Name: Aislamiento de células valvulares primarias humanas para el modelado de enfermedades in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprende a aislar células valvulares endoteliales e intersticiales primarias humanas para modelar la enfermedad valvular aórtica calcificada in vitro. Este protocolo garantiza viabilidad celular y especificidad fenotípica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría agradecer a Jason Dobbins por la perspicaz discusión y la lectura crítica de este manuscrito. Nos gustaría reconocer al Centro para la Recuperación y Educación de Órganos por su ayuda y apoyo y agradecer a los donantes de tejidos y sus familias por hacer posible este estudio. Todas las muestras de pacientes se recogen de individuos inscritos en estudios aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los tejidos cadavéricos obtenidos a través del Centro para la Recuperación y Educación de Órganos (CORE) fueron aprobados por el Comité de Supervisión de Investigación y Capacitación Clínica con Difuntos (CORID) de la Universidad de Pittsburgh.
Algunas figuras creadas con Biorender.com.
CSH cuenta con el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre K22 HL117917 y R01 HL142932, la Asociación Americana del Corazón 20IPA35260111.

<ol><li>Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+behaviors+and+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Amercan+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Health behaviors and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).</li>
<li>Nishimura, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHA%2FACC+guideline+for+the+management+of+patients+with+valvular+heart+disease%3A+executive+summary%3A+A+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+practice+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines.</a> Circulation. 129, 2440-2492 (2014).</li>
<li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+economic+outcomes+after+surgical+aortic+valve+replacement+in+Medicare+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Manag+Healthc+Policy%22%5BJournal%5D)">Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients.</a> Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).</li>
<li>Misfeld, M., Sievers, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+macro-+and+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+Royal+Society+of+London+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Heart valve macro- and microstructure.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).</li>
<li>Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+maturation+of+heart+valves+leads+to+changes+in+endothelial+cell+distribution%2C+impaired+function%2C+decreased+metabolism+and+reduced+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cell+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation.</a> Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).</li>
<li>Mahler, G. J., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+regulation+of+valvular+remodeling%3A+the+good%28%3F%29%2C+the+bad%2C+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly.</a> Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419(2011).</li>
<li>Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+valvular+endothelial+cell+paracrine+signaling+and+matrix+elasticity+on+valvular+interstitial+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation.</a> Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).</li>
<li>Leopold, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+aortic+valve+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovascular+Intervention%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of aortic valve calcification.</a> Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).</li>
<li>Chen, J. H., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+interactions+in+the+pathobiology+of+calcific+aortic+valve+disease%3A+Critical+roles+for+matricellular%2C+matricrine%2C+and+matrix+mechanics+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues.</a> Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).</li>
<li>Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+challenges+for+heart+valve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).</li>
<li>Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+valve+interstitial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cardiac valve interstitial cell.</a> Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).</li>
<li>Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+interstitial+cells+from+human+heart+valves%2C+pericardium+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Disease%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin.</a> Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).</li>
<li>Rajamannan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+not+simply+a+degenerative+process%3A+A+review+and+agenda+for+research+from+the+National+Heart+and+Lung+and+Blood+Institute+Aortic+Stenosis+Working+Group.+Executive+summary%3A+Calcific+aortic+valve+disease-2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update.</a> Circulation. 124, 1783-1791 (2011).</li>
<li>Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+valve+cells+and+their+microenvironment--insights+from+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies.</a> Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).</li>
<li>Yutzey, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+a+consensus+summary+from+the+Alliance+of+Investigators+on+Calcific+Aortic+Valve+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).</li>
<li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).</li>
<li>Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+valve+interstitial+cell+phenotypes+in+regulating+heart+valve+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology.</a> American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).</li>
<li>Liu, A. C., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cell+motility+in+single+heart+valve+interstitial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro.</a> Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).</li>
<li>Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcification+by+valve+interstitial+cells+is+regulated+by+the+stiffness+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).</li>
<li>Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+regulatory+loop+controls+pro-osteogenic+activation+by+TGF-beta1+or+bone+morphogenetic+protein+2+in+human+aortic+valve+interstitial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).</li>
<li>Xu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+the+adenosine+A2A+receptor+confers+pulmonary+arterial+hypertension+and+increased+pulmonary+vascular+remodeling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice.</a> Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).</li>
<li>Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+aortic+valve+stenosis%3A+TGF-beta1+is+present+in+calcified+aortic+valve+cusps+and+promotes+aortic+valve+interstitial+cell+calcification+via+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis.</a> Annals of Thoracic Surgery. 75, 465(2003).</li>
<li>Bogdanova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+cells+in+calcified+aortic+valves+have+reduced+differentiation+potential+and+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties.</a> Science Reports. 9, 12934(2019).</li>
<li>Gendron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aortic+valve+interstitial+cells+display+proangiogenic+properties+during+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).</li>
<li>Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+transcriptional+regulatory+mechanisms+in+aortic+valve+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).</li>
<li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+aortic+valve+stenosis+induced+by+direct+wire+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).</li>
<li>Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Animal models of calcific aortic valve disease.</a> International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).</li>
<li>Gould, R. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+valvular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of valvular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2158(2010).</li>
<li>Miller, L. J., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+valve+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine valve endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51860(2014).</li>
<li>Selig, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+hyperinsulinemia+and+hyperglycemia+on+valvular+interstitial+cells+-+A+link+between+aortic+heart+valve+degeneration+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes.</a> Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Martinsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+trends+in+the+incidence+and+prognosis+of+aortic+stenosis%3A+A+nationwide+study+of+the+Swedish+population%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population.</a> Circulation. 131, 988-994 (2015).</li>
<li>Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+reversible+changes+of+interstitial+cell+phenotype+during+remodeling+of+cardiac+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves.</a> Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).</li>
<li>St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+induction+of+adenosine+receptor+genes+and+its+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance.</a> Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+transcriptome+atlas+of+human+aortic+valves+reveal+cell+heterogeneity+and+endothelial+to+mesenchymal+transition+involved+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).</li>
</ol>

