Name: Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo de neutralización dual multiplexado para detectar anticuerpos IgG e IgM contra SARS-CoV-2 simultáneamente utilizando perlas y un analizador de flujo. Este método reduce el volumen de muestra y el tiempo de análisis.

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Este informe fue financiado por Luminex Corporation (Austin, TX). Los autores agradecen a Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) por la asistencia de edición científica.

<ol><li>Cameron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+microsphere+IgG+assay+for+SARS-CoV-2+using+ACE2-mediated+inhibition+as+a+surrogate+for+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489(2020).</li>
<li>Waterboer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+human+papillomavirus+serology+based+on+in+situ-purified+glutathione+s-transferase+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins.</a> Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).</li>
<li>Pickering, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+fluorescent+microsphere+immunoassay+for+antibodies+to+pneumococcal+capsular+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides.</a> American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).</li>
<li>Ayouba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+and+specific+serological+assay+based+on+Luminex+technology+for+detection+of+antibodies+to+Zaire+Ebola+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).</li>
<li>Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+P+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).</li>
<li>Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/">https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/</a> (2020).</li>
<li>EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance">https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance</a> (2020).</li>
<li>Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf</a> (2021).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4084(2012).</li>
<li>Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+multiplex+flow+cytometric+assay+with+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+auantitation+of+antibodies+to+tetanus%2C+diphtheria%2C+and+Haemophilus+influenzae+Type+b%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).</li>
</ol>

Stephen Angeloni y Sherry Dunbar son empleados de Luminex Corporation que produce algunos de los reactivos e instrumentos que se utilizaron en este estudio. La publicación en acceso abierto de este artículo fue patrocinada por Luminex Corporation

Este estudio amplió la funcionalidad de un ensayo de microesfera fluorescente multiplex, 3Flex, que evalúa cualitativamente la respuesta de IgG a la infección por SARS-CoV-21. Si bien muchos ensayos serológicos para COVID-19 detectan un solo antígeno, este ensayo evalúa simultáneamente los antígenos S, RBD y Nc, e incluye un control interno del isotipo deanticuerpos 7. Además, ACE2 se utiliza como indicador para detectar títulos de anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2.
Los ensayos de múltiples antígenos pueden ser particularmente útiles en el futuro para discriminar las respuestas inmunes entre personas infectadas y vacunadas. Con el SARS-CoV-2, si solo se evalúan los anticuerpos S y RBD, sería imposible discernir si esto se debió a una infección pasada o a una respuesta de anticuerpos de vacunación. Ninguna de las vacunas que están actualmente en uso se dirige al antígeno Nc, por lo que al evaluar los antígenos S/RBD y Nc, es posible distinguir la infección viral pasada (Nc- y S/RBD-positiva) de una respuesta de vacunación (S/RBD-positiva solamente; Nc-negativo).
En el presente estudio, los ensayos serológicos y de neutralización 3Flex (secciones 5 y 6) se transfirieron a un nuevo instrumento de análisis de flujo de doble reportero (secciones 7 y 8). Los protocolos típicos de inmunoensayo para ensayos multiplex basados en perlas son similares a los protocolos ELISA estándar, siguiendo pasos comparables para la incubación de muestras, la incubación de anticuerpos de detección / reportero y el análisis de los resultados8. Estudios previos también han demostrado cómo los ensayos ELISA estándar se pueden transferir a una plataforma de multiplexación basada en cuentas9.
Los protocolos de ensayo podrían transferirse sin problemas del instrumento predecesor de un solo reportero al nuevo sistema de doble reportero, como lo demuestran los resultados obtenidos para las muestras de prueba y los controles(Figura 4 y Figura 5). En el ensayo serológico, todas las muestras de suero positivas demostraron una disminución característica de la señal sensible a la dosis correspondiente tanto a una mayor dilución de la muestra como a una menor concentración de anticuerpos de detección, mientras que las señales para las muestras negativas se mantuvieron en niveles de fondo. Del mismo modo, para el ensayo de neutralización, la disminución de las señales para S y RBD, pero no Nc, correspondió al aumento de las concentraciones del competidor ACE2, mientras que el suero eliminado de IgG se vio mucho menos afectado por la adición de ACE2. La preincubación de las perlas con ACE2 durante 2 min antes de la adición de la muestra sérica (como se describe en las secciones 6 y 8), también se comparó con la combinación de las perlas con ACE2 y suero al mismo tiempo y produjo poca diferencia en los resultados (datos no mostrados). Sin embargo, debido a que los resultados obtenidos con las perlas más la etapa de preincubación ACE2 fueron más consistentes, fue el procedimiento final adoptado para el protocolo de ensayo de neutralización (secciones 6 y 8).
