Name: Microirradiación láser para estudiar el reclutamiento de ADN durante la fase S (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprende a analizar la dinámica de reclutamiento de proteínas de reparación de ADN durante la fase S mediante microirradiación láser y microscopía confocal en células vivas. Este método permite estudiar con alta resolución temporal los mecanismos de respuesta al daño genético.

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Los autores agradecen a M. Pagano por su continuo apoyo, así como a D. Simoneschi, A. Marzio y G. Tang por su revisión crítica del manuscrito. B. Miwatani-Minter agradece a R. Miwatani y B. Minter por su continuo apoyo. G. Rona agradece a K. Ronane Jurasz y G. Rona por su continuo apoyo.

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<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+dna+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).</li>
<li>Cheruiyot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29-binding+promotes+Exo1+damage+recruitment+and+suppresses+its+nuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities.</a> DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).</li>
<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
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<li>Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization%3A+reversible+induction+of+G2+synchrony+in+cultured+rodent+and+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).</li>
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</ol>

Los autores afirman que la publicación del trabajo presentado fue patrocinada por Nikon Corporation. Los autores declaran que no existen intereses contrapuestos.

Pasos críticos y posibles problemas/modificaciones de protocolos El recipiente de cultivo de tejidos adecuado para la microirradiatura es fundamental para el éxito. La mayoría de los sistemas de imágenes de alta resolución están optimizados para un espesor de vidrio de cubierta de 0,17 mm. El uso de cámaras de imágenes de mayor o menor espesor o de polímeros plásticos (no optimizadas para imágenes de 405 nm) puede reducir significativamente la calidad de la imagen. Cuando use superficies de vidrio, asegúrese de que sean tratadas con cultivo de tejidos para mejorar la adhesión celular. Si no se tratan con cultivo de tejidos, estas cámaras deberán recubrirse, por ejemplo, con poli-D-lisina antes de sembrar las células. Al enchapar las células en el vidrio de cubierta con cámara, la densidad celular ideal es primordial para evitar irregularidades en el ciclo celular y estrés adicional para las células. El equilibrio térmico adecuado de los componentes del microscopio antes de la experimentación para mantener una temperatura estable es crucial tanto para mantener el enfoque a lo largo de la imagen de lapso de tiempo como para garantizar una DDR homogénea a través del tiempo y las muestras.
Es fundamental que las células estén en condiciones saludables antes de la microirradiación para reducir los datos artefactuales. Si las células tienen una morfología irregular después de la infección / selección, permita que las células progresen a través de múltiples pasajes hasta que la morfología vuelva a la normalidad. Siempre asegúrese de que las líneas de células utilizadas estén libres de contaminación por micoplasma. Entre los muchos efectos adversos de la infección por micoplasma, también causa daño en el ADN de las células huésped y podría afectar sus vías DDR14,15. La forma más sensible de detectar micoplasma en el cultivo celular es a través de PCR (versus. detección con DAPI o Hoechst).
La sobreexpresión óptima de la proteína reparadora de interés debe ser comparable a los niveles endógenos, sin embargo, lo suficientemente altos como para la detección. El promotor utilizado en los vectores virales, el título viral durante la infección y la duración del tiempo de infección se pueden ajustar para los niveles de expresión ideales. Para obtener resultados consistentes, aísle clones de células individuales para garantizar niveles de expresión homogéneos y una morfología celular normal. Se recomienda utilizar construcciones vectoriales que no sobreexpresen el PCNA etiquetado a niveles más altos que los endógenos para una función adecuada de marcadores de reparación del ciclo celular y del ADN. Incluso los niveles bajos de sobreexpresión de PCNA son suficientes para discriminar las células de fase S. Los vectores retrovirales pBABE se han utilizado con éxito para este propósito (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). El PCNA se puede etiquetar con cualquier proteína fluorescente roja monomérica(por ejemplo, mPlum, mCherry, mRuby, etc.) o verde monomérica (por ejemplo, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, etc.) que luego podría combinarse con un POI etiquetado alternativamente. La sobreexpresión de un POI marcado fluorescentemente tiene algunas limitaciones y consideraciones. Las etiquetas fluorescentes pueden alterar la función normal de las proteínas y la localización. Por lo tanto, se debe considerar la ubicación de la etiqueta (N o C-terminal). Utilice siempre proteínas fluorescentes monoméricas, ya que la oligomerización de variantes no monoméricas puede afectar la función del POI.
