Name: Modelado de los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes utilizando una jeringa y una aguja (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende a modelar el estrés hemodinámico en células tumorales circulantes utilizando una jeringa y aguja. Este método simple permite estudiar la viabilidad celular y los mecanismos de resistencia mecánica en metástasis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El desarrollo del modelo demostrado aquí fue apoyado por la subvención del DOD W81XWH-12-1-0163, las subvenciones de los NIH R21 CA179981 y R21 CA196202, y el Fondo de Investigación de Metástasis Sato.

1. Preparación celular
<ol><li>Libere las células de la placa de cultivo de tejidos cuando el 70-90% confluyen siguiendo las pautas recomendadas para la línea celular en uso.<ol>
<li>Por ejemplo, aspire el medio de crecimiento para las células PC-3 y lave el plato de 10 cm de las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio (PBS).</li>
		<li>Aspire el PBS antes de agregar 1 ml de tripsina al 0,25% utilizando el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Después de observar el desprendimiento de las células bajo un microscopio invertido, agregue 5 ml de medio DMEM: F12 que contenga un 10% de suero bovino fetal para inhibir la tripsina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque la suspensión celular en un tubo cónico.</li>
	<li>Determinar la concentración celular y el número total de células.</li>
	<li>Las células de pellets por centrifugación (300 × g durante 3 min), aspiran el sobrenadante y resuspend las células en medio de cultivo de tejido libre de suero a 5 × 105 células/ml. NOTA: Es fundamental que el medio de ensayo contenga al menos 1,17 mM de Ca++ ya que se ha demostrado que el Ca++ extracelular es necesario para la resistencia celular a FSS15.</li>
</ol>2. Exposición al estrés por cizallado de fluidos
<ol><li>Antes de exponer las células a FSS, corte un tubo de poliestireno de 14 ml de fondo redondo en la línea de 7 ml. Mezcle la suspensión celular, coloque 5 ml de la suspensión en el tubo de corte y recoja muestras de control estáticas. NOTA: El volumen necesario a recoger para la muestra estática depende del ensayo de viabilidad utilizado (consulte el paso 3).</li>
	<li>Extraiga la suspensión celular en una jeringa de 5 ml y coloque una aguja de 30 G 1/2". Desencuelte la aguja, coloque la jeringa en una bomba de jeringa, asegure la jeringa y establezca el caudal para alcanzar el nivel deseado de FSS. NOTA: La Tabla 1 muestra la tensión máxima de cizallamiento de la pared para diferentes agujas y caudales, así como el nivel mínimo de FSS dependiendo del tamaño de la celda (10, 15 y 20 μm). Inspeccione la aguja antes de usarla para asegurarse de que no esté doblada; si no está seguro, reemplace la aguja por una nueva. La integridad de la aguja puede tener un impacto significativo en el nivel de FSS aplicado.</li>
	<li>Haga funcionar la bomba de la jeringa y recoja la muestra cortada en el tubo de corte en un ángulo aproximado de 45 ° para reducir la formación de espuma. Recolectar una muestra dependiendo del tipo de ensayo de viabilidad o de las necesidades del ensayo aguas abajo.<ol>
<li>Retire cuidadosamente la jeringa y la aguja de la bomba de la jeringa y use alicates para extraer la aguja de la jeringa, teniendo cuidado de no tocar la aguja. NOTA: Las agujas no biseladas se pueden usar indistintamente con agujas biseladas como medida de seguridad adicional.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vuelva a colocar la suspensión cizallada en la jeringa, vuelva a colocar cuidadosamente la aguja con alicates y vuelva a colocarla en la bomba de la jeringa.</li>
	<li>Repita los pasos 2.3 y 2.4 hasta que la suspensión celular haya sido expuesta al número deseado de pulsos de FSS. NOTA: Para evaluar la capacidad de las células para resistir la destrucción mecánica de la exposición a FSS, la suspensión celular generalmente se somete a 10 pulsos de FSS. Sin embargo, se ha demostrado que las células comienzan a sufrir adaptaciones biológicas en respuesta a FSS después de 2 pulsos24.</li>
</ol>3. Medición de la viabilidad
NOTA: La viabilidad se puede evaluar mediante ensayos enzimáticos (luciferasa, resazolina y WST-1), contando células intactas, citometría de flujo o mediante ensayos clonogénicos.
<ol><li>Para todas las medidas de viabilidad, recoja una muestra antes de exponer las células a FSS.<ol>
<li>Para ensayos enzimáticos, tome alícuotas duplicadas de 100 μL y colóquelas en una placa de 96 pozos.</li>
		<li>Para la citometría de flujo, tome una alícuota de 500 μL y colóquela en un tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Para el ensayo clonogénico, recolectar una alícuota de 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensayo enzimático<ol>
<li>Recolecte muestras de 100 μL después de 1, 2, 4, 6, 8 y 10 pulsos de exposición a FSS y colóquelas en una placa de 96 pozos.</li>
		<li>Agregue el sustrato deseado y siga el protocolo para el ensayo utilizado:<ol>
