Name: Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Aprende a establecer y manipular genéticamente organoides de hepatocitos murinos mediante técnicas de cultivo 3D, transfección de siRNA e infección con lentivirus. Este método permite estudiar biología hepática y desarrollar aplicaciones terapéuticas.

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Agradecemos al profesor Hans Clevers por proporcionar amablemente las líneas celulares para producir R-spondin1 recombinante. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Programa Nacional Clave de I + D de China (2019YFA0111400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31970779) a H.H., y los Fondos para la Juventud Interdisciplinaria y el Grupo de Investigación de Innovación de la Universidad de Shandong (2020QNQT003) a H.H.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad de Shandong y se llevaron a cabo de acuerdo con la Licencia bajo las pautas y regulaciones del Ministerio del Interior (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOTA: Este protocolo se utiliza principalmente para cultivar organoides 3D a partir de hepatocitos primarios aislados.
1. Establecimiento del cultivo de organoides de hepatocitos murinos
NOTA: La matriz extracelular como Matrigel o BME se utilizan como matriz de sótano para cultivar organoides. Almacene la matriz extracelular a -20 °C y descongele previamente a 4 °C o sobre hielo. Mantenga la matriz extracelular en hielo durante los experimentos. El medio de lavado es Advanced DMEM/F12 suplementado con GlutaMAX, HEPES y penicilina/estreptomicina. Se utiliza una incubadora estándar (37 °C, atmósfera humidificada, 5% de CO2) para el cultivo de organoides.
<ol><li>Preparación de materiales<ol>
<li>Prepare los instrumentos necesarios para el experimento: la almohada del ratón, instrumentos quirúrgicos estériles como pinzas, tijeras, tubos y una bomba con un caudal de 2-10 ml / min.</li>
		<li>Prepare los reactivos, incluido el tampón de perfusión, el tampón de digestión y hágalos estériles para el aislamiento de hepatocitos. Añadir colagenasa tipo IV fresca (0,10 mg/ml) y CaCl2 (0,50 M) y precalentar el tampón a 37 °C en un baño de agua.</li>
		<li>Prepare el medio condicional para producir R-spondina 1 y todas las existencias químicas y de factor de crecimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: Evite congelar y descongelar con frecuencia el medio condicional y las existencias. Preparar el medio de cultivo fresco y utilizarlo en el plazo de un mes. Esto es fundamental para la eficiencia de la formación de organoides.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de hepatocitos murinos por perfusión hepática y digestión NOTA: Se utilizaron ratones machos o hembras entre las edades de 12 semanas y 6 meses para el cultivo de organoides. No se encontraron diferencias obvias en la eficiencia de la formación de organoides con respecto a la edad del ratón donante dentro de este rango.<ol>
<li>Sacrificar al ratón con un método éticamente aprobado.</li>
		<li>Fije el ratón en la almohada del ratón y limpie el pelaje abdominal y la piel con un 70% de alcohol. Exponga el abdomen y levante el hígado por encima del resto del cuerpo. Haga una incisión en la línea media para exponer el hígado.</li>
		<li>Llene el tubo conectado a la bomba con tampón de perfusión. Haga una incisión de la vena porta (aproximadamente 1/3 del diámetro de la vena) y coloque cuidadosamente un catéter en ella. Levante los órganos digestivos para ayudar a insertar la cánula. Un lazo con la línea quirúrgica es opcional para evitar deslizarse y romperse.</li>
		<li>Arranque la bomba y realice la perfusión a un caudal de 5-7 ml/min con tampón de perfusión. Si el hígado se pone pálido inmediatamente, corte la vena cava inferior para permitir que el tampón de perfusión fluya a través de todo el hígado y expulse la sangre.</li>
		<li>Cuando el flujo de salida se limpie, retire la cánula. Tarda unos 5-10 minutos.</li>
		<li>Cambie el tampón de perfusión con el tampón de digestión precalentado a una velocidad de 5 ml / min. No detenga la bomba hasta que el hígado se vuelva blando e hinchado. Retire el catéter cuando el hígado deje de hincharse. NOTA: Es muy importante mantener un tiempo de digestión adecuado para evitar la digestión excesiva y obtener células hepáticas individuales.</li>
		<li>Cortar el hígado y colocarlo en una placa de 100 mm llena de 15 ml de medio de lavado en frío. Corta los ligamentos con tijeras pequeñas. Rompa el hígado en pedazos con puntas de pipeta o fórceps.</li>
		<li>Pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para liberar las células hasta que el tampón esté saturado de células (12-15 veces). Vierta la suspensión celular en un tubo de 50 ml a través de filtros de 70 μm.</li>
		<li>Centrifugar durante 1-3 minutos a 50 x g y 4 °C. Decantar el sobrenadante. Opcionalmente, resuspend las células con medio de lavado o resuspend las células con medio de cultivo directamente. Cuente las células con un hemacitómetro.</li>
		<li>Distinguir las células vivas o muertas por la máquina de contador de células después de la tinción de tinte de células vivas. NOTA: Lo mejor es purificar los hepatocitos usando Percoll frío al 40%. Después de este paso, los hepatocitos viables estarán en la parte inferior de los tubos.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivo y paso organoide<ol>