La configuración del láser debe determinarse para cada sistema de imágenes, ya que muchos componentes de la ruta óptica afectarán la potencia real entregada a las células. La microirradiación láser puede causar varios tipos de lesiones de ADN dependiendo de la longitud de onda de excitación, la potencia de salida del láser FRAP y si se utilizó algún agente presensibilizante (como Bromodeoxiuridina o Hoechst). Los láseres de 405 nm pueden causar daño oxidativo en el ADN, roturas de cadena simple y doble16,17. Mediante el uso de configuraciones de salida láser más altas, la cantidad de DSB aumenta. En este protocolo no se utilizaron métodos de presensibilización, pero estas técnicas están muy cubiertas en la literatura y re-limitadas en la discusión a continuación. En nuestra opinión, la mejor manera de probar si se genera la lesión deseada es mediante la prueba del reclutamiento de genes específicos conocidos de la vía de daño del ADN. El reclutamiento de NTHL1 u OGG1, componentes de la vía BER, sugiere la inducción de bases de ADN oxidadas10,11,17,18,19,mientras que FBXL10 o XRCC5 indican la presencia de DSB8,20,21. El reclutamiento de XRCC1 puede indicar tanto la presencia de bases de ADN oxidadas como roturas monocatenadas (SSB)22,23. XPC (es decir, RAD4) es un buen indicador de NER que elimina los voluminosos aductos de ADN generados por la luz ultravioleta (UV)17,24. Debido a que el reclutamiento de proteínas exógenas puede introducir ciertas irregularidades, la tinción inmunofluorescente de proteínas o marcadores endógenos de reparación del ADN (como γH2A.X para roturas de doble cadena) puede confirmar la presencia de lesiones específicas de ADN. Alternativamente, también se podrían usar anticuerpos criados contra tipos específicos de lesiones de ADN. Para ajustar la potencia láser entregada, se puede cambiar tanto el tiempo de permanencia como la potencia del láser.
Con la ayuda de modelos matemáticos, se podría realizar un análisis cinético detallado que puede proporcionar información valiosa sobre las propiedades de reclutamiento del POI (por ejemplo, la contribución de múltiples dominios de unión al ADN, la sensibilidad hacia diferentes eventos de señalización, etc.). La evaluación automatizada del reclutamiento y el seguimiento celular podrían combinarse para crear flujos de trabajo robustos 1,25.
Ventajas y limitaciones de la presensibilización del ADN La presensibilización del ADN antes de la microirradiación es una herramienta comúnmente utilizada para el reclutamiento de proteínas de reparación del ADN16,17. Sensibilizar el ADN antes de la microirradiación lo deja más susceptible a los DSB. Los dos métodos más comunes para la presensibilización del ADN son el pretratamiento de las células con bromodeoxiuridina (BrdU) o colorante Hoechst. Para los sistemas que no son capaces de microirradiarse a altas potencias láser, estos métodos pueden ser necesarios para inducir lesiones de ADN como los DSB. Además, en ausencia de un detector de luz transmitida o una señal fluorescente que resalte el núcleo celular (por ejemplo, cuando se estudia el reclutamiento de proteínas endógenas de reparación del ADN sin etiquetar), Hoechst actúa como una herramienta de presensibilización y una tinción nuclear fluorescente. Sin embargo, la presensibilización del ADN puede introducir complicaciones significativas. BrdU (utilizado a una concentración final de 10 μM) debe agregarse a las células 24 horas (o tiempo equivalente a un ciclo celular completo en la línea celular utilizada) para incorporarse adecuadamente en el ADN y puede causar interferencias en el ciclo celular26. Hoechst 33342 (utilizado a una concentración final de 1 μg/ml) es citotóxico después de largos períodos de incubación, pero requiere tiempo suficiente para saturar el núcleo con el colorante. Por lo tanto, solo debe aplicarse 15-20 minutos antes de la microirradia; de lo contrario, los datos de contratación no serán coherentes. Las células teñidas de esta manera no se pueden mantener en cultivo durante más de unas pocas horas27,28. Asegúrese de no usar Hoechst 33358, que no es tan permeable a las células como el tinte Hoechst 33342. La presensibilización también puede introducir una variación innecesaria entre los experimentos y hace que el experimento sea aún más sensible a las diferencias en la densidad celular (ya que esto afectará la cantidad de tinte / célula incorporado).
Ventajas y limitaciones de la microscopía confocal La velocidad de obtención de imágenes de la microscopía confocal puede ser limitante en comparación con la microcopia de campo amplio. Sin embargo, un microscopio confocal equipado con un escáner resonante puede mejorar enormemente la velocidad de imagen (a costa de la resolución) acercándose a las velocidades de la microscopía de disco giratorio. Tres características hacen que el sistema confocal A1R HD25 sea una excelente opción para el protocolo presentado aquí. En primer lugar, el FOV de 25 mm del sistema permite obtener imágenes de entre 15-20 celdas en un solo campo escaneado (frente a 5-10 celdas en configuraciones regulares), lo que limita el número de adquisiciones necesarias para obtener suficientes células para el análisis estadístico. En segundo lugar, el módulo FRAP y dos cabezales de escaneo permiten obtener imágenes y microirradiar las células simultáneamente, no solo secuencialmente. Por último, la flexibilidad de tener los escáneres resonantes y galvanos proporciona la capacidad de cambiar fácilmente entre imágenes de alta resolución temporal con una velocidad excepcional que minimiza el enfriamiento de los fluoróforos, e imágenes de alta resolución espacial que utilizan velocidades de escaneo más lentas para producir imágenes con una mayor relación señal/ruido. Si bien el sistema utilizado permitió la flexibilidad antes mencionada, para parecerse a configuraciones de microscopio confocal más ampliamente disponibles, solo se utilizó el escáner galvano en los experimentos presentados (tanto para microirradiación como para imágenes posteriores).