Debido a que el sistema de reportero dual incorpora un segundo canal de reportero fluorescente, ambos ensayos se convirtieron en ensayos de isotipado para medir simultáneamente las respuestas IgG e IgM. La funcionalidad de doble reportero del analizador de flujo permite la recolección de señales fluorescentes de dos reactivos de detección de reportero para cada analito en el múltiplex para cada muestra, duplicando efectivamente los datos generados por muestra en un ensayo. Para el desarrollo y la optimización de los protocolos de ensayo de doble reportero, se evaluaron varios colorantes reporteros y anticuerpos de detección disponibles comercialmente para el nuevo canal RP2(Figura 7 y Figura 8)para determinar las mejores opciones disponibles. El anticuerpo anti-IgM conjugado con el colorante reportero DL 405 no tuvo un buen desempeño en el canal RP2 (Figura 7), por lo que la biotina anti-IgG con SASB fue posteriormente evaluada para su detección en el canal RP2 (Figura 8). Se compararon tres combinaciones de reactivos de detección RP1 y RP2 en el ensayo de neutralización de doble reportero(Tabla 1 y Figura 9)para determinar las combinaciones de mejor rendimiento para la detección simultánea de anticuerpos neutralizantes IgG e IgM. Si bien hubo diferencias significativas en la intensidad de la señal entre el canal RP1 usando PE-anti IgM y el canal RP2 usando DL 549 anti-IgM, no hubo diferencias significativas en la medición del porcentaje de inhibición de unión por ACE2.
Se reconocen varias limitaciones al método actual y a este estudio. En primer lugar, las muestras probadas y utilizadas en el desarrollo y optimización del método se limitaron a conjuntos de 8-11 muestras. Se analizarán más muestras en estudios ampliados para verificar que el método esté completamente optimizado. En segundo lugar, se probó un número limitado de fluoróforos reporteros y pares de reporteros. Las pruebas adicionales de todos los reporteros disponibles en todas las combinaciones posibles determinarán qué reactivos se pueden usar con éxito en este método. El anticuerpo anti-IgG conjugado a la biotina fue diferente del anticuerpo anti-IgG conjugado al reportero BV 421. Por lo tanto, aunque existía variabilidad en la intensidad de la señal para el BV 421 anti-IgG, podría deberse a la especificidad del anticuerpo y no estar relacionada con el tinte reportero. La prueba de otros anticuerpos conjugados con BV 421 disponibles puede identificar otro anticuerpo que funcionaría bien en el canal RP2. Los estudios futuros también evaluarán la combinación de PE anti-IgM con BV 421 anti-IgG humana para la detección en RP1 y RP2, respectivamente. Por último, incluso con la capacidad de doble reportero del instrumento, los ensayos se limitan a dos isotipos (dos parámetros) por reacción. Si se van a medir isotipos adicionales o se desea una isotipificación completa, entonces las reacciones adicionales utilizando los mismos dos canales de reportero tendrían que ejecutarse en pozos separados.
La tecnología de multiplexación basada en perlas permite un diseño de ensayo rápido y flexible con una fácil implementación en los flujos de trabajo rutinarios del laboratorio3,4,10. Este estudio demostró la facilidad de transferir los ensayos serológicos y de neutralización 3Flex descritos anteriormente para el SARS-CoV-2 a un sistema de análisis de flujo para medir IgG con un solo reportero, o con una ligera modificación, midiendo simultáneamente las respuestas igG e IgM utilizando dos reporteros. La opción de doble reportero tiene claras ventajas sobre las plataformas de un solo reportero porque puede proporcionar el doble de datos por muestra, utilizando la mitad del volumen de la muestra y en la mitad el número de pozos de reacción. Con los colorantes reporteros y anticuerpos de detección apropiados, los ensayos de isotipado se pueden desarrollar y realizar fácilmente en el instrumento de análisis de flujo de doble reportero.