<li>Para la resazolina, agregue 20 μL de una solución de 0,15 mg/ml a cada pozo. Añadir 20 μL de solución de resazurina de 0,15 mg/ml a los pozos que contengan 100 μL de medio solo. Incubar durante 2 h en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C. Mida la absorbancia utilizando un lector de placas capaz de leer la fluorescencia (579 excitación / emisión 584).</li>
			<li>Para las células que expresan luciferasa, agregue 100 μL de 15 mg/ml de D-luciferina a 5 ml de medio. Agregue 100 μL de esa solución a cada pozo que contenga células. Espere 5 minutos y luego lea la placa con un lector compatible con luminiscencia.</li>
			<li>Para WST-1, agregue 10 μL de WST-1 a cada pozo, incluidos los pozos que contengan solo medio. Incubar durante 4 h, y luego leer la absorbancia entre 420 y 480 nm utilizando un lector de placas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Compare la señal promediada de cada una de las muestras expuestas a FSS con la muestra de control estática promediada para obtener el porcentaje de células viables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Citometría de flujo24<ol>
<li>Recolecte muestras de 500 μL y colóquelas en tubos centrífugos de 1,5 ml después de 1, 2, 5 y 10 pulsos de FSS.</li>
		<li>Centrifugar muestras (500 × g durante 3 min), y desechar los sobrenadantes.</li>
		<li>Resuspónda los gránulos con 1 ml de PBS libre de calcio y magnesio, y centrífuga las muestras (300 × g durante 3 min).</li>
		<li>Suspender los gránulos con 500 μL de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (PBS con albúmina sérica bovina al 0,5% y azida de sodio al 0,1%) con perlas de conteo y colorantes impermeables a la membrana o de viabilidad como yoduro de propidio (1,75 μg/ml).</li>
		<li>Determinar la viabilidad comparando la relación de células viables, normalizadas a cuentas de conteo, en muestras esquiladas con la de la muestra estática.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensayo clonogénico<ol>
<li>Tome 100 μL de la muestra estática y agregue 900 μL de medio de crecimiento para hacer una dilución de 1:10.</li>
		<li>Tome 100 μL de la muestra diluida 1:10 y agregue 900 μL de medio de crecimiento para hacer una dilución final de 1:100.</li>
		<li>Agregue 100 μL de la muestra de dilución 1:100 en cada uno de los 3 pozos de un plato de 6 pozos que contenga 2 ml de medio de crecimiento.</li>
		<li>Repita los pasos 3.4.1-3.4.3 con muestras que hayan sido sometidas a 10 pulsos de FSS.</li>
		<li>Deje que las células crezcan durante 7-10 días sin cambiar el medio, y verifique la formación de colonias. Una vez que se hayan formado colonias de células ≥50, aspire el medio de crecimiento, enjuague cada pozo con 1 ml de PBS, aspire el PBS y fije durante 5 minutos con 1 ml de etanol helado al 70% (EtOH). Es importante destacar que arregle las muestras cizalladas y estáticas al mismo tiempo.</li>
		<li>Después de fijar las muestras, aspire el EtOH y agregue de 1 a 2 ml de solución violeta cristalina (0.1% de violeta de cristal en 90% H2O, 10% de EtOH) durante 5 min.</li>
		<li>Enjuague con un exceso de agua y deje que el plato se seque</li>
		<li>Cuente las colonias (grupos de ≥50 células) tanto para las muestras estáticas como para las esquiladas. Compare la relación entre el número promedio de colonias de la muestra esquilada y el número promedio de colonias de la muestra estática para determinar la viabilidad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+90%25+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+medicine%22%5BJournal%5D)">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+survival+and+extravasation+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravascular survival and extravasation of tumor cells.</a> Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).</li>
<li>Labelle, M., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+hours+of+metastasis%3A+the+importance+of+cooperative+host-tumor+cell+interactions+during+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).</li>
<li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metastatic inefficiency.</a> Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).</li>
<li>Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+number+of+tumor+metastases%3B+experiments+with+a+transplantable+mouse+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor.</a> Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+quantitative+analysis+of+distribution+and+fate+of+tumor+embolilabeled+with+125+I-5-iodo-2%27-deoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine.</a> Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).</li>
<li>Cameron, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+metastasis+in+lung%3A+cell+survival%2C+dormancy%2C+and+location+dependence+of+metastatic+inefficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency.</a> Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).</li>
<li>Luzzi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+nature+of+metastatic+inefficiency%3A+dormancy+of+solitary+cells+after+successful+extravasation+and+limited+survival+of+early+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases.</a> American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+circulating+tumor+cell+capture+ability+of+a+slit+filter-based+method+in+comparison+to+a+selection-free+method+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types.</a> International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031(2020).</li>
