Name: Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a investigar la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal y transfección de macrófagos. Este método permite analizar la unión, internalización y reclutamiento de proteínas a vacuolas parasitóforas en células THP-1.

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Agradecemos al Instituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahía, Brasil y al departamento de microscopía por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por INOVA-Fiocruz número 79700287000, P.S.T.V. tiene una beca para productividad en investigación del CNPq (305235/2019-2). Los plásmidos fueron amablemente proporcionados por Mauricio Terebiznik, Universidad de Toronto, CA. Los autores desean agradecer a Andris K. Walter por la revisión del idioma inglés y la asistencia en la edición de manuscritos.

Las células se obtuvieron de donantes sanos tras la aprobación de los procedimientos por parte de los Comités Nacionales de Ética en Investigación (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cultivos celulares
<ol><li>Macrófagos humanos derivados de monocitos NOTA: Para obtener macrófagos derivados de monocitos humanos para la diferenciación in vitro en macrófagos, recolectar sangre de donantes sanos y purificar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como lo describen D. English y B. R. Andersen21.<ol><li>Después de recolectar sangre periférica (50 ml), viértala en un tubo heparinizado y luego diluya la sangre 1: 1 en una solución tampón de fosfato (PBS) a temperatura ambiente. Coloque suavemente la sangre heparinizada diluida sobre el medio de gradiente de densidad previamente distribuido.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 252 × g durante 30 min a 24 °C para evitar la hemólisis. NOTA: Ajuste la ruptura de la centrífuga para evitar la mezcla de capas de degradado. Después de la centrifugación, se forman capas de gradiente discontinuo de abajo hacia arriba: eritrocitos, medio de gradiente de densidad, anillo PBMC y plasma.</li>
		<li>Transfiera el anillo PBMC, ubicado entre el medio de gradiente de densidad y las capas de plasma, a un nuevo tubo y llénelo con PBS para eliminar el exceso de medio de gradiente de densidad.</li>
		<li>Lavar las celdas una vez y centrifugar a 190 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio RPMI completo.</li>
		<li>Contar las células y la placa 2 × 106 células en 500 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 25 mM de N-[2-hidroxietil] piperazina-N′-[2-etano sulfónico] (HEPES), 2 g/L de bicarbonato de sodio, 2 mM de glutamina, 20 g/ml de ciprofloxacino y 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado (medio RPMI completo) durante 7 días a 37 °C bajo 5% deCO2 en una placa de 24 pocillos para permitir que los monocitos se diferencien en macrófagos por adhesión.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivos de THP-1<ol><li>Cultivar la línea celular THP-1 a una concentración de 2 × 105 células en 10 ml de medio RPMI completo en matraz de cultivo de 75 cm2 .</li>
		<li>Mantener los cultivos celulares en una incubadora a 37 °C por debajo del 5% deCO2 durante 7 días.</li>
		<li>Centrifugar las células a 720 × g durante 10 min a 4 °C y resuspender el pellet en medio RPMI completo.</li>
		<li>Contar celdas en una cámara Neubauer.</li>
		<li>Células en placa en cubreobjetos de vidrio de 13 mm a una concentración de 2 × 105 células por pocillo en 500 μL de medio RPMI completo que contiene 100 nM de acetato de miristato de forbol (PMA) a 37 °C bajo 5% deCO2 para permitir la diferenciación de células THP1 en macrófagos.</li>
		<li>Después de tres días, lavar dos veces las células con solución de NaCl al 0,9% para eliminar el medio que contiene PMA.</li>
		<li>Incubar células THP-1 diferenciadas en medio RPMI completo libre de PMA a 37 °C bajo 5% deCO2 durante 2 días adicionales antes de comenzar la experimentación.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultivos de parásitos y tinción roja de CellTracker