La pandemia de COVID-19 ha enfatizado la importancia de poder desarrollar e implementar rápidamente pruebas serológicas rápidas, de alto rendimiento y alto rendimiento que puedan usarse para el diagnóstico y la vigilancia de nuevos patógenos como el SARS-CoV-2. Las pruebas serológicas multiplex pueden ser extremadamente útiles en una pandemia, ya que pueden analizar simultáneamente anticuerpos contra múltiples antígenos, lo que proporciona una amplia cobertura de patógenos y controla la variabilidad en el organismo y la respuesta del huésped a la infección. Recientemente se informó del desarrollo de un ensayo multiplex basado en perlas fluorescentes, el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), que puede detectar anticuerpos contra la proteína espiga (S), el dominio de unión al receptor (RBD) de la enzima convertidora de angiotensina-2 (ACE2) y la nucleocápside (Nc) del SARS-CoV-21. Se demostró que 3Flex tenía un rendimiento comparable al de un ensayo de referencia de SARS-CoV-2 IgG para suero obtenido a los ≥21 días desde el inicio de los síntomas, pero tuvo una mayor sensibilidad con muestras recolectadas a los ≤5 días desde el inicio de los síntomas. Además, se demostró la inhibición de la unión a anticuerpos para los antígenos S y RBD utilizando ACE2 soluble en un formato de ensayo de neutralización. La tecnología basada en cuentas multiplex ha sido ampliamente adoptada como una tecnología probada para las pruebas serológicas multiplex y tiene claras ventajas para la detección a gran escala, incluido el corto tiempo hasta los resultados, los requisitos de muestras pequeñas y la reducción de la mano de obra2,3,4.
Recientemente, se ha puesto a disposición un nuevo instrumento de análisis de flujo que proporciona la misma capacidad de alto rendimiento y alto rendimiento del sistema demostrado en el trabajo anterior1,pero con el beneficio adicional de dos canales de reporteros. La capacidad de medir dos señales de reportero fluorescente en una sola reacción permite la evaluación de dos resultados por analito para cada muestra y es ideal para aplicaciones de isotipado, que normalmente deben realizarse en pozos de reacción separados5. La capacidad de doble reportero proporciona el doble de datos para cada muestra en la mitad de pozos de reacción con la mitad de los requisitos de volumen de muestra, y por lo tanto tiene una clara ventaja sobre los sistemas de un solo reportero. Este estudio detalla el protocolo estándar de ensayo serológico y describe la adaptación a un ensayo de neutralización. Además, este informe describe la conversión del ensayo de reportero único en un ensayo serológico de reportero dual y, posteriormente, un ensayo de neutralización de reportero dual, para medir simultáneamente anticuerpos neutralizantes de isotipos IgG e IgM contra los antígenos SARS-CoV-2 S, RBD y Nc. En la Figura 1se proporciona una visión general visual del protocolo de ensayo.

<table><tbody><tr><td>ACE2 (humano) (rec.)</td><td>AdipoGen Life Sciences</td><td>AG-40B-0192-3050</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-SP (espaciador largo) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fc&gamma; fragmento específico</td> Jackson <td>ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-065-098</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>MilliporeSigma</td><td>A7888</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Branson 1800 Limpiador/sonicador de baño de agua</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Violeta brillante 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 pocillos Poliestireno negro de fondo plano Microplaca NBS</td><td>Corning</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>Corning Microplaca de 96 pocillos Cinta de sellado de aluminio, no estéril</td><td>Corning</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5&mu; &nbsp; fragmento específico</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-475-043</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Cabra Anti-Humana IgM Fc5&mu; específico</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-506-129</td><td>Descontinuado pero disponible de múltiples proveedores</td></tr><tr><td>eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de microplacas de incubación</td><td>Fisherbrand ThermoFisher Scientific</td><td>02-217-757</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) contra cabras</td> de cabra, PE <td>ThermoFisher Scientific</td><td>P-2771MP</td><td></td></tr><tr><td>Separador de placas magnéticas Luminex</td><td>Corporation</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>Perlas MagPlex</td><td>Luminex Corporation</td><td>MC100XX-ID</td><td></td></tr><tr><td>PE AffiniPure F(ab')2 Cabra Anti-Humano IgM Fc5&mu; </td><td>específico Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-116-129</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3813</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Anticuerpo proteico de nucleocápside del SARS</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56683</td><td>Sin conjugar, conejo, policlonal, proteína G Proteína G purificada</td></tr><tr><td>Proteína del SARS Nucleocápside Anticuerpo</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56049</td><td>Sin