Ventajas y limitaciones de la microirradiatura Si bien la microirradiación proporciona una resolución espacial y temporal sin igual, no está exenta de limitaciones. El daño al ADN por microirradiación láser está altamente agrupado en partes específicas del núcleo en comparación con los agentes dañinos naturales. Por lo tanto, la respuesta de la cromatina debido a la microirradiación puede diferir en comparación con el daño distribuido homogéneamente. Además, la microirradiación consume mucho tiempo y solo puede llevarse a cabo en unas pocas docenas de células, mientras que los grandes métodos bioquímicos basados en la población (fraccionamiento de cromatina, inmunoprecipitación, ChIP) pueden proporcionar una mayor robustez al estudiar miles de células a la vez. La verificación de las observaciones realizadas por microirradiación con técnicas bioquímicas tradicionales es una estrategia eficaz para obtener conclusiones fiables. Aunque es posible la microirradia simultánea de muchas células en un determinado FOV, el sistema de imágenes necesitará más tiempo para realizar la tarea. Por lo tanto, la medición de la dinámica de las proteínas que reclutan muy rápidamente a las lesiones de ADN limita el número de posibles ROI para la microirradia utilizada simultáneamente. En el sistema de imágenes utilizado para este protocolo, la microirradia de un solo ROI de 1024 píxeles de largo toma 1032 ms usando un tiempo de permanencia de 1000 μs y 3088 ms usando un tiempo de permanencia de 3000 μs para completarse. El uso de múltiples líneas de ROI aumentará significativamente el tiempo necesario para finalizar la microirradiatura (por ejemplo, el ROI de 7 x 1024 píxeles de largo toma 14402 ms usando un tiempo de permanencia de 1000 μs y 21598 ms usando un tiempo de permanencia de 3000 μs). Este tiempo se pierde por la adquisición de imágenes y debe tenerse en cuenta. Al obtener imágenes de eventos de reclutamiento rápido, use el ROI más corto posible y solo microirradie una célula a la vez.
Ventajas y limitaciones sobre los métodos de sincronización Para los estudios específicos del ciclo celular, los métodos existentes implican la sincronización de las células en fases específicas del ciclo celular o el uso de reporteros fluorescentes para identificar la fase específica del ciclo celular de la célula. Sin embargo, cada uno de estos métodos proporciona sus propios desafíos y limitaciones.
El sistema FUCCI3 (que se basa en formas truncadas marcadas con proteínas fluorescentes de CDT1 y Geminin) es una herramienta particularmente útil para estudios del ciclo celular, pero tiene limitaciones cuando se trata de diferenciar entre las fases S y G2 del ciclo celular. Los niveles de Geminina ya son altos desde mediados de la fase S y se mantienen altos hasta la fase M, lo que hace que estas fases sean difíciles de separar. El uso del sistema FUCCI también significa que no se pueden utilizar dos canales ópticos del microscopio para obtener imágenes del POI.
Las líneas celulares no cancerosas podrían sincronizarse en G0 mediante la eliminación de los factores de crecimiento que se encuentran en el suero (inanición sérica) que causan poco o ningún daño en el ADN de las células. Sin embargo, la mayoría de las líneas celulares de cáncer continuarán progresando parcialmente a través del ciclo celular, incluso sin cantidades adecuadas de suero en sus medios. Además, las células comienzan a perder parcialmente la sincronización a finales de G1, fase S temprana. Además de la inanición sérica, existen numerosos métodos químicos para lograr la sincronización del ciclo celular. La hidroxiurea, la puldicolina y los bloques de timidina son métodos para detener la replicación del ADN para sincronizar las células en la fase S temprana. Si bien estos métodos son baratos y simples, introducen estrés de replicación que resulta en daño en el ADN. Se ha demostrado que estos inhibidores de la replicación del ADN inducen la fosforilación de H2A. X, un marcador bien conocido de losOSD 2,29. El método de usar PCNA etiquetado como marcador para las células de fase S reduce el potencial de artefactos causados por la sincronización química y se puede aplicar a una amplia gama de líneas celulares en comparación con la inanición sérica.
Conclusión El daño al ADN es una fuerza impulsora para las enfermedades genéticas donde las lesiones mutagénicas pueden conducir a la transformación maligna de las células. Dirigirse a la maquinaria de síntesis de ADN es una estrategia terapéutica fundamental en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas como el cáncer. Para tratar estas enfermedades de una manera más específica, necesitamos una mejor comprensión de las proteínas que reparan las lesiones de ADN. El protocolo descrito aquí ayuda a los estudios basados en microirradiación en fase S al minimizar los desafíos presentados por los métodos de sincronización tradicionales para reducir los posibles artefactos y aumentar la reproducibilidad de los experimentos.