<li>Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+metastasis--integrating+intravasation%2C+circulation+and+end-organ+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+fluid+shear+stress+is+a+conserved+biophysical+property+of+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells.</a> PLoS One. 7 (12), 50973(2012).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Brass, L. F., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+physics+and+biorheology+in+the+setting+of+hemostasis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).</li>
<li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulent+blood+flow+in+the+ascending+aorta+of+humans+with+normal+and+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).</li>
<li>Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+shear+stress+and+hemodynamic+factors+in+a+model+of+coronary+artery+stenosis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis.</a> The American Journal of Physiology. 265 (5), Pt 2 1787-1796 (1993).</li>
<li>Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixing%2C+aeration+and+cell+damage%2C+30%2B+years+later%3A+what+we+learned%2C+how+it+affected+the+cell+culture+industry+and+what+we+would+like+to+know+more+about%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).</li>
<li>Vennin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trsient+tissue+priming+via+ROCK+inhibition+uncouples+pancreatic+cancer+progression%2C+sensitivity+to+chemotherapy%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.</a> Science Translational Medicine. 9 (384), 126(2017).</li>
<li>Mitchell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+reduces+circulating+tumor+cell+resistance+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).</li>
<li>Ortiz-Otero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+confer+shear+resistance+to+circulating+tumor+cells+during+prostate+cancer+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression.</a> Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).</li>
<li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA%2Factomyosin-dependent+mechano-adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li>
<li>Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+tumour+cell+composition+in+tumours+composed+of+paired+mixtures+of+mammary+tumour+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines.</a> British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Research. 52 (6), 1399(1992).</li>
<li>Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cancer+cell+mechanical+properties+after+fluid+shear+stress+exposure%3A+a+micropipette+aspiration+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Health+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study.</a> Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).</li>
<li>Gensbittel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+adaptability+of+tumor+cells+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis.</a> Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).</li>
<li>O'Leary, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+ascorbate+inhibits+pancreatic+cancer+metastases+via+a+peroxide-mediated+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17649(2020).</li>
<li>Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolysis+near+a+transversely+oscillating+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolysis near a transversely oscillating wire.</a> Science. 169 (3948), 871-873 (1970).</li>
<li>Rooney, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolysis+near+an+ultrasonically+pulsating+gas+bubble%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble.</a> Science. 169 (3948), 869-871 (1970).</li>
<li>Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+inertial+positions+and+viability+of+cells+in+suspension+under+different+in+vivo+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1711(2020).</li>
<li>Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biorheology+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">The biorheology of tumor cells.</a> Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).</li>
<li>Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+cancer+stem+cell-like+phenotype+in+MCF7+breast+cancer+cell+line+without+inducing+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition.</a> Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulatory+shear+flow+alters+the+viability+and+proliferation+of+circulating+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 27073(2016).</li>
<li>Fu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+MnSOD+promotes+survival+of+circulating+breast+cancer+cells+and+increases+their+resistance+to+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin.</a> Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+promotes+anoikis+resistance+of+cancer+cells+via+caveolin-1-dependent+extrinsic+and+intrinsic+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+actomyosin-dependent+survival%2Fchemoresistance+of+suspended+tumor+cells+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow.</a> Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).</li>
</ol>