NOTA: Para visualizar parásitos a través de microscopía de fluorescencia, realice la tinción utilizando el colorante fluorescente rojo CellTracker (CMTPX). Alternativamente, se pueden usar otros marcadores, incluida la carboxifluoresceína, de acuerdo con las instrucciones del fabricante o promastigotes que expresan constitutivamente GFP, RFP u otros genes reporteros fluorescentes. Los parásitos utilizados para infectar células son aquellos en fase estacionaria de crecimiento obtenidos de un cultivo axénico promastigote de no más de 7 pasajes.
<ol><li>Cultivar Leishmania spp. promastigotes a 1 x 10 5 parásitos por 1.000 μL de medio en un matraz de cultivo celular que contiene5 ml de medio de Schneider suplementado con 50 μg/ml de gentamicina y 10% de FBS.</li>
	<li>Después de incubar cultivos axénicos de parásitos en una demanda bioquímica de oxígeno (D.O.B.) a 24 °C, realizar el recuento diario en una cámara Neubauer. Verifique la forma del parásito (delgado, alargado) y la movilidad durante 5 días. Los parásitos se consideran en fase estacionaria de crecimiento cuando dos recuentos consecutivos con 8 horas de intervalo muestran cantidades similares.</li>
	<li>Al alcanzar la fase estacionaria de crecimiento, incubar los parásitos en 4 mL de solución de NaCl al 0,9% con CMTPX 1 μM durante 15 min a 37 °C bajo 5% deCO2 evitando el contacto con la luz.</li>
	<li>Agregue FBS en una proporción de 1: 1 e incube la suspensión del parásito durante 1 minuto adicional.</li>
	<li>Lave los parásitos tres veces con PBS, seguido de centrifugación a 1.781 × g durante 10 min.</li>
	<li>Ressuspender el pellet del parásito en 1.000 μL de medio completo RPMI.</li>
	<li>Contar parásitos en una cámara Neubauer.</li>
</ol>3. Evaluación de la unión de Leishmania a macrófagos
<ol><li>Semilla 2 × 105 células THP-1 o macrófagos derivados de monocitos humanos en 500 μL de medio RPMI completo por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm.</li>
	<li>Cultivar células a 37 °C bajo 5% deCO2 durante 24 h.</li>
	<li>Lavar las células dos veces con solución de NaCl al 0,9% e incubar en medio RPMI completo a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Añadir promastigotes de fase estacionaria como los descritos por A. L. Petersen22 en una proporción de 10:1 a las placas de pozo, y luego centrifugar a 720 × g durante 5 min por debajo de 4 °C.</li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Lave las células dos veces con una solución de NaCl al 0,9% para eliminar cualquier promastigotes no internalizado.</li>
	<li>Fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar los cubedores con 15 mM NH4Cl durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS 0,15% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar con solución bloqueante (BSA al 3% en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS y luego permeabilizar con PBS-Saponina al 0,15% durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir faloidina (diluida 1:1.200) durante 1 h a temperatura ambiente y proteger de la luz.</li>
	<li>Monte cubreobjetos utilizando medios de montaje.</li>
	<li>Adquiera imágenes a través de un microscopio de fluorescencia confocal utilizando un objetivo de 63×/1.4.</li>
</ol>4. Evaluación de la fagocitosis de Leishmania por macrófagos
<ol><li>Semilla 2 × 105 células THP-1 o macrófagos derivados de monocitos humanos en 500 μL de medio RPMI completo por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm.</li>
	<li>Cultivar células durante 24 h a 37 °C bajo 5% deCO2.</li>
	<li>Lavar las células dos veces en solución de NaCl al 0,9% e incubar en medio RPMI completo en placa de 24 pocillos a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Añadir Leishmania spp. en fase estacionaria como la descrita por A. L. Petersen22 en una relación 10:1 (parásito:célula huésped), y luego centrifugar a 720 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Incubar las células a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Lave las células dos veces con una solución de NaCl al 0,9% para eliminar cualquier promastigotes no internalizado.</li>