<li>Retire el sobrenadante y resuspenda los hepatocitos con una mezcla de matriz extracelular y medio de cultivo en una proporción de 3:1. NOTA: Se recomiendan 10,000-20,000 células en una mezcla de 50-60 μL por pocillo para una placa de 24 pocillos. Es importante trabajar rápidamente y mantener la mezcla en hielo durante todo el proceso. Se podrían formar 200-500 organoides a esta concentración.</li>
		<li>Agregue la gota de célula / mezcla en la placa con gotas pequeñas para evitar que la gota se conecte entre sí. Incubar la placa en la incubadora celular a 37 °C, 5% co2 durante 5-10 min y luego sacar la placa durante 20-25 min hasta que la matriz extracelular se vuelva sólida.</li>
		<li>Agregue el medio de cultivo (500 μL por pocillo para una placa de 24 pocillos) en los pozos y devuelva la placa a la incubadora para el cultivo de organoides. Cambie el medio cada 3-4 días. Observe los organoides hasta que sean lo suficientemente grandes como para ser pasados. NOTA: Un diámetro con alrededor de 400-500 μm es adecuado para el paso de organoides hepatocitos.</li>
		<li>Aísle los organoides de la matriz extracelular con el proceso detallado a continuación. Sostenga una pipeta Pasteur de vidrio en una llama para reducir su apertura (en ~ 1/2). Pipetear mecánicamente hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces para disociar los organoides en organoides más pequeños durante el pasaje. NOTA: Durante el pasaje, prepare puntas y tubos de micropipeta prelavados con tampón de lavado de punta para evitar la pérdida de organoides que se adhieren a los tubos o puntas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Manipulación genética de organoides hepatocitos murinos
<ol><li>Células individuales de organoides de hepatocitos<ol>
<li>Agregue 500 μL de medio de lavado en frío/solución de recuperación celular a cada pozo. Pipete hacia arriba y hacia abajo para destruir la mezcla de matriz celular / extracelular con una micropipeta y luego transfiera la suspensión organoide a un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo. Opcionalmente, gire el tubo hacia arriba y hacia abajo de vez en cuando para descongelar la mezcla a fondo.</li>
		<li>Centrifugar durante 5 min a 500-800 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante. Agregue 1 ml de solución de tripsina al pellet y pipetearlo para mezclar. Incubar a 37 °C durante 5-10 min y luego detener la digestión agregando un volumen 2x de medio de lavado.</li>
		<li>Centrifugar durante 5 min a 800 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con medio de cultivo y cuente las células con un hemacitómetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>transfección de siRNA o plásmido NOTA: Los organoides más pequeños con un diámetro inferior a 50 μm o células individuales de organoides de hepatocitos se transfectan con siRNA utilizando lipofectamina o plásmidos que usan reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.<ol>
<li>Mezcle siRNA o plásmidos con reactivo de transfección. Agregue células individuales de organoides y la mezcla lipofectamina-ARN/lipoplasma (por ejemplo, RNAiMAX) en 1-2 pocillos en la placa de 24 pocillos y la centrífuga durante 1 h a 500 x g y 32 °C. Después de la centrifugación, incube la placa en la incubadora durante 4-5 h a 37 ° C.</li>
		<li>Recolectar las células y semillas en matriz extracelular con medio de cultivo a una concentración de 10.000 células por pozo. Cambie el medio a la condición de selección dos días después de la transfección. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infección lentiviral NOTA: Los organoides pequeños con un diámetro inferior a 50 μm o células individuales de organoides hepatocitos están infectados por lentivirus utilizando reactivos de infección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.<ol>
<li>Mezclar 250 μL de la suspensión unicelular del organoide y 250 μL de partículas virales en un tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Envasar la mezcla y centrifugar durante 1 h a 500 x g y 32 °C. Incubar durante 4-5 h a 37 °C.</li>
		<li>Recolectar las células y semillas en matriz extracelular con medio de cultivo. Cambie el medio a la condición de selección dos días después de la transfección. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ingeniería genética por CRISPR/Cas9 NOTA: Proporcionamos video para esta actuación en los materiales complementarios. Las células individuales de los organoides fueron infectadas con lentivirus o transfectadas por plásmidos portadores de sgRNA y Cas9.<ol>
<li>Digiera células individuales de organoides de hepatocitos cultivados y pase de acuerdo con el método anterior.</li>
		<li>Infectar células individuales con sgRNA utilizando medio Opti-MEM y reactivos de infección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Mezcle 250 μL de una suspensión unicelular y 250 μL de partículas virales en un tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla de 500 μL durante 1 h a 500 x g y 32 °C y luego incubar durante 4-5 h a 37 °C.</li>
		<li>Recoger la suspensión celular y la semilla en matriz extracelular. Evaluar la eficiencia de la formación de organoides después de 10 días.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li>
<li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+%2B+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li>
<li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li>
<li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li>
<li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li>
<li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
</ol>