Varias vías de reparación del ADN han evolucionado para abordar los diferentes tipos de lesiones de ADN que pueden surgir en las células, todas las cuales están altamente reguladas tanto en el espacio como en el tiempo. Uno de los períodos más vulnerables del ciclo celular es la fase S, cuando se produce la síntesis de ADN. Si bien la proliferación es fundamental para la vida, también supone un reto importante. Las células necesitan asegurar una replicación fiel de su genoma para evitar que las mutaciones se transmitan a las generaciones futuras. En consecuencia, la proliferación proporciona un punto terapéutico de intervención que se ha empleado para el desarrollo de enfoques terapéuticos en el campo de la oncología.
Todas las principales técnicas utilizadas para estudiar el reclutamiento de proteínas en las lesiones de ADN tienen sus fortalezas y limitaciones. La microirradiación tiene una mejor resolución espacial y temporal1 que la mayoría de los métodos alternativos, como las imágenes inmunofluorescentes de focos inducidos por radiación ionizante (IRIF), la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) o el fraccionamiento bioquímico. Sin embargo, la micro-irradiación laca la solidez de las técnicas antes mencionadas que pueden muestrear un gran número de células al mismo tiempo.
Para investigar la reparación del ADN en la fase S, uno debe ser capaz de distinguir las células de la fase S en una población de cultivo celular asíncrono. Hay muchos métodos bien conocidos para abordar esto, que involucran la sincronización de las células o la visualización de las diferentes fases del ciclo celular. Sin embargo, ambos enfoques introducen desafíos significativos y posibles artefactos. Los métodos de sincronización química ampliamente utilizados para enriquecer las células en la fase S temprana (por ejemplo, doble bloqueo de timidina, afinicicolina y tratamiento con hidroxiurea) logran la sincronización a través de la inducción del estrés de replicación y, finalmente, el daño del ADN en sí. Esto limita el uso de estos métodos para estudiar los procesos de reparación del ADN en la fase S2. La sincronización a través de la inanición y liberación sérica solo es aplicable a un número limitado de líneas celulares, excluyendo en gran medida las líneas celulares cancerosas que dependen menos de los factores de crecimiento para la progresión del ciclo celular en comparación con las líneas celulares no transformadas. El sistema Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) es una herramienta particularmente útil para estudiar el ciclo celular, pero tiene una limitación fundamental a la hora de diferenciar entre las fases del ciclo celular S y G23.
Aquí se muestra que el uso de PCNA marcado fluorescentemente como un marcador no invasivo para la fase S limita los inconvenientes de los métodos químicos de sincronización del ciclo celular, al tiempo que permite una mayor especificidad y flexibilidad que el sistema FUCCI. Como marcador único, el PCNA no solo puede resaltar las células de fase S en una población asíncrona, sino que también puede mostrar la progresión exacta de las células dentro de la fase S (es decir, fase S temprana, media o tardía)4. Los bajos niveles de expresión de PCNA exógeno y etiquetado aseguran una interferencia mínima tanto con la progresión del ciclo celular como con los procesos de reparación del ADN. Es importante destacar que el PCNA también sirve como un control interno para la inducción adecuada del daño en el ADN, ya que está involucrado en la reparación de varias lesiones de ADN y se recluta en sitios de daño al ADN inducidos localmente1,4.