IS recibe apoyo institucional de investigación de Atricure y Medtronic y sirve como consultor para Medtronic Vascular. Ninguno de estos conflictos está relacionado con este trabajo. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

La obtención de tejidos de control y enfermedades de los seres humanos es fundamental para el modelado de enfermedades in vitro y ex vivo; Sin embargo, mientras que a menudo se habla de los desafíos de cerrar la brecha entre el banco y la cabecera, el orden inverso, pasar de la sala quirúrgica al banco, a menudo es una brecha igual de desalentadora. Esencial para que un científico básico obtenga muestras primarias de tejido humano es una colaboración con un científico cirujano invertido que tenga un equipo de enfermeras,...

La valvulopatía aórtica calcificada (CAVD) es una patología crónica caracterizada por inflamación, fibrosis y macrocalcificación de las valvas valvulares aórticas. La remodelación progresiva y la calcificación de las valvas (denominada esclerosis aórtica) pueden conducir a la obstrucción del flujo sanguíneo (estenosis aórtica) que contribuye al accidente cerebrovascular y conduce a la insuficiencia cardíaca. Actualmente, el único tratamiento para la CAVD es el reemplazo quirúrgico o transcatéter de la válvula aórtica (SAVR y TAVR, respectivamente). No existe una opción no quirúrgica para detener o revertir la progresión de la CAVD, y sin reemplazo valvular, las tasas de mortalidad se acercan al 50% en 2-3 años 1,2,3. La definición de los mecanismos subyacentes que impulsan esta patología identificará posibles enfoques terapéuticos novedosos.
En un adulto sano, las valvas valvulares aórticas tienen aproximadamente un milímetro de grosor, y su función principal es mantener el flujo unidireccional de sangre fuera del ventrículo izquierdo4. Cada uno de los tres foliolos se compone de una capa de células endoteliales valvulares (VEC) que recubre la superficie externa de la valva y funciona como una barrera. Los VEC mantienen la homeostasis valvular regulando la permeabilidad, la adhesión celular inflamatoria y la señalización paracrina 5,6,7. Las células intersticiales valvulares (CIV) comprenden la mayoría de las células dentro de la valvavalvular 8. Los CIV están dispuestos en tres capas distintivas en el folleto. Estas capas se conocen como ventricular, espongiosa y fibrosa9. El ventrículo se enfrenta al ventrículo izquierdo y contiene fibras de colágeno y elastina. La capa media, la espongiosa, contiene un alto contenido de proteoglicanos que proporciona flexibilidad de cizallamiento durante el ciclo cardíaco. La capa externa de fibrosa se encuentra cerca de la superficie de salida en el lado aórtico y es rica en colágeno fibrilar tipo I y tipo III que proporciona fuerza para mantener la coaptación durante la diástole10,11,12. Las CIC residen en un estado quiescente, sin embargo, factores como la inflamación, la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y el estrés mecánico pueden alterar la homeostasis de la CIV 8,9,13,14,15,16. Con la pérdida de la homeostasis, los CIC activan y adquieren un fenotipo similar a los miofibroblastos capaz de proliferar, contraer y secar proteínas que remodelan el milieu extracelular17. Los CIC activados pueden convertirse en células calcificantes, lo que recuerda la diferenciación de una célula madre mesenquimal (MSC) en un osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
La calcificación parece iniciarse en la capa fibrosa rica en colágeno a partir de las contribuciones de los VEC y los CIV, pero se expande e invade las otras capas del folioto8. Por lo tanto, está claro que tanto los VEC como los CIC responden a estímulos para regular al alza la expresión de genes osteogénicos, sin embargo, los eventos precisos que impulsan la activación de genes osteogénicos, así como la compleja interacción entre las células y la matriz extracelular de la valva, permanecen mal definidos. Los modelos murinos no son una fuente ideal para estudiar los impulsores no genéticos de la patogénesis de la CAVD, ya que los ratones no desarrollan CAVD de novo26,27, por lo que es necesario el uso de tejidos humanos primarios y las líneas celulares primarias aisladas de estos tejidos. En particular, es imperativo obtener estas células en grandes cantidades y de buena calidad, ya que el campo de los cultivos celulares 3D y el modelado de organoides se está expandiendo y es probable que se convierta en una alternativa ex vivo basada en humanos a los modelos murinos.