MDH es cofundador, presidente y accionista de SynderBio, Inc. DLM es consultor de SynderBio, Inc.

Este artículo demuestra la aplicación de FSS a las células cancerosas en suspensión utilizando una jeringa y una aguja. Usando este modelo, se ha demostrado que las células cancerosas son más resistentes a pulsos breves de FSS de alto nivel en relación con las células epiteliales no transformadas15,22,24. Además, la exposición a FSS utilizando este modelo resulta en un rápido aumento de la rigidez celular, la activación de RhoA ...

La metástasis, o la diseminación del cáncer más allá del sitio inicial del tumor, es un factor importante que subyace a la mortalidad por cáncer1. Durante la metástasis, las células cancerosas utilizan el sistema circulatorio como una autopista para diseminarse a sitios distantes en todo el cuerpo2,3. Mientras se dirige a estos sitios, las células tumorales circulantes (CTC) existen dentro de un microambiente fluido dinámico a diferencia del de su tumor primario original3,4,5. Se ha propuesto que este microambiente fluido es una de las muchas barreras para la metástasis4. Existe un amplio acuerdo en el concepto de ineficiencia metastásica, es decir, que la mayoría de los CTC que entran en circulación perecen o no forman colonias metastásicas productivas6,7,8. Sin embargo, por qué la metástasis es ineficiente desde la perspectiva de un CTC individual es menos seguro y sigue siendo un área activa de investigación. Las CTC están separadas de la matriz extracelular, privadas de factores solubles de crecimiento y supervivencia que pueden estar presentes en el tumor primario, y expuestas al sistema inmune y a las fuerzas hemodinámicas de una manera muy diferente a la del tumor primario4. Cada uno de estos factores puede contribuir a la escasa supervivencia de los CTC, pero sus contribuciones relativas no están claras. Este artículo aborda la cuestión de cómo las fuerzas hemodinámicas afectan a las CTC.
Estudiar los efectos de las fuerzas hemodinámicas en los CTC es bastante desafiante. Actualmente, no existen sistemas in vitro diseñados que puedan replicar toda la dinámica espaciotemporal (corazón a capilares) y las propiedades reológicas del sistema vascular humano. Además, la forma en que los CTC experimentan el sistema circulatorio no está del todo clara. La evidencia experimental indica que la mayoría de las células cancerosas no circulan continuamente como las células sanguíneas. Más bien, debido a su tamaño relativamente grande (10-20 μm de diámetro), la mayoría de los CTC quedan atrapados en lechos capilares (6-8 μm de diámetro) durante períodos variables de tiempo (s a días) donde pueden morir, extravasar o ser desplazados al siguiente lecho capilar8,9,10,11. Sin embargo, hay algunas pruebas de que el tamaño de la CTC puede ser más heterogéneo in vivo, y que las CTC más pequeñas son detectables12. Por lo tanto, en función de la distancia y la velocidad del flujo sanguíneo, los CTC solo pueden circular libremente durante cuestión de segundos entre estos períodos de atrapamiento, aunque falta una descripción cuantitativa de este comportamiento13.
Además, dependiendo de dónde entren en circulación los CTC, pueden pasar a través de múltiples lechos capilares en el pulmón y otros sitios periféricos y a través del corazón derecho e izquierdo antes de llegar a su destino final. En el camino, los CTC están expuestos a diversas tensiones hemodinámicas, incluida la tensión de cizallamiento de fluidos (FSS), las fuerzas de compresión durante su atrapamiento en la microcirculación y, potencialmente, las fuerzas de tracción en circunstancias en las que podrían exhibir un rodar similar a un leucocitos a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos14. Por lo tanto, tanto la capacidad de modelar la circulación como la comprensión del comportamiento de CTC a modelar es limitada. Debido a esta incertidumbre, cualquier hallazgo de los sistemas modelo in vitro debe validarse en un organismo vertebrado experimental y, en última instancia, en pacientes con cáncer.