Los autores no revelan conflictos.

La capacidad de cultivar hepatocitos maduros durante largos períodos es fundamental en el estudio de la ciencia básica del hígado, la toxicología de medicamentos y las infecciones hepatotrópicas de microbiología del huésped, como la malaria y los virus de la hepatitis. Con un nicho bien definido, el protocolo aquí establece un sistema de cultivo para hepatocitos. Este protocolo impulsa a los hepatocitos maduros a expandirse en cultivo 3D con una heterogeneidad que recapitula la interacción célula-célula, la función más h...

Los organoides son grupos in vitro autoorganizados, tridimensionales (3D) que incluyen células madre autorrenovantes y células diferenciadas multilinaje1,2. Los organoides de muchos órganos se han establecido a partir de células madre pluripotentes o adultas por factores de nicho bien definidos, incluidos el intestino, el cerebro, el colon, el riñón, el hígado, el páncreas, la tiroides, el estómago, la piel y el pulmón3,4,5,6,7 . Los organoides recapitulan las funciones de las células físicas imitando el desarrollo (originado a partir de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, PSC) o la progresión de la homeostasis/regeneración (originada a partir de células madre adultas, ASC), lo que abre nuevas vías en la investigación y terapia de enfermedades8,9.
Como el órgano más grande en los mamíferos, el hígado es principalmente responsable del almacenamiento, el metabolismo y la desintoxicación. Dos tipos de tipos de células epiteliales, los hepatocitos y los colangiocitos, construyen la unidad básica de un lóbulo hepático. Los hepatocitos son responsables del 70-80% de la función hepática10. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración, la rápida pérdida de las características de los hepatocitos ocurre durante el cultivo monocapa tradicional por polarización y desdiferenciación celular desregulada, lo que aumenta la necesidad de investigadores y médicos de construir modelos hepáticos de "puente de brecha" en un plato. Sin embargo, hasta hace poco los modelos de expansión ex vivo de los hepatocitos primarios no estaban bien establecidos11,12,13,14,15. Los organoides hepáticos se pueden establecer a partir de células madre pluripotentes embrionarias / inducidas, conversión de fibroblastos en células similares a hepatocitos y células derivadas de tejidos. El desarrollo de organoides hepáticos impulsa la aplicación de un modelo in vitro para cribados farmacológicos y ensayos de toxicidad hepática16,17.
Aquí, describimos un protocolo detallado para establecer organoides hepáticos a partir de hepatocitos primarios murinos. Mediante el uso de este protocolo, establecimos un sistema de cultivo in vitro de organoides de hepatocitos con dos perfusiones de colagenasa. Estos organoides pueden ser pasados para la expansión a largo plazo durante meses. Su función fisiológica es altamente consistente con los hepatocitos. Además, también proporcionamos una descripción detallada de cómo realizar la manipulación genética, como la infección por lentivirus, la transducción de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9 utilizando organoides. La propagación de organoides de hepatocitos arrojó luz sobre la posibilidad de utilizar organoides para comprender la biología hepática y desarrollar enfoques de medicina personalizados y traslacionales.