El propósito del presente método es compartir un flujo de trabajo que ha establecido las condiciones para aislar y cultivar eficientemente VEC y CIC obtenidos de válvulas extirpadas quirúrgicamente de donantes humanos. Estudios previos han demostrado el aislamiento exitoso de VEC y VICs de válvulas porcinas28 y murinas29, hasta donde sabemos, este es el primero en describir el aislamiento de estas células en tejidos humanos. El protocolo descrito aquí es aplicable a las válvulas extirpadas humanas y evita y mejora en gran medida el daño causado por el tiempo de obtención a menudo largo entre la escisión de tejidos y el procesamiento de laboratorio mediante la introducción de la utilización de una solución de almacenamiento en frío, una solución tamponada utilizada clínicamente en trasplantes de órganos que estabiliza en gran medida las células del tejido extirpado. El protocolo descrito aquí también muestra cómo determinar el fenotipo celular y garantizar una alta eficiencia de la supervivencia celular con una contaminación cruzada celular mínima.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filtro</td><td>Thermo Scientific</td><td>7211345</td><td>Placa de preparación con recubrimiento de colágeno</td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>Cultivo celular/expansión de línea celular</td></tr><tr><td>pipeta serológica de 10 mL Fisher</td><td>14955234</td><td></td><td>Aislamiento VEC/VIC, cultivo celular, expansión de línea celular</td></tr><tr><td>1000 &mu; Puntas de filtro L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td>Cultivo celular/expansión de líneas celulares</td></tr><tr><td>Puntas de filtro 10XL</td><td>VWR</td><td>76322-132</td><td>Cultivo celular/expansión de líneas celulares</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Almacenamiento de tejidos, aislamiento de VIC/VEC</td></tr><tr><td>Solución acuosa de paraformaldehído al 16%</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15710S</td><td>Fijador de tejidos y células</td></tr><tr><td>190 proof etanol</td><td>Decon</td><td>2801</td><td>Desinfección</td></tr><tr><td>1x DPBS: sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>solución salina. Aislamiento VIC/VEC</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher BP2944100</td><td></td><td>solución salina. Preparación de tejidos, aislamiento VIC/VEC</td></tr><tr><td>20 &mu; Puntas de filtro L</td><td>VWR</td><td>76322-134 Cultivo celular</td><td>/expansión de línea celular</td></tr><tr><td>Etanol de 200 grados</td><td>Decon</td><td>2701</td><td>Muestras de tejido desparafinizante</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher</td><td>A416P 4</td><td>Fabricación de placas recubiertas de colágeno</td></tr><tr><td>5 mL pipeta serológica</td><td>Fisher</td><td>14955233</td><td>Aislamiento VEC/VIC, cultivo celular, expansión de líneas celulares</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL Thermo</td><td> Scientific</td><td>339652</td><td>Almacenamiento de tejidos, aislamiento VIC/VEC</td></tr><tr><td>plato de 60 mm</td><td>GenClone</td><td>25-260</td><td>Aislamiento VEC</td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Cultivo celular/expansión de líneas celulares</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher</td><td>BP2401 500</td><td>Fabricación de placas recubiertas de colágeno</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Fluorescente Contratinción de f-actina</td></tr><tr><td>Solución de trasplante de almacenamiento en frío Belzer UW Solución</td> de almacenamiento de tejidos <td>Bridge to Life</td><td>BUW0011L</td> solución <td>de almacenamiento de tejidos</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, fracción V - Sin ácidos grasos 25 g</td> Confirmación de VEC de <td>Bioworld</td><td>220700233</td> con anticuerpo de calponina <td>1 CD31+ Dynabeads</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab46794</td><td>Anticuerpo primario (tinción positiva para VIC)</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2)</td><td>Señalización celular</td><td>3528</td><td>Anticuerpo primario (tinción positiva para VEC)</td></tr><tr><td>CD31+ Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>11155D</td><td>Confirmación de VEC con CD31+ Dynabeads</td></tr><tr><td>CDH5</td><td>Señalización celular</td><td>2500</td><td>Anticuerpo primario (tinción positiva para VEC)</td></tr><tr><td>Filtro de células con 0,70 &mu; m poros</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>aislamiento VIC</td></tr><tr><td>Colágeno 1, proteína de cola de rata</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td>Fabricación de placas recubiertas de colágeno</td></tr><tr><td>Colagenasa II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td>Digestión de tejidos. Preparación de tejidos, aislamiento VIC/VEC</td></tr><tr><td>Conflikt Spray desinfectante listo para usar</td><td>Decon</td><td>4101</td><td>Desinfección</td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Countess II cubreobjetos portaobjetos reutilizables</td><td>Invitrogen</td><td>2026h</td><td>Contador de células automatizado necesario cubierta de