Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8⁺ infiltrantes de tumores en ratones

Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en inmunología tumoral, incluyendo si hay una reposición de células inmunes específicas del tumor de los tejidos periféricos, las transiciones entre las células inmunes recién infiltradas y ya existentes dentro del microambiente tumoral, y sus respuestas a la inmunoterapia. Esta es una técnica conveniente y fácil de seguir para distinguir las células derivadas de la periferia de las células inmunes infiltradas en tumores y rastrear los cambios dinámicos, fenotípicos y funcionales de estas células en ensayos longitudinales. Comience retirando 100 microlitros de la suspensión de células B16F10-OVA preparada en una jeringa de tuberculina de 1 ml.

Toque el barril para mover las burbujas a la parte superior y empuje suavemente el émbolo para eliminar las burbujas de aire. Sujete al ratón para exponer su abdomen. Presione la pata trasera izquierda con el dedo meñique para tensar la piel de la región inguinal izquierda.

Retire el vello del ratón de su abdomen inferior izquierdo con una afeitadora eléctrica. Use algodón empapado en etanol al 75% para limpiar el cuadrante posterior del abdomen izquierdo. Sostenga la jeringa en un ángulo poco profundo entre 0 y 15 grados y, con el bisel de la aguja hacia arriba, insértela en el lado de la parte superior izquierda del muslo.

Avance la aguja de 0,5 a 1 centímetro a través del tejido subcutáneo hacia la región inguinal. Tire hacia atrás del émbolo antes de inyectar. Si hay presión negativa, presione el émbolo por completo y observe la formación de una pequeña bolsa de líquido, o un bolo, en el subcutis.

Retire la aguja después de realizar la inyección. Suelte y coloque el ratón de nuevo en la jaula. En el sexto al octavo día después de la implantación de B16F10-OVA, mida el tamaño del tumor con una escala vernier.

Seleccione los ratones con un diámetro aproximado de tres milímetros o un tumor del tamaño de un frijol mungo, y divídalos por igual y al azar en dos grupos. Retire 200 microlitros de suspensión de células OT-1 en una jeringa de insulina de calibre 29 de 100 unidades y elimine las burbujas. Coloque el ratón por separado en una jaula, con una lámpara infrarroja sobre la jaula durante 5 a 10 minutos para dilatar la vena de la cola.

Inmovilice el ratón con un dispositivo de sujeción del tamaño adecuado. Sostenga la cola para enderezarla y rocíe etanol al 75% para que la vena sea visible. Sostenga la jeringa paralela a la vena e insértela en la vena en un ángulo de 0 a 15 grados.

Tire ligeramente hacia atrás del émbolo y, si la sangre entra en el barril, inyecte lenta y constantemente la suspensión a una velocidad de no más de un mililitro por minuto. Después de completar la inyección, retire la jeringa y presione el área de inyección suavemente durante tres a cinco segundos para detener el sangrado. Devuelva el ratón a la jaula y obsérvelo de cerca durante unos minutos para detectar reacciones adversas.

Si tiene movilidad normal y secreción nasal, colóquelo de nuevo en compañía de los otros ratones. De 8 a 10 días después de la transferencia adoptiva, seleccione ratones donantes con una masa tumoral comparable de aproximadamente cinco milímetros de diámetro para la cirugía de trasplante. Coloque un plato de 100 milímetros por 20 mililitros en un gabinete de bioseguridad y agregue 10 mililitros de PBS estéril y helado.

Después de sacrificar al ratón, sumérjalo en etanol al 75% durante tres a cinco minutos. Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla de disección cubierta con papel absorbente limpio en el gabinete de bioseguridad. Sujete las extremidades del ratón con agujas de disección.

Corte la piel a lo largo de la línea media desde arriba del orificio uretral hasta el xifoide con tijeras. Estire la piel hacia el lado izquierdo del cuerpo del ratón con pinzas y sujete la piel con agujas de disección. Extirpar el tumor, manteniendo su cápsula lo más intacta posible.

Extraiga cuidadosa y suavemente el tejido conectivo cerca del tumor con tijeras quirúrgicas, luego coloque el tejido tumoral en el plato que contiene PBS estéril y helado para el trasplante posterior. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar que se sequen. Afeitar el flanco izquierdo del ratón con una afeitadora eléctrica, luego aplicar una crema depilatoria para eliminar el vello restante.

Coloque el ratón dentro del gabinete de bioseguridad en posición prona sobre un tablero de disección cubierto con papel absorbente limpio, con el eje vertical del ratón paralelo y su cabeza hacia el lado derecho del experimentador. Frote la piel del área afeitada con algodón empapado en povidona yodada. Levante la piel en el punto medio entre las articulaciones de la cadera del ratón con pinzas quirúrgicas.

Use las tijeras para hacer una escisión vertical de cinco milímetros de largo y extienda el corte rostralmente a lo largo de la línea media dorsal a alrededor de 10 a 15 milímetros. Realice una disección aguda insertando las puntas cerradas de las tijeras en la incisión y luego abriéndolas para separar el peritoneo del flanco izquierdo de la piel y el tejido blando. Realice una disección aguda varias veces para generar una bolsa de piel en el flanco izquierdo.

Deposite la masa tumoral encapsulada, intacta y derivada del donante en la bolsa. Cierre la incisión con una sutura interrumpida, usando dos o tres puntos de sutura para cada incisión. Desinfecte la piel alrededor del corte con algodón empapado en povidona yodada.

Coloque el ratón en la posición lateral en una jaula limpia y cálida. Monitoréelo continuamente hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la reclinación esternal. Administrar buprenorfina por vía subcutánea a una dosis de 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal cada ocho horas, para un total de tres dosis.

Devuelva al receptor del trasplante a la compañía de otros animales solo después de que se haya recuperado por completo. Mediante citometría de flujo, se identificaron fácilmente dos poblaciones de células T específicas de antígeno tumoral CD44 negativas y CD8 positivas en el microambiente tumoral, incluidas las células T CD8 positivas derivadas de donantes CD45.1 positivas y CD45.1 negativas y CD45.2 positivas derivadas de tumores derivadas del receptor. En el segundo día después del trasplante, había aproximadamente el 83% de células T CD8 positivas específicas para antígeno derivado del donante dentro del tumor trasplantado, más predominantes que sus contrapartes derivadas del receptor.

La proporción de células OT-1 derivadas del receptor se elevó en la etapa tardía de la tumorigénesis, superando las células OT-1 inherentes al tumor derivadas del donante. Lo más importante a recordar es que realizar una disección suave durante el trasplante de tumor subcutáneo para evitar lesiones en los tejidos circundantes, especialmente en los ganglios linfáticos granulares.