	<li>Incubar las células en medio RPMI suplementado a 37 °C durante 1 h.</li>
	<li>Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 15 min.</li>
	<li>Monte los cubreobjetos utilizando los medios de montaje preferidos.</li>
	<li>Contar no menos de 400 células en campos aleatorios bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 100×/1.4.</li>
</ol>5. Evaluación de la maduración de la vacuola inducida por Leishmania
NOTA: La transfección de células THP-1 debe realizarse como lo describen M. B. Maess, B. Wittig y S. Lorkowski 23. Aquí resumimos este protocolo, con modificaciones mínimas. La nucleofección es un método de transfección específico que requiere un nucleofector. Como método alternativo, las células pueden ser transfectadas usando lipofectamina24 y transducción de lentivirus25.
<ol><li>Para investigar la biogénesis de PV inducida por Leishmania, transfectar células THP1 con plásmidos PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 o Rab7 28,29,31. NOTA: Esta metodología se puede utilizar para transfectar células THP-1 con otros genes distintos de los mencionados anteriormente.</li>
	<li>Semilla de células THP-1 a matraces de cultivo tisular de 1,5 x 107 en 75 cm² que contienen 10 ml de medio RPMI completo suplementado con 100 ng/ml de PMA y 50 μM de 2-mercaptoetanol durante 48 h.</li>
	<li>Lave las células una vez en solución de NaCl al 0,9%.</li>
	<li>Separar las células utilizando una solución de disociación celular no enzimática y centrifugar (250 × g) durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspender células THP-1 en 1 ml de medio RPMI y realizar recuentos en una cámara Neubauer.</li>
	<li>Centrifugar las células THP-1 de nuevo a 250 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender 2 × 106 células en 100 μL de solución de nucleofector e incubar con 0,5 μg del plásmido que codifica para la proteína de interés, marcado con una proteína fluorescente.</li>
	<li>Transfiera la suspensión que contiene células THP-1 y ácido nucleico a la cubeta Nucleofector.</li>
	<li>Transfectar células THP1 utilizando el programa Nucleofector Y-001.</li>
	<li>Recuperar las células transfectadas (2x106) y sembrar en medio RPMI de 500 μL en placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm (4 pocillos/transfección).</li>
	<li>Incubar células THP-1 en medio RPMI completo a 37 °C durante 0,5, 2, 4, 6, 12 y 24 h.</li>
	<li>Repita los pasos 3.13 y 3.13.</li>
</ol>6. Evaluación del reclutamiento de LC3 para Leishmania spp. PVs
NOTA: El marcador de membrana autofágica LC3 se puede utilizar para investigar si los fagosomas presentan características autofágicas. El reclutamiento de CL3 a PV inducidos por Leishmania puede evaluarse durante la infección mediante células inmunomarcadas con el anticuerpo anti-LC3, como se describió previamente por C. Matte32 y B. R. S. Dias33.
<ol><li>Semilla 2 × 105 células THP-1 o macrófagos derivados de monocitos humanos en medio RPMI completo de 500 μL en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 mm.</li>
	<li>Cultivar células durante 24 h a 37 °C bajo 5% deCO2.</li>
	<li>Lave las células dos veces en una solución de NaCl al 0,9% e incube en un medio RPMI completo.</li>
	<li>Añadir promastigotes de Leishmania spp. en fase estacionaria como la descrita por A. L. Petersen22 en una relación 10:1 (parásito: células huésped) y células centrífugas a 720 × g durante 5 min bajo 4 °C.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 30 min o 4 h. Luego lavar dos veces y fijar las células para evaluar el reclutamiento de LC3 a las membranas fotovoltaicas inducidas por Leishmania en las primeras etapas de la infección.<ol><li>Alternativamente, para evaluar el reclutamiento de CL3 a las membranas fotovoltaicas en etapas posteriores de la infección, lavar dos veces otro grupo de macrófagos a las 4 h de la infección para eliminar cualquier promastigotes no internalizados. Incubar las células infectadas en un medio RPMI completo durante 12 h y 24 h adicionales, para finalmente lavar dos veces y fijar. NOTA: Las células fijas se pueden mantener en PBS o solución de NaCl al 0,9% a 4 °C hasta su etiquetado.