portaobjetos</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>125485E</td><td>Montaje de muestras de</td></tr><tr><td>válvulas Viales criogénicos</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-202</td><td>Congelación de muestras de células/tejidos</td></tr><tr><td>Lejía desinfectante con CLOROMAX - Fórmula concentrada&nbsp;</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Desinfección</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td>Medios de crecimiento. Expansión VIC</td></tr><tr><td>EBM - Medio de célula endotelial, medio basal, libre de rojo de fenol 500</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC3129</td><td>Medios de crecimiento. VEC expansión</td></tr><tr><td>EGM-2 Endotelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit</td><td>Lonza Walkersville</td><td>CC4176</td><td>Suplemento de medios de crecimiento. </td></tr><tr><td>Microscopio EVOS FL</td> de <td>expansión VEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Life Technologies Número de modelo: AME3300 Imágenes fluorescentes <tr><td>Microscopio EVOS XL</td><td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td>Visualización de células durante la expansión de la línea celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Premium Select</td><td>R& D Systems</td><td>S11550</td><td>Expansión VIC</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>Preparación de tejidos, aislamiento VIC/VEC</td></tr><tr><td>Raspadores celulares Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>08-100-241</td><td>Expansión VIC</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>Antifúngico: Preparación de tejidos, aislamiento VIC/VEC</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>Antibiótico: Preparación de tejidos, aislamiento de VIC/VEC</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Globe Scientific Inc</td><td>1358L muestras</td> de <td>válvulas de montaje Cabra</td></tr><tr><td>anti-Ratón 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Fluorescente Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Cabra anti-Ratón 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>Fluorescente Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Fluorescente anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>anti-conejo de cabra 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>anticuerpo secundario fluorescente</td></tr><tr><td>Invitrogen Countess II FL portaobjetos reutilizables</td><td>Invitrogen</td><td>A25750</td><td>Contador de células automatizado portaobjetos requerido</td></tr><tr><td>Invitrogen NucBlue Célula fija ReadyProbes Reactivo (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td>Contratinción de núcleo fluorescente</td></tr><tr><td>LM-HyCryo-STEM - 2X Medios de criopreservación para células madre</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>SR30002</td><td>Almacenamiento de celdas congeladas</td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Fisher Chemical Permount</td><td>SP15-100</td><td>Válvula de montaje de muestras</td></tr><tr><td>Mr. Frosty contenedor de congelación</td><td>Nalgene</td><td>51000001</td><td>Contenedor para la congelación controlada de muestras</td></tr><tr><td>Mycoplasma-ExS Spray</td><td>PromoCell</td><td>PK-CC91-5051</td><td>Desinfección</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>Antibiótico. Expansión VIC</td></tr>, <tr><td>Plasmocina</td>, <td>Invivogen</td>, <td>ANTMPT</td><td>, Anti-micoplasma. Aislamiento y expansión de VIC/VEC</td></tr><tr><td>Anticuerpo SM22a</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Anticuerpo primario (tinción positiva para VIC)</td></tr><tr><td>Tijeras de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td>Preparación de tejidos, aislamiento VIC/VEC</td></tr><tr><td>Bastoncillo de algodón estéril</td><td>Puritan</td><td>25806 10WC</td><td>Aislamiento VEC</td></tr><tr><td>Swingsette casete de tejido humano</td><td>Simport Scientific</td><td>M515-2</td><td>Contenedor de inclusión de tejidos</td></tr><tr><td>Pinzas Taylor (17 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11016-17</td><td>Preparación de tejidos, aislamiento de VIC/VEC</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>solución de recuento de células</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>División de VIC/VECs</td></tr><tr><td>Kit de Von Kossa</td><td>Polysciences</td><td>246331</td><td>Tinción de secciones de parafina de tejidos para calcificación</td></tr><tr><td>Von Willebrand anticuerpo factor</td><td>Abcam</td><td>ab68545</td><td>Anticuerpo primario (tinción VEC positiva)</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3S-4 Muestras de</td><td>tejido desparafinizante</td></tr><tr><td>&alpha;Anticuerpo SMA</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Anticuerpo primario (tinción VIC positiva)</td></tr></tbody></table>

