imagen en una vista 3D excedente. Si es necesario, cambie los colores utilizados para su presentación.

Aquí mostramos el canal de las vías respiratorias en tonos grises y el canal de Conidia en púrpura. Para crear una máscara de las vías respiratorias, utilice la herramienta Agregar nueva superficie. Seleccione el canal de las vías respiratorias y elija el parámetro de suavizado de 10 micras.

Se pueden usar varios filtros para excluir la señal de las vías respiratorias. Primero, inspeccione visualmente la superficie y establezca el umbral de intensidad. También se pueden aplicar filtros adicionales, como el área de superficie, exclusivamente para seleccionar las vías respiratorias, pero no para la pleura o los vasos sanguíneos.

A continuación, elimine manualmente el fragmento de superficie seleccionado que no pertenezca a las vías respiratorias. Ahora puede observar la superficie creada e investigar las partes faltantes para corregirlas más adelante. Cree una máscara para la superficie de las vías respiratorias con las opciones de edición y enmascaración de todo.

Seleccione el canal de las vías respiratorias y establezca las celdas de trabajo fuera de la superficie en 0,001. Aquí mostramos la máscara resultante en naranja. Guarde el canal Conidia y la máscara de las vías respiratorias en dos carpetas separadas, como serie T de F.

Abra el archivo con la imagen de la máscara de las vías respiratorias. Hacer que la imagen sea binaria. Siga el proceso binario, haga binario.

Para parecerse al grosor de la máscara, aplique varias funciones de dilatación 3D. Siga los complementos, procese, dilate 3D. También puede utilizar la funcionalidad de macros para hacer esto.

Después de varios ciclos de proceso de dilatado, use la función de relleno de agujeros. Siga el proceso, binario, llene agujeros. Para rellenar manualmente los orificios residuales de la máscara, abra el administrador de región de interés.

seguir análisis, herramientas, gestor de ROI. Usando la herramienta de selección de polígonos, seleccione un área que debe rellenarse en una proyección en particular. Haga esto varias veces para pocas proyecciones en zed-stack para que pueda interpolar formas de las regiones de interés.

Para interpolar las formas seleccionadas, selecciónelas todas y presione más, interpolar ROI. A continuación, rellene todos los ROI de blanco. Utilice el procedimiento de relleno de agujeros una vez más.

Para volver a montar el grosor de la máscara después de rellenar los agujeros, aplique la función erosionar 3D. Siga los complementos, procese, erosione 3D. También puedes usar micros para esto.

El número de iteraciones en erode 3D y LA 3D debe ser igual. Inicie la aplicación de recuento de conidios. Pulse el botón Añadir archivos y seleccione las carpetas con archivos DIFF con la máscara de vías respiratorias preparada y las imágenes de fluorescencia de Conidia.

Establezca un umbral personalizado entre cero y uno. Pulse OK y vea los resultados. Utilizando este enfoque, realizamos el análisis cuantitativo de los Conidios dentro y fuera del árbol bronquial de ratones seis horas después de la aplicación de Conidios.

Los datos sugieren que en nuestra aplicación original, la mayoría de los conidios penetran en el espacio de la alveola y se asignan allí al comienzo de la respuesta inmune inflamatoria. La obtención de imágenes tridimensionales de los pulmones del ratón con microscopía de barrido láser confocal permite la identificación de Aspergillus fumigatus Conidia en las vías respiratorias. El procesamiento de imágenes tridimensionales utilizando este protocolo permite realizar análisis cuantitativos de la distribución de Conidia dentro y fuera de las ramas bronquiales.

Nuestro enfoque también se puede utilizar para estimar la cinética de la eliminación de Conidios de los ratones y para comparar la distribución anatómica de conidios en los ratones inmunocompetentes e inmunocomprometidos. Además, utilizando este enfoque, se puede analizar la distribución de las micropartículas o nano partículas aglomerados en las vías respiratorias.