<table><tbody><tr><td><tampón >perfusión fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sangon Bitech</td><td>A600077-0100</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100188-0500</td><td>9,00 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4,00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1.51 g/L</td></tr><tr><td></td><td>NaCl Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80.0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0,78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3,50 g/L</td></tr><tr><td>Fenol Rojo</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100882-0025</td><td>0,06 g/L</td></tr><tr><td><tampón>tampón ></td><td></td><td></td><td></td> digestión</</tr><tr><td>fuerteCaCl2</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501330-0005</td><td>0.50 M</td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Sigma</td><td>C1639</td><td>0.10 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Bitech</td><td>C621110-0010</td><td>23.80 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4.00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1.51 g/L</td></tr><tr><td></td><td>NaCl Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80.0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0.78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3.50 g/L</td></tr><tr><td>Tip-wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10091148</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C14190500BT0</td><td>almacena a 4 & grados; C</td></tr><tr><td><fuerte>Lavado Medio</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanzado DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Culture Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Concentración de existencias 500 &micro; M, concentración final 2 y micro; M</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>B-27 suplemento 50x, menos vitamina A</td><td>Gibco</td><td>1704-044</td><td>50 X</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>Concentración de existencias 30 mM, concentración final 3 &micro; M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>almacena a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Gastrin I</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td>Concentración de existencias 100 mM, concentración < > final 10</td></tr><tr><td>nM GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Matrigel martix</td><td>BD 356231</td><td></td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Concentración de existencias 500 mM, concentración final 1 mM</td></tr><tr><td>Nictinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Concentración de existencias 1 M, concentración final 3 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Concentración de existencias 100 &micro; g/ml,concentración final 50 ng/ml</td></tr><tr><td>humano recombinante FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26 concentración de</td><td>existencias 100 &micro; g/ml, concentración final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>HGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-39 Concentración de</td><td>existencias 100 y micro; g/ml, concentración final 25 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF-& alfa humano recombinante;</td><td>Peprotech</td><td>100-16A Concentración de</td><td>existencias 100 y micro; g/ml, concentración final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>TNF-y alfa humano recombinante;</td><td>Origene</td><td>TP750007-1000 Concentración de</td><td>existencias 100 &micro; g/ml, concentración final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Inhibidor de la Rho quinasa Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 diclorhidrato Concentración de</td><td>existencias 10 mM, concentración final 10 y micro; M</td></tr><tr><td>Medio acondicionado con rspondina-1</td><td>Línea celular estable generada</td><td></td><td></td> en el laboratorio de Hu. Concentración final 15%.</tr><tr><td><fuerte>Otros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 y micro; m filtro</td><td>Millipore SCGPT01RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 # tubo de silicona</td><td>LangerPump</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 pozo, suspensión</td><td>Greiner bio-one</td><td>GN662102-100EA</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Baño</td><td></td><td></td><td></td>de agua</tr><tr><td>70 &micro; m filtro</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>stemcell</td><td>AT-104</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Anti-CTNNB1</td><td>BD</td><td>610154</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>CST</td><td>5174S</td><td>Conejo</td></tr><tr><td>Anti-HDAC7</td><td>Abcam</td><td>ab50212</td><td>Ratón</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Conejo</td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Solución de recuperación</td> celular <td>Corning</td><td>354253</td><td>almacenado a las 4 &deg; </td></tr><tr><td>C Centrífuga 5430</td><td>eppendorf</td><td>542700097</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2</td><td>ESCO</td><td>AC2-4S1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp; A100231</td><td>almacenado en RT</td></tr><tr><td>EVOS FL Color Imaging Systems</td><td>Invitrogen</td><td>AME4300</td><td></td></tr><tr><td>Hdac3 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td><td>siG2003180909192555</td><td>almacena a -20 °C; C</td></tr><tr><td>Hdac7 lentivirus</td><td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td><td>LV2020-2364</td><td>almacenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Hitrans G A</td><td>Shanghai Genechem Co., Ltd.</td><td>REVG004</td><td>Aumento de la eficiencia de la infección por virus</td></tr><tr><td>Software Image Pro Plus</td><td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, EE. UU</td><td>. versión 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>Aumento de la eficiencia de la infección</td></tr> viral <tr><td>Tinte de células vivas</td><td>Luna</td><td>F23001</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Centrífuga de escritorio de baja velocidad</td><td>cence</td><td>TD5A-WS/TD5AWS</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofactor-&alpha; 2b Dispositivo</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco 31985070</td><td></td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Sangon Bitech</td><td>F621006-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>LangerPump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Activar con metanol</td></tr><tr><td>PX458</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>almacenado a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Thermo Scientific Heraeus</td><td>Labofuge 400</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A Concentración de</td><td>stock 10 mM, concentración final 4 &; M</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Gibico</td><td>25200072</td><td>almacena a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Wee1 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td><td>siG2003180909205971</td><td>almacena a -20 °C; C</td></tr></tbody></table>

establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel importante en el almacenamiento de glucosa, la secreción de proteínas, el metabolismo y la desintoxicación. Como ejecutor de la mayoría de las funciones hepáticas, los hepatocitos primarios tienen una capacidad de proliferación limitada. Esto requiere el establecimiento de modelos de expansión de hepatocitos ex vivo para la investigación fisiológica y patológica del hígado. Aquí, aislamos los hepatocitos murinos por dos pasos de perfusión de colagenasa y establecimos un cultivo de organoides 3D como el "mini-hígado" para recapitular las interacciones célula-célula y las funciones físicas. Los organoides consisten en poblaciones celulares heterogéneas que incluyen progenitores y hepatocitos maduros. Introducimos el proceso en detalle para aislar y cultivar los hepatocitos murinos o el hepatocito fetal para formar organoides en 2-3 semanas y mostrar cómo pasarlos canalizando mecánicamente hacia arriba y hacia abajo. Además, también presentaremos cómo digerir los organoides en células individuales para la infección por lentivirus de la construcción shRNA / ectópica, la transfección de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9. Los organoides se pueden utilizar para pruebas de detección de drogas, modelado de enfermedades e investigación hepática básica mediante el modelado de la biología hepática y la patobiología.

Los organoides hepatocitos de Alb-Cre femenino; Se observó ratón Rosa26-GFP (8 semanas) cinco días después de la siembra (Figura 1A). Los organoides están proliferando con tinción positiva de Ki67 (Figura 1B). La expresión interferente de genes representativos en organoides de hepatocitos, ya sea por transfección por siRNA o infección por lentivirus, se examinó mediante qRT-PCR y western blot. Los resultados se muestran en las Figuras 2A</st...