aislamiento de células valvulares primarias humanas para el modelado de enfermedades in vitro

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

La valvulopatía aórtica calcificante (CAVD) está presente en casi un tercio de la población de edad avanzada. El engrosamiento, endurecimiento y calcificación de la válvula aórtica causa estenosis aórtica y contribuye a la insuficiencia cardíaca y al accidente cerebrovascular. La patogénesis de la enfermedad es multifactorial, y tensiones como la inflamación, la remodelación de la matriz extracelular, el flujo turbulento y el estrés mecánico y la tensión contribuyen a la diferenciación osteogénica de las células endoteliales valvulares e intersticiales valvulares. Sin embargo, los factores iniciadores precisos que impulsan la transición osteogénica de una célula sana a una célula calcificante no están completamente definidos. Además, la única terapia actual para la estenosis aórtica inducida por CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica, mediante el cual se extrae la válvula nativa (reemplazo quirúrgico de la válvula aórtica, SAVR) o se inserta una válvula de reemplazo totalmente plegable a través de un catéter (reemplazo de la válvula aórtica transcatéter, TAVR). Estos procedimientos quirúrgicos tienen un alto costo y con graves riesgos; Por lo tanto, es imperativo identificar nuevos objetivos terapéuticos para el descubrimiento de fármacos. Con ese fin, el presente estudio desarrolla un flujo de trabajo en el que los tejidos extirpados quirúrgicamente de pacientes y tejidos de cadáveres de donantes se utilizan para crear líneas primarias específicas del paciente de células valvulares para el modelado de enfermedades in vitro. Este protocolo introduce la utilización de una solución de almacenamiento en frío, comúnmente utilizada en el trasplante de órganos, para reducir el daño causado por el tiempo de obtención a menudo largo entre la escisión de tejidos y el procesamiento de laboratorio con el beneficio de estabilizar en gran medida las células del tejido extirpado. Los resultados del presente estudio demuestran que las células valvulares aisladas conservan su capacidad proliferativa y los fenotipos endoteliales e intersticiales en cultivo más de varios días después de la extracción de la válvula del donante. El uso de estos materiales permite la recolección de células de control y CAVD, a partir de las cuales se establecen líneas celulares de control y enfermedad.

El protocolo anterior describe los pasos necesarios para el manejo de tejidos valvulares humanos y el aislamiento y establecimiento de líneas celulares viables a partir de estos tejidos. Las valvas de la válvula aórtica se procesan para la incrustación de parafina, se congelan a presión para su almacenamiento a largo plazo para análisis bioquímicos o genéticos y se digieren para el aislamiento de VEC y CIV (Figura 1). Mientras que las muestras quirúrgicas probablemente tendrán un diagnóstico...

Este protocolo describe la colección de válvulas aórticas humanas extraídas durante procedimientos quirúrgicos de reemplazo de válvula aórtica o de tejido cadavérico, y el posterior aislamiento, expansión y caracterización de células endoteliales e intersticiales de válvula primaria específicas del paciente. Se incluyen detalles importantes sobre los procesos necesarios para garantizar la viabilidad celular y la especificidad del fenotipo.