conjugar, conejo, policlonal, proteína A purificada</td></tr><tr><td>contra la proteína de la espícula del SARS</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56047</td><td>Sin conjugar, conejo, policlonal, proteína G purificada</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra la proteína de la espícula del SARS</td><td>Novos Biologicals</td><td>NB100-56048</td><td>Sin conjugar, conejo, policlonal, purificada con proteína G</td></tr><tr><td>Anticuerpo de la espícula S1 del SARS-CoV-2 (2019-nCoV), conejo MAb</td><td>SinoBiological</td><td>40150-R007</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2002</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Estreptavidina, R-ficoeritrina conjugada (SAPE)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S21388</td><td></td></tr><tr><td>revólver/rotador de tubo</td> de grado premium <td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9416</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>xMAP Kit</td> <td>de acoplamiento de anticuerposLuminex Corporation</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX DR-SE</td><td>Luminex Corporation</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de neutralización igg e igm sars-cov-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

La pandemia de COVID-19 ha puesto de relieve la necesidad de métodos rápidos de alto rendimiento para la detección serológica sensible y específica de la infección por nuevos patógenos, como el SARS-CoV-2. Las pruebas serológicas multiplex pueden ser particularmente útiles porque pueden analizar simultáneamente anticuerpos contra múltiples antígenos que optimizan la cobertura de patógenos y controlan la variabilidad en el organismo y la respuesta individual del huésped. Aquí describimos un ensayo basado en microesferas fluorescentes IGG 3-plex del SARS-CoV-2 que puede detectar anticuerpos IgM e IgG contra tres antígenos principales del SARS-CoV-2: la proteína espiga (S), la enzima convertidora de angiotensina espiga-2 (ACE2) dominio de unión al receptor (RBD) y la nucleocápside (Nc). Se demostró que el ensayo tenía un rendimiento comparable a un ensayo de referencia del SARS-CoV-2 para IgG en suero obtenido a los ≥21 días desde el inicio de los síntomas, pero tuvo una mayor sensibilidad con muestras recolectadas a los ≤5 días desde el inicio de los síntomas. Además, utilizando ACE2 soluble en un formato de ensayo de neutralización, se demostró la inhibición de la unión a anticuerpos para S y RBD.

Optimización del Ensayo Serológico de Reportero Único. La estrategia de acoplamiento para todos los antígenos del SARS-CoV-2 se describe en Cameron, et al., 20201 y en el paso 2.1 anterior. La estrategia para la confirmación de acoplamiento se describe en el paso 2.3 anterior. Para un acoplamiento eficiente, los valores medios de intensidad de fluorescencia (IMF) deben ser significativamente más altos que las reacciones de control negativas sin suero/sin anticuerpos y deben demostrar una respuesta a la dosis de disminución de la señal de IMF con cantidades decrecientes de reactivo de detección. Las IMF de aproximadamente 1.000 unidades de IMF o más sobre la IMF de fondo generalmente indican un acoplamiento eficiente de proteínas y dependen de la concentración y especificidad del reactivo de detección utilizado. Usando este método, la confirmación del acoplamiento de antígenos S, RBD y Nc se probó para dos lotes de perlas(Figura 2). Las señales de IMF para todos los antígenos fueron significativamente más altas que la IMF de fondo y mostraron una respuesta a la dosis con titulación de los reactivos de detección. Los datos también mostraron una buena reproducibilidad de los niveles de IMF entre los dos lotes diferentes de cuentas acopladas.
La optimización del ensayo de un solo reportero se realizó como se describe en Cameron, et al., 20201. Cada antígeno se probó a diferentes concentraciones de acoplamiento con diferentes diluciones de varias muestras de suero que representan muestras altas, medias, bajas y negativas. Además, debido a que el ensayo mide los títulos de IgG, se utilizó un suero despojado de IgG como muestra negativa adicional. Los resultados de una serie de dilución de muestra representativa con diferentes niveles de acoplamiento de antígenos se muestran en la Figura 3. Esta serie de dilución inicial se probó con una concentración fija de reactivos de detección para obtener un rango potencial de niveles representativos de MFI específicos del antígeno y de fondo. A partir de estos datos, se determinaron rangos de dilución de muestras adicionales y niveles de acoplamiento de antígenos y se probaron más a fondo con muestras adicionales (datos no mostrados).
A continuación, se optimizó la concentración del reactivo de detección para su uso con las diferentes diluciones séricas y niveles de acoplamiento de antígenos. Los datos representativos utilizando 6 muestras positivas y 2 negativas se muestran en la Figura 4. Tras realizar pruebas adicionales con varios cientos de muestras de suero pre-COVID-19 negativas, se seleccionaron los niveles óptimos finales de acoplamiento de antígenos y las concentraciones de detección regente para el protocolo de ensayo final, tal como se describe en la sección 5.