Los experimentos presentados aquí demuestran cómo medir la dinámica de reclutamiento de EXO1b en fase S y cómo esto se ve afectado por el inhibidor de PARP bien establecido, olaparib. La actividad de la nucleasa EXO1b es relevante para una amplia gama de vías de reparación del ADN, incluida la reparación de desajustes (MMR), la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y la reparación de roturas de doble cadena (DSB). En la fase S, EXO1b juega un papel importante en la recombinación homóloga (HR) a través de la formación de voladizos de 3' ssDNA durante la resección del ADN5. EXO1b se ha implicado aún más en la replicación del ADN con funciones en la activación del punto de control para reiniciar las horquillas de ADN estancadas, así como la eliminación del cebador y la maduración del fragmento de Okazaki en la hebra rezagada durante el desplazamiento de la hebra en la replicación5. El reclutamiento de EXO1b a sitios de ADN dañados está regulado por la interacción directa con poli (ADP-ribosa) (PAR)6,7. Debido a las numerosas implicaciones específicas del ciclo celular de EXO1b, es una excelente opción para los estudios de reclutamiento específicos de fase S que utilizan PCNA.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>Para enfriar formaldehído</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal Anti-EXO1 Conejo</td><td>Anticuerpo</td>primario <td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td></tr><tr><td>Anti-fosfo-histona H2A. X (Ser139) Anticuerpo, clon JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA para el bloqueo</td></tr><tr><td>de BrdU (5-Bromo-2'-desoxiuridina)</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>agente presensibilizante</td></tr><tr><td>Citifluor&trade; Solución de montaje AFR3</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>17973-10</td><td>antidecoloración que contiene PBS solución para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>tinción de ácido nucleico</td></tr><tr><td>DMEM Medio Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>Medio de cultivo celular para células</td></tr><tr><td>HEK293T DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Disolvente</td></tr> <tr>de control y disolución Vehichle<td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>vector de expresión viral para EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (en pRetroQ)</td><td>clonación personalizada</td><td>na</td><td>El ADNc de EXO1b se clonó en los sitios NheI, BamHI del vector pRetroQ-AcGFP1-N1.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Suplemento de medios</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Rojo de fenol medio libre para microscopía</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de IgG (H+L) anti-ratón de cabra con alta adsorción cruzada, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Línea celular para empaquetamiento viral</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Agente tampón para complementar el medio de obtención de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>agente presensibilizante</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (modificado) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108 Medio de</td><td>cultivo celular para células U-2 OS</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>construcción de PCNA no viral adecuada para el marcador del ciclo celular</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>construcción de PCNA no viral adecuada para el marcador del ciclo celular</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (en pBABE)</td><td>clonación personalizada</td><td>na</td><td>El ADNc de mPlum-PCNA se clonó a partir de Addgene #55994 en los sitios BamHI, SalI de pBABE (puro)</td></tr><tr><td>Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller Sistema</td> de <td>imagen confocal</td><td>Nikon</td><td>na</td> Unidad</tr><tr><td>láser Nikon LUN4</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>sistema de excitación</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm Unidad láser FRAP</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Unidad láser FRAP</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Confocal Controller Software</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Software de control confocal</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Nikon Ti2-E</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>base de microscopio epifluorescente invertido</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP Sistema de iluminación modular</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>sistema de iluminación</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (en pRetroQ)</td><td>clonación personalizada</td><td>na</td><td>El ADNc de NTHL1 se clonó en los sitios NheI, SalI del vector pRetroQ-mCherry-N1.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Cubreobjetos con cámara (4 pocillos)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Microscopía de células vivas cámara de cultivo celular</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>Inhibidor de PARP</td></tr><tr><td>Opti-MEM Medios de suero reducidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Medio de dilución para transfección transitoria</td></tr><tr><td>Solución acuosa de paraformaldehído (32 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fijador</td></tr><tr><td>pBABE (hygro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>vector de expresión retroviral (para niveles de expresión bajos)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>vector de expresión retroviral (para niveles de expresión bajos)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>vector de expresión retroviral (para niveles de expresión bajos)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>vector de expresión retroviral (para niveles de expresión bajos)</td></tr><tr><td>Anticuerpo PCNA (PC10)</td><td>Anticuerpo primario</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Suplemento de medios</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Aumentar la eficiencia de la infección viral</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>vector de expresión retroviral</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>vector de expresión retroviral</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>vector de expresión retroviral</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>vector de expresión retroviral</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Vector de empaquetamiento viral</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>11360070 Suplemento para medio de obtención de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Triton X-100 solución acuosa (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Diluido en PBS para tampón de permeabilización celular</td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Diluido en PBS para dividir</td></tr><tr><td>celdas U-2 OS Células</td><td>ATCC</td><td>&nbsp; HTB-96</td><td>Línea celular óptima para experimentos de microscopía Kit</td></tr><tr><td>universal de detección de micoplasma</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>Kit de detección de micoplasma basado en PCR</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Vector de envoltura de proteína viral</td></tr></tbody></table>

microirradiación láser para estudiar el reclutamiento de adn durante la fase s

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

La reparación del daño en el ADN mantiene la integridad genética de las células en un entorno altamente reactivo. Las células pueden acumular varios tipos de daño en el ADN debido a fuentes endógenas y exógenas, como las actividades metabólicas o la radiación UV. Sin la reparación del ADN, el código genético de la célula se ve comprometido, socavando las estructuras y funciones de las proteínas y potencialmente causando enfermedades. 
Comprender la dinámica espaciotemporal de las diferentes vías de reparación del ADN en varias fases del ciclo celular es crucial en el campo de la reparación del daño del ADN. Las técnicas actuales de microscopía fluorescente proporcionan excelentes herramientas para medir la cinética de reclutamiento de diferentes proteínas de reparación después de la inducción del daño al ADN. La síntesis de ADN durante la fase S del ciclo celular es un punto peculiar en el destino celular con respecto a la reparación del ADN. Proporciona una ventana única para detectar errores en todo el genoma. Al mismo tiempo, los errores de síntesis de ADN también representan una amenaza para la integridad del ADN que no se encuentra en las células que no se dividen. Por lo tanto, los procesos de reparación del ADN difieren significativamente en la fase S en comparación con otras fases del ciclo celular, y esas diferencias son poco conocidas. 