Con las advertencias antes mencionadas, este trabajo demuestra un modelo relativamente simple para aplicar FSS a células en suspensión para sondear los efectos de FSS en CTC descritos por primera vez en 201215. FSS resulta de la fricción del flujo sanguíneo contra la pared del vaso, lo que produce un gradiente de velocidad parabólica en condiciones de flujo laminar en vasos más grandes. Las células experimentan niveles más altos de FSS cerca de las paredes de los vasos y niveles más bajos cerca del centro del vaso sanguíneo. La viscosidad del fluido, el caudal y las dimensiones del conducto a través del cual se produce el flujo influyen en el FSS, como se describe en la ecuación de Hagen-Poiseuille. Esto se aplica a los flujos sanguíneos que se comportan como fluidos newtonianos, pero no se mantienen para la microcirculación. El FSS fisiológico varía en varios órdenes de magnitud con los niveles más bajos en los linfáticos (<1 dyn/cm2) y los más altos en las regiones alrededor de las válvulas cardíacas y las placas ateroscleróticas (>500 dyn/cm2)5. El esfuerzo cizallamiento medio de la pared en las arterias es de 10-70 dinas/cm2 y de 1-6 dinares/cm2 en las venas16,17.
En el corazón, las células pueden estar expuestas a flujos turbulentos alrededor de las valvas de las válvulas donde se puede experimentar FSS de muy alto nivel, pero de muy corta duración18,19. Aunque el campo del bioprocesamiento ha estudiado durante mucho tiempo los efectos de FSS en células de mamíferos en suspensión, esta información puede ser de valor limitado para comprender los efectos de FSS en CTC, ya que generalmente se centra en niveles mucho más bajos de FSS aplicados durante una larga duración20. Como se describe a continuación, usando una jeringa y una aguja, se puede aplicar FSS relativamente alto (decenas a miles de dinas / cm2)durante una duración relativamente corta (milisegundos) a una suspensión celular. Desde la descripción inicial de este modelo15,otros lo han empleado para estudiar los efectos del FSS sobre las células cancerosas21,22,23. Se pueden aplicar múltiples "pulsos" de FSS a las suspensiones celulares en un corto período de tiempo para facilitar los análisis experimentales posteriores. Por ejemplo, este modelo se puede utilizar para medir la capacidad de las células para resistir la destrucción mecánica por FSS midiendo la viabilidad celular en función del número de pulsos aplicados. Alternativamente, los efectos de la exposición a FSS en la biología de las células cancerosas se pueden explorar mediante la recolección de células para una variedad de análisis posteriores. Es importante destacar que parte de la suspensión celular se reserva como un control estático para comparar los efectos de FSS de aquellos que podrían estar asociados con el desprendimiento celular y el tiempo mantenido en suspensión.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>14 mL tubos de fondo redondo</td><td>Falcon - Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1/2" Aguja</td><td>BD</td><td>305106</td> Jeringa de 5 mL BD 309646 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa inferior negra de 96 pocillos</td><td>Costar - Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Detector de bioluminiscencia</td><td>AMI</td><td>AMI HTX</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Fracción V</td><td>Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Título de Células Azul</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>cristal violeta</td><td>Sigma</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>GoldBio</td><td>D-LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Aparato</td><td>70-3005</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado de los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes utilizando una jeringa y una aguja