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloquee y permeabilice simultáneamente las células fijas en 0.1% Triton X-100, 1% BSA, 20% de suero de cabra normal, 6% de leche en polvo sin grasa y 50% de FBS durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las células con anticuerpo anti-LC3 (1: 200) diluido en PBS durante 2 h a temperatura ambiente. NOTA: Como control negativo de la inmunotinción, se debe incubar un grupo de células con inmunoglobulina G (IgG) del animal de origen anticuerpo primario en una concentración equivalente a la utilizada para el anticuerpo primario.</li>
	<li>Lave las células tres veces con solución de NaCl al 0,9% a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las células con AlexaFluor 488-conjugado cabra anti-conejo IgG (1:500) o los anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente preferidos durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las células tres veces con solución de NaCl al 0,9% a temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte los cubreobjetos utilizando los medios de montaje preferidos.</li>
	<li>Adquiera imágenes a través del microscopio de fluorescencia confocal utilizando un objetivo de 63x/1.4.</li>
</ol>7. Adquisición de microscopía confocal y cuantificación de Fiji
NOTA: La adquisición de imágenes de inmunofluorescencia debe realizarse utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Para alcanzar una mejor resolución, utilice una lente objetivo 63x de inmersión en aceite.
<ol><li>Deje los cubreobjetos de vidrio de 13 mm a temperatura ambiente y protéjalos de la luz al menos 30 minutos antes de la adquisición.</li>
	<li>Limpie los cubreobjetos con un pañuelo absorbente.</li>
	<li>Añade una gota de aceite de inmersión al objetivo y añade el portaobjetos.</li>
	<li>Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el aceite toque la corredera.</li>
	<li>Observe y ajuste el enfoque en el microscopio y elija la opción objetivo 63x con aceite.</li>
	<li>Abra el programa Leica y ajuste los láseres en las longitudes de onda 488, 552 y 405.</li>
	<li>Seleccione la resolución de imagen 1.024 x 1.024.</li>
	<li>Haga clic en el botón Live , configure la pila Z y presione la opción Comenzar . Luego, hágalo nuevamente y presione el botón Fin . Recomendamos 20 μm para el grosor del corte para obtener imágenes confocales con buenas resoluciones.</li>
	<li>Espere a que se adquiera la imagen y, a continuación, seleccione la opción "Proyección máxima" en las herramientas de Leica.</li>
	<li>Guarde el experimento.</li>
	<li>Exporte las imágenes en formato lif o tiff a un ordenador y abra el programa FIJI.</li>
	<li>Abra el experimento y establezca la pila de vistas con la hiperpila. A continuación, seleccione abrir archivos individualmente y unir mosaicos.</li>
	<li>Seleccione la herramienta Manos libres en la barra de herramientas de Fiji y trace la celda cuidadosamente a mano.</li>
	<li>Pulse el botón Analizar y mida para visualizar la intensidad de la fluorescencia.</li>
	<li>Repita este proceso en cada celda por grupo.</li>
	<li>Guarde las medidas y expórtelas a un editor de hojas de cálculo.</li>
	<li>Agregue estos datos a un programa de análisis estadístico y realice el análisis estadístico.</li>
</ol>8. Análisis estadístico
NOTA: Para el análisis de datos y gráficos, utilice un programa de análisis estadístico.
<ol><li>Abra el programa.</li>
	<li>Inserte los datos obtenidos y pruebe los parámetros de normalidad.</li>
	<li>Para datos con distribución normal, utilice la prueba t de Student y para pruebas no paramétricas, la prueba de Mann-Whitney.</li>
	<li>Considere los datos con una diferencia estadísticamente significativa cuando el valor p es inferior a 0,05.</li>
	<li>Preparar gráficos que representen los datos, con medidas de tendencia central (media o mediana) y medidas de variación.</li>
</ol>