El siguiente protocolo describe la preparación de líneas celulares y la medición de la dinámica de las proteínas de reparación del ADN en fase S en sitios de daño del ADN inducidos localmente, utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con una línea láser de 405 nm. El PCNA etiquetado (con mPlum) se utiliza como un marcador del ciclo celular combinado con una proteína de reparación de interés marcada con AcGFP (es decir, EXO1b) para medir el reclutamiento de daño en el ADN en la fase S.

Las células abordan cada tipo de lesión de ADN de una manera específica que también depende de la fase del ciclo celular en la que se encuentren. Por ejemplo, después de la microirradiación, las roturas de doble cadena (DSB) se procesarán mediante unión final no homóloga (NHEJ) o HR dependiendo de la fase del ciclo celular. Las nucleasas que actúan más extensamente durante las fases S y G2 del ciclo celular crean voladizos de ADN que son cruciales para la FC adecuada. Para promover la evaluación de las células en fase S, se empleó PCNA como un marcador del ciclo celular de un solo color. La Figura 1A muestra el perfil de localización de mPlum-PCNA durante la progresión del ciclo celular. El PCNA tiene una distribución completamente homogénea en el núcleo en la fase G1 y G2 (mientras que también se excluye principalmente de los nucleolos). En la fase S, el PCNA se localiza en sitios de replicación del ADN, que se pueden visualizar como puntos brillantes en el núcleo. En las células de fase S temprana, las manchas son relativamente pequeñas y están distribuidas equitativamente por todo el núcleo de la célula. Progresando a la fase S media, las manchas se vuelven borrosas y se localizan más hacia el perímetro del núcleo y los nucleolos. En la fase S tardía, las manchas se reducen en número, pero se vuelven cada vez más grandes a medida que el PCNA se concentra en los sitios de replicación tardía(Figura 1B). Es importante destacar que la expresión exógena de PCNA de la columna vertebral del vector pBABE fue menor que los niveles endógenos, pero fue suficiente para la detección por microscopía que minimiza los artefactos potenciales en la progresión del ciclo celular y DDR. La Figura 1C muestra el grado de sobreexpresión de PCNA en comparación con los niveles endógenos. Tenga en cuenta que la banda correspondiente a mPlum-PCNA migra más lentamente debido a su mayor tamaño.
Nuestro objetivo fue introducir DSB durante la microirradiatura para investigar el reclutamiento dependiente de PARP1/2 de EXO1b a estas lesiones en fase S. La Figura 2A muestra que las dosis bajas de energía (1000 μs de tiempo de permanencia) no inducen el reclutamiento de EGFP-FBXL10, un respondedor DSB (componente del complejo FRUCC 8),mientras que fue suficiente para inducir el reclutamiento de NTHL1-mCherry, una proteína de la vía de reparación por escisión de base (BER), reclutando a sitios de daño oxidativo del ADN10,11,12. A 3000 μs de tiempo de permanencia, tanto EGFP-FBXL10 como NTHL1-mCherry reclutan, demostrando una salida láser que genera lesiones oxidativas y DSB. Fortaleciendo estos resultados, la Figura 2B muestra tinción de inmunofluorescencia contra γH2A.X (marcador DSB), que es claramente más evidente cuando se usan dosis de energía más altas. PcNA sirve como un marcador del ciclo celular y un marcador para una microirradiación exitosa, ya que recluta adecuadamente con ambos ajustes de tiempo de permanencia con láser. Es importante destacar que tanto el PCNA exógeno como el endógeno marcado con proteínas fluorescentes pueden usarse para esta función de reportero, ya que se comportan de manera similar(Figura 3). El PCNA etiquetado endógenamente se diseñó insertando mRuby en el marco con el primer exón en un alelo del locusPCNA 13 (la línea celular era un regalo amable de Jörg Mansfeld).