Modeling the Effects of Hemodynamic Stress on Circulating Tumor Cells using a Syringe and Needle

Durante la metástasis, las células cancerosas de tejidos sólidos, incluidos los epitelios, obtienen acceso a la circulación linfática y hematógena donde están expuestas al estrés mecánico debido al flujo hemodinámico. Una de estas tensiones que experimentan las células tumorales circulantes (CTC) es el estrés por cizallamiento de fluidos (FSS). Si bien las células cancerosas pueden experimentar niveles bajos de FSS dentro del tumor debido al flujo intersticial, las CTC están expuestas, sin unión a la matriz extracelular, a niveles mucho mayores de FSS. Fisiológicamente, el FSS oscila entre 3 y 4 órdenes de magnitud, con niveles bajos presentes en los linfáticos (<1 gineco/cm2 ) y los niveles más altos se presentan brevemente a medida que las células pasan a través del corazón y alrededor de las válvulas cardíacas (>500 dinas/cm2). Hay algunos modelos in vitro diseñados para modelar diferentes rangos de tensión de cizallado fisiológico en varios marcos de tiempo. Este artículo describe un modelo para investigar las consecuencias de pulsos breves (milisegundos) de FSS de alto nivel en la biología de las células cancerosas utilizando un sistema simple de jeringas y agujas.

Se ha demostrado previamente que la resistencia elevada a la destrucción mecánica inducida por FSS es un fenotipo conservado a través de múltiples líneas celulares de cáncer y células cancerosas recién aisladas de tumores en relación con los comparadores de células epiteliales no transformadas15,24. Aquí, se probaron líneas celulares de cáncer adicionales de una variedad de orígenes tisulares(Tabla 2)para demostrar que la mayoría de estas células...

Aquí demostramos un método para aplicar estrés por cizallamiento de fluidos a las células cancerosas en suspensión para modelar los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes.

Modelado de los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes utilizando una jeringa y una aguja

During metastasis, cancer cells from solid tissues, including epithelia, gain access to the lymphatic and hematogenous circulation where they are exposed ...