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel muy importante en el metabolismo y la desintoxicación. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración in vitro, sigue siendo un reto muy grande a largo plazo cultivar hepatocitos in vitro.Aquí, establecemos los organoides de los hepatocitos a partir de hepatocitos maduros. Mantiene las principales características de los hepatocitos en morfología y función. En este video, presentaremos cómo cultivar y pasar estos organoides y cómo realizar la modificación genética de estos organoides en detalle.Primero, la perfusión hepática y la digestión. Prepara todas las regiones y los instrumentos y hazlos estériles. Lave el ratón y abra el epidérmico y la piel, y luego trate de encontrar el horno de bolsa del hígado.Inyecte las agujas en él y luego capture esto. Haga la perfusión a la velocidad de cinco mililitros por minuto, hasta que el hígado se ponga pálido. Cámbielos en el tampón de perfusión, colóquelos con cuidado, observe el hígado, hasta que se ablande.Por lo general, toma de tres a cinco minutos, luego corte el hígado y póngalos en las placas, y córtelos en trozos pequeños con las tijeras. Pásalo hacia arriba y hacia abajo con frecuencia. Por lo general, toma de 10 a 15 minutos convertirlos en la celda única.Y luego animarlo hacia arriba y hacia abajo con 10 a 15 minutos y alimentarlos a través del instalador. Conviértelos en las celdas individuales. Recoge todas las células en el tubo de 50 mililitros, y centríbalas, con la velocidad y luego recoge todas las placas por placas.Trate de mantenerlos siempre en el hielo frío. Haga las suspensiones de una sola celda y cuéntelas con el contador de celdas. Por lo general, los hepatocitos si están contentos, tiene el fluorescente vivo.La segunda parte, tratamos de sentar las células y hacer el cultivo de organoides. Recogemos todas las suspensiones de células, y contamos las células con un cierto concentro-fusión Y luego mezclamos las. Metrogels. y el medio de código.Normalmente tomamos, con el medio y los metrogels, en la proporción de 1 a 2 o de 1 a 3. Después de mezclarlos cuidadosamente, los sentamos en las placas de gradiente. Por lo general, agregamos 100 microlitros en el pozo de 24 platos.Póngalos en la incubadora a la temperatura de 37 grados. Después de 20 minutos, los ponemos hacia adelante con la parte inferior en la parte inferior y luego en el medio. Con dos o tres días de contraataque, solemos ver salir los organoides.Esta es la imagen típica de nuestros organoides. Por lo general, necesitamos células individuales de organoides si queremos hacer el pasaje o hacer algún método de modificación genética Recogemos todos los organoides de las placas de contraataque con el tampón de lavado de pelaje. Dejamos caer el sobrenadante, luego en el tampón de lavado de la capa en el plato, los mezclamos, así que anímelo hacia arriba y hacia abajo.Y luego solemos prelavar todas las puntas con el tampón de cintas de lavado. Para evitar todos los organoides, inclíquese sobre las puntas. Y luego, con el, un nuevo lote sobre hielo o sin él, recogemos todos los organoides por centro-fusión.Los tratamos, hay un conducto para eliminar todos los metrogeles. Después de 20 a 30 minutos de incubación en hielo se retiran todos los metrogeles. Recolectamos todos los organoides limpios y agregamos tripsina para convertirlos en células individuales.Después de agregar tripsina, tratamos los organoides en la incubadora. Los organoides hepáticos tardan de 5 a 10 minutos en convertirse en células individuales. Agregamos más tampones de lavado para detener la triplatina.Y luego animarlo hacia arriba y hacia abajo hacia ellos. Para el proceso de opción, puede lavarlos una vez más para eliminar toda la tripsina. Después del lavado por centrofusión, podemos contarlos debajo del contador celular.A continuación mostraremos cómo hacer transacción o transfección de estos organoides hepatocitos. Primero, etiquete los tubos de lo que hará, y luego haremos la transfección de la vista de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Necesitas, el regente de los hechos lipoílicos domesticando INI MaX.Añadimos el. controlar y el gen específico siRNA, e incubarlos con el óptimo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y luego, de acuerdo con la concentración celular, agregamos el RAN max y los mezclamos a fondo.Luego también añadimos el RAN max con el óptimo por separado y los ponemos en hielo. Después de 5 minutos, preparamos una mezcla ran max separada con diferentes siRNAs, RANi de genes específicos y control de II por separado y los mezclamos a fondo. Ponerlos en hielo de nuevo, y luego recogemos todos los organoides, centrofusión lenta, dejamos caer todo el sobrenadante, agregamos el RNAi max, la mezcla de siRNA en esta placa celular y la alimentamos hacia arriba y hacia abajo a fondo.Brevemente, las células y la etiqueta RNAi max y la mezcla de siRNA se gentrificaron e incubaron durante 4 a 5 horas a 37 grados. Parte final, estos organoides de hepatocitos también podrían estar infectados por el virus Lenti. El mensaje similar se realizó como transfección de siRNA.El control y los tubos del virus siRNA estaban bien preparados, y el óptimo se agregó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego con las regiones de infección como poly green y luego agregamos diferentes virus Lenti, de acuerdo con la constitución de instrucciones del fabricante. Combine las suspensiones unicelulares en cultivo de organoides y varias partículas en los tubos eppendorf de 1,5 mililitros, Agregue, bueno, mézclelos Coloque esta mezcla y concéntrelos durante 1 hora a 32 grados.La fusión de concentrado se realizará a 500 G.Y después de 4 a 5 horas de incubación a 37 grados, la suspensión celular se recogerá y se sentará en metrogel. Y ponerlos en la incubadora de nuevo. El órgano en la eficiencia de la formación u otro análisis funcional podría realizarse de 7 a 10 días después.Aquí están nuestros resultados representativos. En la figura 1A, se podía ver nuestro ALB-Cre Rosa 26-GFP o RFP hepatocitos organoides de ratón. En la figura 1B se pudo ver la señal positiva Ki67 en la tinción, lo que ha demostrado que nuestros organoides hepatocitos están proliferando.En la figura 2A y 2B aquí hay una expresión génica representativa de nuestra expresión interferente de nuestros genes. Después de la manipulación genética en organoides de hepatocitos, la interferencia efectiva es muy eficiente. Aquí está la figura 2C, se puede ver después de la manipulación genética con tecnología de carsonita en nuestros organoides murinos.Conclusión, nuestros resultados mostraron que los organoides de los hepatocitos podían expandirse in vitro y manipularse genéticamente. En resumen, en este vídeo mostramos cómo hacer la perfusión hepática y la digestión para conseguir los hepatocitos. Cómo capturar los hepatocitos y pasar los organoides de los hepatocitos.Asimismo, mostramos cómo hacer la transfección por siRNA y vector o virus Lenti para hacer la modificación de la genética de estos organoides. Además, tenemos dos carencias en nuestros organoides. Primero, no usamos por núcleo o núcleo de piel para hacer puro los hepatocitos.Y en segundo lugar, creo que se deben intentar más factores de crecimiento y señalización para mejorar el tiempo de crecimiento de los organoides.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe la producción de un sistema de 3 dimensiones organoide ratón vía biliar extrahepática. Estos organoides biliares se pueden mantener en cultivo a estudiar biología de cholangiocyte. Organoides biliares expresan marcadores de progenitoras y células biliares y están compuestas de células epiteliales polarizadas.