Conversión a un único ensayo de neutralización de reportero La conversión del ensayo serológico de un solo reportero a un ensayo de neutralización se logró agregando un paso de incubación utilizando ACE2 (como reactivo competidor) con las perlas antes de agregar la muestra de suero. Al valorar la cantidad de ACE2 añadida, se observó inhibición de la unión de IgG a los antígenos S y RBD, como se muestra en la Figura 5. Mientras que los 11 sueros de pacientes tenían diferentes títulos de IgG, cada uno mostró una disminución significativa en la señal de IMF con el aumento de la concentración de ACE2. Como era de esperar, ACE2 solo afecta las señales MFI de S y RBD, pero no el antígeno Nc.
El porcentaje de señal MFI residual en relación con 0 μg/mL ACE2 para todas las muestras se muestra en la Figura 6. Para la mayoría de las muestras, se observó una pérdida de señal &gt;30% para S y RBD con aumento de la concentración de ACE2. Como era de esperar, no hubo ningún efecto de ACE2 en la señal Nc.
Conversión a un ensayo serológico dual de IgG e IgM Para el ensayo de igG e IgM de doble reportero, se utilizaron las condiciones estándar de ensayo de un solo reportero para probar diferentes combinaciones de anticuerpos y reporteros para los dos canales de reporteros. El canal RP1 es similar a los instrumentos de análisis de flujo anteriores con detección de fluorescencia "naranja" para colorantes reporteros como el PE. El segundo canal, RP2, emplea un láser de excitación violeta que se puede utilizar para detectar la fluorescencia "azul" de colorantes excitados a 402 nm con picos de espectros de emisión en el rango de 421-441 nm.
Se probaron varias combinaciones diferentes de anticuerpos igG e IgM antihumanos a varias concentraciones con las condiciones estándar de dilución e incubación de la muestra de 2.000 veces detalladas en la sección 6. Se realizó una prueba inicial de anti-IgM conjugado con el colorante reportero DyLight 405 (DL 405; excitación a 400 nm y emisión a 420 nm) para el canal RP2 utilizando un conjunto de 11 muestras POSITIVAS para PCR con DFSO que oscilaron entre 5 y &gt;60 días, y una muestra de suero sin IgG. Este reactivo de detección no produjo una señal alta en el canal RP2 como se muestra en la Figura 7A,B, C. Para muestras con la alta IgM RP2 MFI, las señales más altas se observaron para RBD y Nc(Figura 7B,C). Si bien los títulos de IgM deben elevarse en este momento en algunas muestras, los niveles observados de IMF no superaron las 140 unidades de IMF con el reactivo de detección de IgM. Además, la cuenta de control para IgM carecía de un rango dinámico significativo para MFI cuando se usaba DL 405 conjugado a anti-IgM en comparación con un reportero anti-IgM RP1 etiquetado con PE utilizado en las mismas concentraciones (Figura 7D).
Debido a que no se disponía de un reactivo de detección adecuado para IgM etiquetado como reportero RP2, se probó el uso de la biotina original anti-IgG con SASB en el canal RP2. La señal para IgG en el canal RP2 con SASB no tenía el mismo rango dinámico que con SAPE, pero aún tenía un rango adecuado para medir títulos de IgG para S, RBD y Nc(Figura 8). Estos datos llevaron a probar diferentes combinaciones de reactivos de detección de IgM RP1 IgM y RP2 IgG, como se describe a continuación.
Conversión a ensayo de neutralización de doble reportero El ensayo serológico de doble reportero se convirtió en un ensayo de neutralización agregando una etapa de incubación con ACE2 y perlas, antes de agregar la muestra de suero. Se utilizó una serie de dilución de 2 veces de ACE2 a partir de 16 μg / ml, y luego se probó con conjuntos de 11 muestras y sueros despojados como se describió anteriormente. Además, se probaron 3 combinaciones diferentes de mezclas de anticuerpos de detección de IgM RP1 y RP2 IgG en un conjunto de 11 muestras y controles de suero despojados. Las combinaciones finales y las concentraciones de reactivos determinadas como óptimas se detallan en la Tabla 1.