Este protocolo expone a las células cancerosas en suspensión a breves pulsos de estrés por cizalla de líquidos para imitar ciertos aspectos de cómo las células cancerosas metastásicas están expuestas a las fuerzas hemodinámicas mientras están en el sistema circulatorio. Es una técnica relativamente simple para aplicar pulsos breves de estrés de cizalla de fluidos de alto nivel. Al intentar este protocolo, tenga cuidado con las agujas sin tapa y no las doble, ya que esto cambiará la tensión de cizallamiento de la fuerza aplicada.Este procedimiento puede producir aerosoles, así que use las medidas de seguridad apropiadas. Para comenzar, libere de 70 a 90% de células PC3 confluentes de la placa de cultivo de tejidos aspirando el medio de crecimiento y lavando la placa de 10 centímetros con cinco mililitros de PBS libre de calcio y magnesio. Luego, aspire el PBS y agregue un mililitro de tripsina al 0.25%.Después de la tripsinización, observe el desprendimiento de las células bajo un microscopio invertido. Para inhibir la tripsina, agregue cinco mililitros de medio DMEM/F12 que contenga 10% FBS. A continuación, coloque la suspensión celular en un tubo cónico y determine la concentración celular y el número total de células.Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante tres minutos, luego aspirar el sobrenadante y volver a colocar el pellet en un medio de cultivo de tejido libre de suero. Corte alrededor de la parte inferior del tubo de poliestireno de 14 mililitros en la línea de siete mililitros y coloque la suspensión de celda mixta en el tubo de corte. Recolecte por separado muestras de control estático de células antes de la exposición al estrés por cizallado de líquidos para usarlas para realizar ensayos.Para exponer la muestra de suspensión celular restante a la tensión de cizallamiento del fluido, extraiga la suspensión celular en una jeringa de cinco mililitros y conecte una aguja de media pulgada calibre 30. Coloque y asegure la jeringa con una aguja sin tapa en una bomba de jeringa y establezca el caudal para lograr el nivel deseado de tensión de cizallamiento del fluido. Haga funcionar la bomba de la jeringa y recoja la muestra cortada en el tubo de corte en un ángulo de aproximadamente 45 grados para reducir la formación de espuma.Retire cuidadosamente la jeringa de la bomba de la jeringa y use alicates para quitar la aguja, teniendo cuidado de no tocarla. Repita el procedimiento hasta que la suspensión celular haya sido expuesta al número deseado de pulsos de tensión de cizallado de fluido. Realice ensayos de viabilidad con las muestras estáticas antes de exponer las células a la tensión de cizallamiento del fluido.Para ensayos enzimáticos, transfiera 100 alícuotas de microlitros de las muestras estáticas por duplicado a una placa de 96 pozos. Luego, recolecte 100 microlitros de muestras después de la exposición al estrés por cizallamiento de fluidos y colóquelos en una placa de 96 pozos. Agregue 20 microlitros de una solución de resaurina de 0,15 miligramos por mililitro a cada pozo de muestra y a los pomos que contengan 100 microlitros de medio solo.Incube las placas del pozo en la incubadora de cultivo de tejidos de 37 grados Celsius durante dos horas, luego mida la fluorescencia y la absorbancia utilizando un lector de placas y obtenga el porcentaje de células viables comparando la señal promedio de cada una de las muestras expuestas al estrés por cizallamiento del fluido con la muestra de control promedio a estática. Del mismo modo, recolectar alícuotas de muestras estáticas para realizar citometría de flujo y ensayos clonogénicos como se describe en el manuscrito de texto. En el análisis representativo, la viabilidad de la biopsia singénica de células cancerosas epiteliales mamarias se evaluó mediante la conversión de resazourina después de exponer las células a una serie de pulsos de estrés por cizallamiento de líquidos.A pesar de que cada línea celular mostró diferentes perfiles de resistencia, no hubo diferencias significativas en la viabilidad después de 10 pulsos de exposición al estrés por cizallado de fluidos. Líneas celulares de cáncer adicionales de una variedad de orígenes tisulares demostraron la viabilidad de más del 20% después de 10 pulsos de estrés por cizallaje de fluidos, a excepción de las células MIA PaCa-2, que mostraron una viabilidad de menos del 10% debido a la sensibilidad a la destrucción mecánica por estrés por cizallaje de fluidos. Al recolectar la muestra estática antes de aplicar la tensión de cizallamiento de fluidos, asegúrese de que la suspensión celular sea una mezcla homogénea.Retire cuidadosamente la aguja con alicates y no doble ni toque la aguja. Además de medir la viabilidad celular, se pueden evaluar los cambios en la expresión génica, la señalización celular, la proliferación y la migración. Usando esto como un modelo de exposición al estrés por cizallamiento de fluidos, se puede estudiar cómo las células cancerosas resisten la destrucción por estrés por cizallamiento de fluidos y evaluar los efectos del estrés por cizallamiento de fluidos en la biología de las células cancerosas.Esta técnica ha sido utilizada por nuestro laboratorio y otros para explorar los efectos del estrés por cizallamiento de líquidos en las células tumorales circulantes. Estos estudios han demostrado que el estrés por cizallamiento de fluidos altera rápidamente las propiedades mecánicas de las células cancerosas y que esto contribuye a la capacidad de las células cancerosas para resistir la destrucción por estrés por cizallamiento de fluidos.

modeling-effects-hemodynamic-stress-on-circulating-tumor-cells-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se presenta el procedimiento para la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de microfluidos que recrea heterogéneos microambientes...