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</ol>

Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación o el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

La interacción leishmania-macrófagos es un proceso complejo e involucra varios pasos que pueden influir en el desarrollo de la enfermedad5. Para comprender mejor los mecanismos implicados en la interacción de la Leishmania no opsonizada y las células huésped, hemos descrito un protocolo que emplea microscopía de fluorescencia confocal para evaluar la fagocitosis desde las etapas tempranas hasta las últimas de la infección por Leishmania. El uso de técnicas de fluorescenc...

La leishmaniasis es una enfermedad tropical desatendida causada por parásitos protozoarios del género Leishmania, que da lugar a un amplio espectro de manifestaciones clínicas en el huésped vertebrado, incluyendo leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea y leishmaniasis visceral1. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que más de mil millones de personas están en riesgo, con más de un millón de nuevos casos reportados por año2.
Leishmania spp. son protozoos intracelulares obligados que sobreviven dentro de las células huésped, incluyendo monocitos, macrófagos y células dendríticas3. La interacción Leishmania-macrófagos es un proceso complejo que involucra múltiples receptores de células huésped y ligandos parásitos, ya sea a través de interacción directa o por opsonización que involucra receptores del complemento 4,5. Los receptores de superficie clásicos, como CR1, CR3, manosa-fucosa, fibronectina, toll-like y receptores eliminadores, median la unión del parásito a los macrófagos 6,7,8. Estos receptores reconocen moléculas en la superficie de Leishmania, incluyendo la glicoproteína de 63 kDa (gp63) y el lipofosfoglicano glicolípido (LPG)9. Estas son las moléculas más abundantes en la superficie de los promastigotes y juegan un papel esencial en la subversión de la respuesta inmune del huésped, favoreciendo el establecimiento de la infección parasitaria en células de mamíferos10. Después de que los ligandos de superficie del parásito se unen a los receptores de macrófagos, la actina F se acumula en las superficies celulares de los mamíferos, rodeando a los parásitos a medida que se fagocitan. Posteriormente, esto conduce a la formación de un compartimento inducido por parásitos denominado vacuola parasitófora (PV), que presenta características fagolisosomales11. Una vez dentro de estos fagolisomas, los parásitos sufren varias alteraciones esenciales para la supervivencia y la multiplicación3.
La biogénesis de PVs es un proceso de tráfico de membrana altamente regulado crítico para la supervivencia intracelular de este patógeno12. La formación de este compartimento resulta de eventos de fusión secuencial entre fagosomas y compartimentos de la vía endocítica del huésped. Los estudios clásicos de biología celular han revelado que la maduración de PVs implica la adquisición de proteínas monoméricas G Rab 5 y Rab 7, que se asocian principalmente con la maduración temprana y tardía del endosoma, respectivamente13. Además, estos compartimentos adquieren proteínas de membrana asociadas a lisosomas 1 y 2 (LAMP 1, LAMP 2), los principales constituyentes proteicos de la membrana lisosomal y proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador autofagosómico14. A pesar de las similitudes aparentes, la cinética de la formación de PV15,16 y la morfología de estos compartimentos varían dependiendo de las especies de Leishmania. Por ejemplo, la infección causada por L. mexicana o L. amazonensis induce la formación de grandes compartimentos que contienen un gran número de parásitos17. Por el contrario, otras especies, como L. braziliensis y L. infantum, forman vacuolas más pequeñas que normalmente contienen sólo uno o dos parásitos en cada vacuola18.
A pesar de este conocimiento que rodea la interacción entre la célula huésped y Leishmania, los eventos iniciales desencadenados por el contacto entre los receptores del huésped y los ligandos del parásito no se han dilucidado completamente. Se sabe que estos eventos son determinantes del resultado de la infección parasitaria y dependen de las especies de parásitos, el tipo de receptores de células huésped reclutados para reconocer parásitos y la activación de las vías de señalización de macrófagos19,20. Por lo tanto, es esencial identificar las moléculas involucradas en la biogénesis de PV inducidas por Leishmania y determinar el papel (s) desempeñado por estas moléculas en el establecimiento y el resultado de la infección. Aquí, describimos un método para monitorear los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de Leishmania, incluida la unión, la internalización, la formación de fagosomas y la maduración. Este trabajo podría ayudar a aclarar la participación de PLC, Akt, Rab5, Rab7 y LC3 en la formación de PVs inducidos por diferentes especies de Leishmania. Es importante destacar que este protocolo se puede utilizar para investigar la participación de otras proteínas involucradas en la maduración fotovoltaica. Los estudios futuros ampliarán el conocimiento sobre los mecanismos involucrados en la interacción Leishmania-célula huésped y contribuirán al diseño de nuevas estrategias quimioterapéuticas.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-conjugado cabra anti-conejo IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Tem varios no site</td><td></td></tr><tr><td>anti-LC3 anticuerpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-1384</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rojo (CMTPX) Tinte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Centr&iacute; fuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina</td><td>Isofarma</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td></td> Microscopio de fluorescencia confocal <td>Thermo Fisher Scientific</td> X <td></td></tr><tr><td>(Leica SP8)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia (Olympus Lx73)</td><td>Olympus</td><td>Olympus Lx73</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750045</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etano-sulfónico)</td><td>Gibco</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Sigma</td><td>NS02L</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo Nucleofector 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Solución nucleofectora</td><td>Lonza</td><td>VPA-1007</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de miristato de forbol (PMA)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Kit antidecoloración</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Medio para insectos de Schneider</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X</td><td></td></tr></tbody></table>