Para la detección de IgG, la biotina anti-humana IgG / SASB utilizada en el ensayo original de un solo reportero se probó junto con otra anti-IgG conjugada con el tinte reportero de BV. Mientras que el conjugado BV tenía altas señales MFI RP2, la intensidad de la señal MFI para el título de IgG varió a través de las valoraciones ACE2(Figura 9A,C, E). La combinación de IgG/SASB antihumana de biotina tuvo una disminución de la señal de IMF más consistente en toda la titulación de ACE2 en comparación con el conjugado de VB, lo que demuestra una respuesta a la dosis, aunque los niveles de IMF fueron más bajos. La fluctuación de la señal por el conjugado BV a través de las concentraciones de ACE2 también interfirió con la determinación del porcentaje de inhibición por ACE2 en todo el rango de títulos de IgG en comparación con la combinación de IgG / SASB antihumana de biotina(Figura 9B,D, F). Las muestras con señales MFI bajas, como la muestra DFSO 3, no tienen títulos lo suficientemente altos como para evaluar el rendimiento de estos reactivos o medir la capacidad de neutralización de IgG.
Para determinar los títulos de IgM en el canal RP1, se comparó un anti-IgM conjugado con PE con un IgM antihumano conjugado con el colorante reportero DyLight 549 (DL 549; excitación a 562 nm y emisión a 576 nm) a las concentraciones enumeradas en la Tabla 1. De estos dos reactivos, el PE anti-IgM mostró IMF más altas que las generadas por DL 549 igM anti-humana para las muestras analizadas (Figura 9A,C, E). La cuenta de control de IgM que mide la adición de estos reactivos tuvo diferentes IMF promedio de ≈17,000 para el PE anti-IgM y 2,723 para el conjugado DL 549. Incluso con estas diferencias, el impacto de las diversas concentraciones de ACE2 en la IMF fue medible con el conjugado DL 549. Para determinar la inhibición del porcentaje ACE2 de la unión a IgM, hubo una diferencia leve pero insignificante entre los dos reactivos de detección de IgM(Figura 9B,D, F).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Combinación</td>
			<td rowspan="2">Reportero</td>
			<td colspan="2">Concentración final en pozo (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP1</td>
			<td>RP2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>PE anti-IgM</td>
			<td>2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotina-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2</td>
			<td>DyLight 549 IgM antihumano</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Violeta brillante 421 IgG antihumana</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>DyLight 549 IgM antihumano</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotina-Ig</td>
			<td>-</td>
			<td>0.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>SASB</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Lista de combinaciones de colorantes reportero RP1 y RP2 probadas. Se evaluaron varios colorantes reporteros RP1 y RP2 diferentes para medir los títulos de IgG e IgM. Las tres combinaciones mostradas anteriormente se probaron en diferentes modos de detección RP1 y para la optimización del ensayo de neutralización. Para las combinaciones de RP2 que utilizan SASB, se muestran las concentraciones para el anticuerpo de detección biotinilado y SASB. *La concentración final representa la concentración final en el pozo de reacción.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig01.jpg"> Figura 1:Diagrama de flujo que destaca los pasos principales del protocolo de ensayo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig02.jpg"> Figura 2: Confirmación del acoplamiento de antígenos. Los antígenos se acoplaron a 100, 10 y 1 pmol/106 perlas. Para los antígenos S y RBD, se utilizaron sueros anti-S de conejo y se detectaron con PE anti-conejo IgG. Para Nc, se utilizó un anti-Nc policlogonal de conejo purificado con Proteína G. Se muestran las curvas de valoración para cuentas acopladas con 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) y 100 pmol Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig03.jpg"> Figura 3: Optimización de la dilución sérica con diferentes niveles de acoplamiento de antígenos. Las muestras de suero que representan muestras altas, medias, bajas y negativas se analizaron con los diferentes acoplamientos de antígeno pmol /10 6 perlas. Se probó una titulación sérica de 4 veces con una mezcla multiplex de perlas acopladas a antígenos utilizando el protocolo de ensayo descrito en la sección 5. Se muestran los valores MFI de las curvas de valoración para S (A), RBD (B) y Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig04.jpg"> Figura 4: Determinación de la dilución sérica óptima y concentración de reactivos de detección. Ocho muestras de suero, incluidos pacientes negativos (2 muestras) y de