La Figura 4A y la Figura 4C muestran el reclutamiento de EXO1b marcado con AcGFP en células de fase S. EXO1b alcanza el nivel máximo de acumulación en los sitios de micro-irradiación alrededor de 1 minuto y luego comienza lentamente a desconectarse de las lesiones de ADN después. Los enriquecimientos en sitios de microirradiación se denotan por una unidad de fluorescencia relativa &gt; 1 en el gráfico. En presencia de olaparib, la acumulación de EXO1b en la franja láser a 1 minuto es significativamente menor en comparación con el control del vehículo. Estos resultados cons están de acuerdo con la literatura6,7. La figura 4B muestra las regiones representativas para la cuantificación (áreas A, B y C) como se describe en el punto 6 del protocolo. La Figura 4D muestra los niveles de expresión comparables de EXO1b endógeno y EXO1b-AcGFP exógeno en células utilizadas para la microirradia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> Figura 1: Patrón de localización de PCNA. (A) Las imágenes muestran el patrón de localización de PCNA exógeno e integrado de manera estable a lo largo del ciclo celular en las células del sistema operativo U-2. (B) Las imágenes muestran patrones de focos de PCNA en diferentes etapas de la fase S (temprana, media y tardía) en células de LA SO U-2. (C) Western blot que muestra niveles endógenos y exógenos de PCNA en las células del SISTEMA operativo U-2 utilizadas para la obtención de imágenes. La barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> Figura 2: Inducción de DSB a través de la potencia de salida optimizada del láser. (A) La configuración del láser se puede optimizar para inducir diferentes formas de daño al ADN. Las células de la SO U-2 que expresan de manera estable tanto EGFP-FBXL10 como NTHL1-mCherry se utilizaron para identificar DSB y sitios de lesiones oxidativas, respectivamente. La microirradiación con una línea láser de 405 nm se llevó a cabo en células asincrónicas U-2 OS con un tiempo de permanencia de 1000 μs o 3000 μs. La barra de escala representa 20 μm. (B) La tinción inmunofluorescente contra γH2A.X se realizó en células epiteliales pigmentarias de la retina humana (hTERT RPE-1) con PCNA endógeno marcado con mRuby. Las células se fijaron y procesaron 5 minutos después de la microirradiación con un tiempo de permanencia de 1000 μs o 3000 μs. La barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> Figura 3: Reclutamiento comparable de mRuby-PCNA endógeno y mPlum-PCNA exógeno a sitios de microirradiación a 1000 μs o 3000 μs de tiempo de permanencia del láser. Tanto el PCNA endógeno como el exógeno marcado forman focos de replicación durante la fase S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> Figura 4: Reclutamiento dependiente de PARP1/2 de EXO1b en fase S. Las células del sistema operativo U-2 que expresan de manera estable EXO1b-AcGFP y mPlum-PCNA fueron microirradiadas con una línea láser FRAP de 405 nm utilizando un tiempo de permanencia de 3000 μs. (A) Imágenes representativas de células microirradiadas en los puntos de tiempo indicados después del pretratamiento con control del vehículo (DMSO) u olaparib (1 μM). La barra de escala representa 20 μm. (B) Imágenes representativas de regiones definidas de áreas A, B y C para el análisis de reclutamiento. La barra de escala representa 20 μm. (C) La dinámica de reclutamiento de daños en el ADN fue capturada por imágenes de células vivas. Los valores medios relativos de fluorescencia y las imágenes se adquirieron cada 5 s durante 12 min. Para cada condición, se evaluaron ≥30 células. Los valores medios relativos de fluorescencia (líneas negras sólidas) y el error estándar (rango visualizado por un área sombreada) se trazaron contra el tiempo. La línea discontinua muestra los valores de reclutamiento a 1 min después de la microirradiatura. La diferencia entre el tratamiento con DMSO (n = 32) y olaparib (n = 31) se calculó mediante una prueba de Mann-Whitney. Astérix denota p&lt;0.0001. (D) Western blot compara los niveles de expresión de EXO1b endógeno y EXO1b-AcGFP exógeno en células utilizadas para la microirradia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe un método no invasivo para identificar eficientemente las células de fase S para estudios de microscopía aguas abajo, como la medición del reclutamiento de proteínas de reparación del ADN mediante microirradiación láser.

Microirradiación láser para estudiar el reclutamiento de ADN durante la fase S

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Este protocolo ayuda a comprender el reclutamiento espacial y temporal de proteínas de reparación del daño del ADN, teniendo en cuenta la fase del ciclo celular. Para la discriminación del ciclo celular, utilizamos PCNA marcado con proteínas fluorescentes como un marcador de la fase S, que elude los artefactos introducidos por otros métodos de sincronización del ciclo celular. Esto, combinado con la microirradiación basada en láser, proporciona una resolución espaciotemporal sin precedentes a la cinética de proteínas de reparación del daño en el ADN.El éxito en la utilización rutinaria de nuestro protocolo se basa en el conocimiento básico de las imágenes confocales. 