investigación de la fagocitosis de leishmania mediante microscopía confocal

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

La fagocitosis es un proceso orquestado que implica distintos pasos: reconocimiento, unión e internalización. Los fagocitos profesionales absorben los parásitos Leishmania por fagocitosis, que consiste en reconocer ligandos en las superficies del parásito por múltiples receptores de células huésped. La unión de Leishmania a las membranas de macrófagos ocurre a través del receptor del complemento tipo 1 (CR1) y el receptor del complemento tipo 3 (CR3) y los receptores de reconocimiento de patrones. El lipofosfoglicano (LPG) y la glicoproteína de 63 kDa (gp63) son los principales ligandos implicados en las interacciones macrófago-leishmania . Tras el reconocimiento inicial de los ligandos del parásito por los receptores de la célula huésped, los parásitos se internalizan, sobreviven y se multiplican dentro de las vacuolas parasitóforas. El proceso de maduración de las vacuolas inducidas por Leishmania implica la adquisición de moléculas de vesículas intracelulares, incluidas las proteínas G monoméricas Rab 5 y Rab 7, la proteína de membrana lisosomal asociada 1 (LAMP-1), la proteína de membrana lisosomal asociada 2 (LAMP-2) y la proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3).
Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped utilizando microscopía confocal, incluyendo (i) unión (ii) internalización y (iii) maduración del fagosoma. Al agregar al cuerpo de conocimiento que rodea estos determinantes del resultado de la infección, esperamos mejorar la comprensión de la patogénesis de la infección por Leishmania y apoyar la eventual búsqueda de nuevos objetivos quimioterapéuticos.

Este informe tiene como objetivo evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de L. braziliensis aislada de pacientes que presentan L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL forma de CL. Utilizando microscopía confocal, investigamos los principales eventos asociados con la fagocitosis de los parásitos: unión, internalización y maduración del fagosoma. Primero evaluamos la unión a L. braziliensis-LCL o L. braziliensis-DL y la fagocitosis por macrófagos humanos deriva...

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí describimos métodos para evaluar los primeros estados de curación durante la interacción de Leishmania con las células huésped. Esta técnica se presenta como principal ventaja, permitiendo el estudio de diferentes estados de fagocitosis de Leishmania y la participación de varias proteínas.Vale la pena señalar que esta técnica también se puede extender a otros tipos de estudios, incluida la infección por bacterias, levaduras o la absorción por otros tipos de células. Las personas que prueben esta técnica deben cuidar el tiempo de exposición de las células a la solución de nucleofector. Además, sugerimos comenzar a probar la transfección utilizando un máximo de dos plásmidos.Demostrando el procedimiento estará Amanda Reboucas, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para empezar, sembrar 0,2 millones de células THP-1, o macrófagos humanos derivados de monocitos en 500 microlitros RPMI por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono, lavar las células dos vece

investigating-the-phagocytosis-of-leishmania-using-confocal-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Un ensayo parásito-rescate y la transformación con células THP1...

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Este video investiga la virulencia de Leishmania mediante el tratamiento de macrófagos con promastigotes metacíclicos, lo que resulta en la formación de amastigotes intracelulares. La confirmación de la virulencia de Leishmania se logra mediante tinción con colorante fluorescente de ácido nucleico. Este conocimiento puede contribuir al desarrollo de nuevas terapias para la leishmaniasis.

Evaluación de la virulencia de Leishmania en macrófagos cultivados

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Todas las especies patógenas de Leishmania residen y replican dentro de macrófagos de hospederos vertebrados. Aquí, presentamos un protocolo para infectar macrófagos derivados de médula ósea murinos en cultura con Leishmania, seguida por la cuantificación precisa de la cinética de crecimiento intracelular. Este método es útil para el estudio de los factores individuales que influyen en la interacción huésped-patógeno y virulencia de Leishmania .

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

En este trabajo se describe la metodología utilizada para generar cepas de L. panamensis y L . donovani que expresan el gen de eGFP como un transgén integrado estable utilizando el sistema pLEXSY. Los parásitos transfectados se clonaron limitando la dilución, y se seleccionaron los clones con la mayor intensidad de fluorescencia en ambas especies para su posterior uso en ensayos de detección de fármacos.

Desarrollo de cepas de especies de Leishmania con expresión constitutiva de eGFP

En este trabajo presentamos una evaluación longitudinal de hámsters dorados infectados por vía intraperitoneal (IP) o intragingival (IG) con L. infantum-Luc mediante imagen bioluminiscente y por PCR. Los hámsters fueron evaluados 1 día después de la infección (1 dpi), 1 semana después de la infección (8 dpi) y 3 semanas después de la infección (22 dpi) y se les practicó la eutanasia a los 50dpi y 8 meses después de la infección.

In vivo Imágenes de hámsters infectados con Leishmania infantum mediante inoculación gingival de amastigotes axénicos que expresan luciferasa

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

Aprende a investigar la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal y transfección de macrófagos. Este método permite analizar la unión, internalización y reclutamiento de proteínas a vacuolas parasitóforas en células THP-1.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

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