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

Fuente: Lim, M., et al. Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)En este video, un ratón anestesiado se somete a un procedimiento quirúrgico en el que se inyectan células cancerosas en la arteria carótida común (CCA) para facilitar la entrega dirigida al cerebro. El procedimiento implica la sutura y manipulación precisas de las arterias carótidas para dirigir las células inyectadas hacia la arteria carótida...

Modelado de metástasis de tumores cerebrales mediante la inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Describimos un ensayo de tapón de matrigel para ilustrar el potencial angiogénico de un conjunto de factores secretados por las células cancerosas utilizando dos modalidades de imagen complementarias, ultrasonido y endomicroscopía. El matrigel, un gel imitador de matriz extracelular (MEC), se utiliza para introducir al huésped (ratón) factores angiogénicos secretados al medio condicionado (CM).

Monitoreo Funcionalidad y Morfología de Vasculatura Reclutado por factores secretados por las células tumorales generadoras de crecimiento rápido

Este manuscrito describe el desarrollo de un modelo animal que permite probar directamente los efectos de la hipoxia tumoral sobre la metástasis y descifrar los mecanismos de su acción. Aunque los experimentos que se describen aquí se centran en el sarcoma de Ewing, se puede aplicar un abordaje similar a otros tipos de tumores.

Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Se desarrolló un procedimiento quirúrgico para administrar células tumorales mamarias al hígado murino mediante inyección en la vena porta. Este modelo permite la investigación de las etapas tardías de la metástasis hepática en un huésped totalmente competente para el sistema inmunitario, incluida la extravasación de células tumorales, la siembra, la supervivencia y el crecimiento metastásico en el hígado.

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

El modelado intracraneal de metástasis cerebral se complica por la incapacidad para controlar el tamaño del tumor y la respuesta al tratamiento con métodos precisos y oportunos. La metodología presentada combina la inyección de tumores intracraneales con el análisis de imágenes por resonancia magnética, que cuando se combina, cultiva inyecciones precisas y consistentes, monitorización animal mejorada y mediciones precisas del volumen tumoral.

Modelado de metástasis cerebrales a través de inyección intracraneal e imágenes de resonancia magnética

La metástasis cerebral es una causa de morbilidad y mortalidad graves en pacientes con cáncer. La mayoría de los modelos de ratón con metástasis cerebral se complican con metástasis sistémicas que confunden el análisis de la mortalidad y los resultados de la intervención terapéutica. Aquí se presenta un protocolo para la inyección carótida interna de células cancerosas que produce tumores intracraneales consistentes con tumores sistémicos mínimos.

Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Este protocolo presenta un modelo de tumor en un chip fisiológicamente relevante para realizar investigaciones básicas y traslacionales de alto rendimiento sobre el cáncer humano, avanzando en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y los enfoques de medicina personalizada con una descripción de los procedimientos de carga, mantenimiento y evaluación.

Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

El artículo describe un protocolo para simular los perfiles de temperatura transitoria y la variación espacio-temporal acoplada de la presión del fluido intersticial después del calentamiento suministrado por un sistema de hipertermia de radiofrecuencia dipolar. El protocolo se puede utilizar para evaluar la respuesta de los parámetros biofísicos que caracterizan el microambiente tumoral a las técnicas de hipertermia intervencionista.

Un enfoque de modelado computacional para investigar la influencia de la hipertermia en el microambiente tumoral

La técnica de inyección intracraneal estereotáctica permite la implantación precisa y localizada de células tumorales en la corteza del ratón, convirtiéndose en un modelo potente para estudiar la colonización metastásica del cerebro.

Modelado de la metástasis cerebral: análisis estandarizado de la colonización metastásica y los patrones histológicos de crecimiento mediante inyección intracortical estereotáctica

Aprende a modelar el estrés hemodinámico en células tumorales circulantes utilizando una jeringa y aguja. Este método simple permite estudiar la viabilidad celular y los mecanismos de resistencia mecánica en metástasis.

Modelado de los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes utilizando una jeringa y una aguja

Explorar más videos