24 horas antes de la microirradiatura, plate un total de ocho por 10 a la cuarta célula en 500 microlitros a un mililitro de medios en un vidrio de cubierta de cuatro pomos. Una hora antes de la microirradiatura, intercambie el medio de crecimiento regular con un medio de imagen que contenga olaparib o un control de vehículo como DMSO.Al menos cuatro horas antes de la obtención de imágenes, encienda la cámara ambiental y los componentes del microscopio. Encienda la calefacción, el suministro de dióxido de carbono y el regulador de humedad. Inicialice las fuentes de luz junto con las líneas láser al menos una hora antes de transferir las células al microscopio.Engrase el objetivo del microscopio y coloque un vidrio de cubierta con cámara debajo del microscopio. Para seleccionar células de fase S en una población asíncrona, busque a través del ocular el patrón de localización único del PCNA marcado con mPlum en fase S y seleccione un campo de visión que tenga suficientes células de fase S para la microirradiación. Establezca la región de interés para la microirradiatura utilizando el software asociado para insertar líneas binarias.Para establecer el número deseado de líneas y el espaciado, haga clic en binario, luego seleccione insertar línea, círculo y elipse para dibujar el número deseado de líneas, luego convierta estas líneas binarias en ROI de estimulación haciendo clic en ROI, mueva binario a ROI, luego haga clic con el botón derecho en cualquiera de los ROI y seleccione usar como ROI de estimulación S1. Coloque estas líneas en el campo de visión para que pasen a través del núcleo de las células. Antes de la microirradiación, para identificar los focos de PCNA para su posterior análisis, tome una imagen de mayor resolución del campo de visión estableciendo los parámetros necesarios en la GUI compacta A1 LFOV y las ventanas del área de escaneo A1 LFOV seguidas de presionar el botón de captura. Para configurar la microirradiación, abra la pestaña de estimulación ND, luego acceda a la ventana de programación de tiempo para adquirir una serie de imágenes de preestimulación y luego una serie de imágenes de postestimulación utilizando los escáneres Galvano.Configure tres fases en la ventana de programación de tiempo. En la columna adquisición y estimulación, seleccione adquisición, estimulación y adquisición para las tres fases, respectivamente. Para la fase de estimulación, establezca S1 como el ROI.En la ventana Galvano XY, configure la salida de potencia del 100% láser para la línea láser de 405 nanómetros y establezca el tiempo de permanencia para la microirradiación. Para configurar la creación de imágenes de lapso de tiempo para la ventana de tiempo y los intervalos deseados, utilice la GUI compacta A1 LFOV de programación de tiempo y las ventanas de área de escaneo A1 LFOV. Optimice la configuración de porcentaje de potencia, ganancia y desplazamiento del láser para reducir el blanqueamiento fotográfico durante la obtención de imágenes en la ventana de gui compacta A1 LFOV.Dependiendo de la cinética de la proteína, extienda o acorte el intervalo entre imágenes o la duración del lapso de tiempo total estableciendo el intervalo y la duración deseados para la fila de adquisición de la tercera fase en la ventana de programación de tiempo. Presione ejecutar ahora para ejecutar la microirradiatura y la posterior imagen de lapso de tiempo. Al final de la imagen de lapso de tiempo, guarde los ROI de estimulación como imágenes separadas, lo que será útil para identificar las coordenadas de la microirradia en cualquier software posterior utilizado para el análisis.El PCNA tiene una distribución completamente homogénea en el núcleo en las fases G1 y G2. En la fase S, el PCNA se localiza en sitios de replicación del ADN, que se pueden visualizar como puntos brillantes en el núcleo. En las células de fase S temprana, las manchas son relativamente pequeñas y están distribuidas equitativamente por todo el núcleo de la célula.Mientras progresan a la fase S media, las manchas se vuelven borrosas y se localizan más hacia el perímetro del núcleo y los nucleolos. En la fase S tardía, las manchas se reducen en número, pero se vuelven cada vez más grandes a medida que el PCNA se concentra en los sitios de replicación tardía. Las dosis bajas de energía, como 1.000 microsegundos de tiempo de permanencia, no inducen el reclutamiento de EGFP-FBXL10, un respondedor de rotura de doble cadena, pero son suficientes para inducir el reclutamiento de NTHL1-mCherry, una proteína de la vía de reparación de la escisión base que se recluta en sitios de daño oxidativo del ADN.A los 3.000 microsegundos de tiempo de permanencia, se reclutan tanto EGFP-FBXL10 como NTHL1-mCherry, demostrando una salida láser que genera tanto lesiones oxidativas como roturas de doble cadena. EXO1b alcanza un nivel máximo de acumulación y sitios de microirradiación alrededor de un minuto, y luego comienza lentamente a desconectarse de las lesiones de ADN. En presencia de olaparib, la acumulación de EXO1b en la banda láser en un minuto es significativamente menor en comparación con el control del vehículo.Es crucial que el microscopio tenga tiempo suficiente para calentarse y que el cultivo y las condiciones sean óptimas para cada experimento para garantizar resultados consistentes. Además, es importante optimizar la configuración del láser con diferentes reporteros de daño del ADN para detectar lesiones específicas en el ADN. Después de la microirradiación, considere validar los resultados con métodos bioquímicos clásicos, como el fraccionamiento, la inmunoprecipitación o ChIP.Estos enfoques muestrean una población celular más grande, proporcionando así fuerza estadística.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser...

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Aprende a analizar la dinámica de reclutamiento de proteínas de reparación de ADN durante la fase S mediante microirradiación láser y microscopía confocal en células vivas. Este método permite estudiar con alta resolución temporal los mecanismos de respuesta al daño genético.

Microirradiación láser para estudiar el reclutamiento de ADN durante la fase S

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