Aislamiento de células valvulares primarias humanas para el modelado de enfermedades in vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

El aislamiento de las células endoteliales e intersticiales de la válvula primaria humana es fundamental para comprender el mecanismo subyacente de la patogénesis de la enfermedad valvular aórtica calcificada. Cuando la válvula se extirpa del tejido nativo, la viabilidad celular disminuye. Así que hemos identificado un método que prolonga la viabilidad celular.Después de recibir las muestras de tejido valvular extraído, extraer la raíz aórtica y sumergir el tejido en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene solución de enjuague estéril. Después de una incubación de 10 minutos en un cubo de hielo en un balancín, rocíe los tubos con etanol al 70%. En una campana de cultivo de tejido estéril, transfiera el tejido a una placa de Petri y extirpe dos valvas de válvula.Coloque un folleto en un vial criogénico y congele rápidamente el tejido en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados centígrados. Para fijar el tejido para la tinción del contenido de calcio, corte el segundo folio por la mitad desde el nódulo hasta la bisagra y coloque ambas piezas de tejido en un casete que se sumerge en paraformaldehído al 4%. Luego coloque toda la configuración en el balancín a te

isolation-of-human-primary-valve-cells-for-in-vitro-disease-modeling

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Ofrecemos un método para aislar y cultivar las poblaciones puras de células endoteliales de la válvula del corazón (VEC). VEC puede ser aislada de uno y otro lado de la cúspide o el prospecto e inmediatamente después, las células intersticiales de base (CIV) aislada es muy sencillo.

Aislamiento de células endoteliales valvular

En este artículo se proporciona un método para aislar y cultivar la codorniz o pollo...

Aislamiento y cultivo de células embrionarias progenitoras aviar valvular

En este video, demostramos el aislamiento de células intersticiales de la válvula aórtica del corazón de un ratón adulto utilizando un procedimiento de colagenasa de dos pasos y su posterior cultivo en un medio de crecimiento de bajo volumen.

Aislamiento de células intersticiales de válvula de ratón: un método enzimático para aislar y cultivar VICs de válvula aórtica de ratón

La capacidad de aislar las células endoteliales de las válvulas cardíacas (VECs) es fundamental para comprender los mecanismos de desarrollo, mantenimiento y enfermedad de las válvulas.  En este trabajo describimos el aislamiento de VECs de ratones Tie2-GFP embrionarios y adultos utilizando FACS que permitirá realizar estudios que determinen la contribución de los VECs en los procesos de desarrollo y enfermedad.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Aquí, presentamos un modelo de flujo ex vivo en el que se pueden cultivar válvulas cardíacas murinas, lo que permite el estudio de la biología de la válvula.

El cultivo de ratón cardíaca válvulas en el sistema de cultivo tisular miniatura

Este protocolo describe el aislamiento, la cultura y la calcificación de las células intersticiales de rata-derivado de la válvula, un modelo altamente fisiológica en vitro de enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD). Explotación de este modelo de rata facilita investigación CAVD en la exploración de la célula y los mecanismos moleculares que subyacen a este complejo proceso patológico.

Células intersticiales de la válvula de aislamiento y caracterización de rata principal: un nuevo modelo para el estudio de calcificación de la válvula aórtica

En este estudio, describimos el proceso de aislamiento de linfocitos T a partir de muestras frescas de válvulas aórticas calcificadas y los pasos analíticos de la clonación de células T para la caracterización de los subconjuntos de leucocitos adaptativos mediante el análisis de citometría de flujo.

Investigación de la calcificación de la válvula aórtica a través del aislamiento y cultivo de linfocitos T utilizando células alimentadoras de la capa de Buffy irradiada

Este artículo describe el aislamiento de las células de la válvula aórtica del ratón por un procedimiento de dos pasos de la colagenasa. Las células aisladas de la válvula de ratón son importantes para realizar diferentes ensayos, como este ensayo de calcificación in vitro, y para investigar las vías moleculares que conducen a la mineralización de la válvula aórtica.

Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.

Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro

Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 ×...

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Aprende a aislar células valvulares endoteliales e intersticiales primarias humanas para modelar la enfermedad valvular aórtica calcificada in vitro. Este protocolo garantiza viabilidad celular y especificidad fenotípica.

Aislamiento de células valvulares primarias humanas para el modelado de enfermedades in vitro

Explorar más videos