bajo a alto positivo (6 muestras), se analizaron en diluciones séricas adicionales con tres concentraciones diferentes de reactivos de detección. Los resultados de MFI se muestran para S (A), RBD (B) y Nc (C). Sobre la base de estos y otros datos (no mostrados), se seleccionó una dilución de la muestra de 1:2.000 y una concentración de anticuerpos de detección de biotina de 0,62 μg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig05.jpg"> Figura 5: Optimización del ensayo de neutralización de un solo reportero. La modificación del ensayo serológico de un solo reportero a un ensayo de detección de anticuerpos neutralizantes se realizó agregando una etapa de incubación con ACE2 como competidor, como se describe en la Sección 6. Se analizaron un conjunto de 11 muestras, que van desde sueros de título de bajo a alto positivo, y una muestra de suero rayado con IgG con una serie de dilución doble de ACE2 a partir de 4 μg / ml, utilizando condiciones de ensayo estándar. A través de este rango de concentraciones de ACE2, se puede ver una disminución en MFI con un aumento de ACE2 para S (A) y RBD (B), pero no para Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig06.jpg"> Figura 6: Porcentaje de inhibición de la señal con ACE2. Se muestra el porcentaje de señales residuales para el conjunto de 11 muestras (de la Figura 4). Para cada muestra, independientemente de su título de IgG, se logró una disminución máxima de la señal MFI del ≥30% para S (A) y RBD (B) a la concentración más alta de ACE2. Para el antígeno Nc(C)no hubo inhibición significativa de la señal con ninguna cantidad de ACE2 probada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig07.jpg"> Figura 7: Prueba de DyLight 405 anti-IgM como reactivo de detección de IgM RP2. Se utilizó un conjunto de 11 muestras y sueros despojados de IgG para probar DL 405-conjugado anti-IgM como un reactivo de detección RP2. Se muestran las señales RP2 IgM MFI para S (A), RBD (B) y Nc (C). La señal MFI más alta para cualquier antígeno con cualquier muestra fue de aproximadamente 140 unidades MFI para RBD con muestra H (B). Incluso la señal en el conjunto de perlas de control de IgM fue inferior a 1.000 MFI en el canal RP2 en todo el rango de título de anticuerpos y no mostró el aumento del rango dinámico observado con el anticuerpo de detección PE anti-IgM en el canal RP1 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig08.jpg"> Figura 8: Optimización de SASB como reportero RP2 con Biotina anti-IgG. Se utilizó un conjunto de 11 muestras y sueros despojados de IgG para probar una serie de dilución de SASB con el anti-IgG de biotina estándar de 0,62 μg/mL. Se muestran las IMF IgG resultantes en el canal RP2 para S (A), RBD (B) y Nc (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62487/62487fig09.jpg"> Figura 9: Comparación de tres combinaciones diferentes de mezclas de detección de IgM RP1 y RP1 IgG. Se probaron tres mezclas diferentes de anticuerpos de detección en 11 muestras y sueros eliminados de IgG. Las combinaciones y concentraciones finales utilizadas se describen en la Tabla 1. Todas las muestras se analizaron con una dilución ace2 de 2 veces, a partir de 16 μg/ml. Se muestran los datos para muestras en DFSO de 3, 12 y 30 días. Las señales MFI para RP1 IgM (naranja) y RP2 IgG (azul) se muestran en A (DFSO 3), C (DFSO 12) y E (DFSO 30). Las IMF residuales del porcentaje de ACE2 se muestran en B (DFSO 3), D (DFSO 12) y F (DFSO 30). Las señales que representan una disminución del &gt;30% en comparación con los controles No ACE2 se resaltan en verde claro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62487/62487fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se utilizó un sistema de análisis de flujo para ensayos multiplexados basados en perlas que proporciona una lectura de dos reporteros para el desarrollo de ensayos serológicos multiplex y de neutralización de anticuerpos que pueden medir simultáneamente anticuerpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de un protocolo de multiplexación basado en cuentas que utiliza dos señales de reportero para medir simultáneamente dos resultados por analito. Esta técnica permite al usuario medir IgM e IgG específicas del antígeno al mismo tiempo, con menos muestra y un tiempo más corto para obtener resultados. Si bien este método de doble reportero es específico para la isotipificación de anticuerpos, podría adaptarse para medir otros pares de analitos, como modificaciones post-tradesales o formas de fármacos libres versus unidos.Demostrando nuestro procedimiento hoy tenemos al Dr. Steve Angeloni, científico senior de aplicaciones de campo para Luminex Corporation. Para comenzar el ensayo serológico dual reportero IgG e IgM, prepare las mezclas de cuentas