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Este protocolo describe la generación de organoides hepáticos endodérmicos (eHEPOs) rápidos y reproducibles. Con este protocolo, los eHEPOs pueden producirse en 2 semanas y expandirse a largo plazo (más de 1 año) sin perder su diferenciación y funcionalidad.

Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Este protocolo describe cómo establecer, mantener, modificar genéticamente, diferenciar, caracterizar funcionalmente y trasplantar organoides de la glándula lagrimal derivados de tejido primario de ratón y humano.

Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

Proporcionamos una visión general completa y el perfeccionamiento de los protocolos existentes para la formación de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), que abarcan todas las etapas del cultivo de organoides. Este sistema sirve como un modelo valioso para la identificación de posibles dianas terapéuticas y la evaluación de la eficacia de los candidatos a fármacos.

Desarrollo y optimización de un modelo de organoide derivado de pacientes con carcinoma hepatocelular humano para la identificación de posibles dianas y el descubrimiento de fármacos

Los organoides revolucionan el modelado personalizado de tejidos para el desarrollo de órganos, el descubrimiento de fármacos y la investigación de enfermedades. La ingeniería de organoides avanza en la creación de intrincados tejidos sintéticos. El objetivo es integrar la morfogénesis, la tecnología de ensamblaje y las biomatrices para avanzar en la ingeniería de tejidos. Este protocolo ayuda a modelar la organogénesis hepática y a establecer directrices para la construcción de tejidos...

Técnicas de cultivo in vitro para modelar la organogénesis del hígado, construir ensamblajes y diseñar tejidos sintéticos utilizando líneas celulares humanas

Los organoides generados a partir de los tumores de los pacientes se inyectan ortotópicamente en el hígado del ratón. La resección del tejido hepático no tumoral conduce a un entorno regenerativo en el tejido hepático donde se encuentra el tumor.

Un modelo de xenoinjerto de organoide derivado de pacientes con cáncer hepatocelular para investigar el impacto de la regeneración hepática en el crecimiento tumoral

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Adultos miocitos cardíacos son las células primarias que pueden ser aisladas de corazones de animales y se cultivan durante varios días. Dentro de este período de la cultura de transferencia génica adenoviral pueden ser utilizadas para expresar biosensores genéticamente codificados (GEBS) o proteínas fluorescentes de fusión. Ambos enfoques permiten investigaciones celulares por medio de microscopía confocal.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Aprende a establecer y manipular genéticamente organoides de hepatocitos murinos mediante técnicas de cultivo 3D, transfección de siRNA e infección con lentivirus. Este método permite estudiar biología hepática y desarrollar aplicaciones terapéuticas.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

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