multiplex requeridas de la cuenta de pareja individual y controle las existencias de cuentas a una concentración de una vez 10 a las seis cuentas por mililitro. A continuación, diluya las muestras de suero 100 veces agregando 10 microlitros de suero a 990 microlitros de tampón PBS-TBN, luego diluya las muestras otra diez veces agregando 20 microlitros de la dilución 1: 100 a 180 microlitros de PBS-TBN.Cuando las mezclas de cuentas y las muestras de suero estén listas, agregue 50 microlitros de las mezclas de cuentas multiplex a los pozos asignados de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pozos, luego agregue 50 microlitros de las muestras de suero diluido a los pozos apropiados. Una vez que se hayan agregado todas las muestras, cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, separe las perlas de la mezcla de reacción colocando la placa en un separador de placa magnética durante dos minutos.Manteniendo la placa en el imán, retire el sello de la lámina. Luego invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos. Mientras mantiene la placa en el imán, seque la placa en papel absorbente.Para lavar los pozos de reacción, retire la placa del imán de la placa y agregue 150 microlitros de PBS-TBN a cada pozo. Cubra la placa con un sello de lámina fresca e incube en el agitador calentado durante dos minutos antes de volver a colocarlo en el imán de la placa durante otros dos minutos. Mientras mantiene la placa en el imán, invierta la placa para desechar el sobrenadante y seque la placa en papel absorbente.Después del segundo lavado de PBS-TBN, retire la placa del imán y agregue 100 microlitros de mezcla fresca de reactivos de detección a cada pozo. Después de cubrir la placa con un sello de lámina de microplaca, colóquela en un agitador de placas calentado durante 15 minutos y luego en un separador de placa magnética durante dos minutos. Mientras la placa está en el imán, deseche la mezcla de reactivos de detección invirtiendo la placa sobre un contenedor de residuos y secándola en papel absorbente.Lave los pozos de reacción con PBS-TBN dos veces como se demostró anteriormente, luego retire la placa del imán. Agregue 100 microlitros de PBS-TBN a cada pozo, luego cubra la placa con sello de lámina y agite durante dos minutos a 37 grados centígrados. Retire el sello de la lámina y proceda a leer 50 microlitros de la muestra de cada pozo en el analizador de flujo.Para leer la placa, seleccione el menú desplegable en la esquina superior izquierda, navegue hasta Configuración de placa, cargue la placa configurada previamente y seleccione Ejecutar placa. Expulse el soporte de la placa seleccionando el icono Expulsar, luego cargue la placa en el soporte de la placa y seleccione el icono De retracción para retraer el soporte de la placa. Una vez que el portador de la placa se haya prolongado en el analizador, seleccione el icono Ejecutar para comenzar a leer la placa.Para el ensayo de neutralización de doble reportero, agregue 50 microlitros de las mezclas de cuentas multiplex a los pomos asignados de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pomos, luego agregue 25 microlitros de dos microgramos por mililitro ACE2 a cada pozo y cubra la placa con un sello de lámina. Después de una incubación de dos minutos en un agitador de placas calentado, agregue 25 microlitros de diluciones de suero 1:500 a los pomos asignados. Una vez que se hayan agregado todas las muestras, realice los pasos de incubación, lavado, detección y análisis como se demostró previamente para el ensayo serológico.Una prueba de anti-IgM conjugada con el tinte reportero DyLight 405 utilizando muestras de suero dentro de los cinco a 60 días posteriores al inicio de los síntomas y una muestra de suero de tira de IgG no produjo una señal alta para el antígeno de pico. Para muestras con una alta intensidad de fluorescencia media de IgM, las señales más altas se observaron para el dominio de unión al receptor y los antígenos de la nucleocápside. Si bien el título de IgM debería haber sido elevado en algunas muestras, los niveles de intensidad de fluorescencia media observados no excedieron las 140 unidades de IMF.Además, el perla de control para IgM carecía de un rango dinámico significativo para la intensidad media de fluorescencia cuando se usaba DyLight 405 conjugado a anti-IgM en comparación con una ficoeritrina marcada como anti-IgM a la misma concentración. Para la detección de IgG, el conjugado violeta brillante tenía señales de intensidad de fluorescencia medianas más altas que el conjugado de estreptavidina del flúor Super Bright 436. Sin embargo, la intensidad de la señal para el conjugado violeta brillante varió a través de las valoraciones de ACE2.Esta fluctuación de la señal por el brillante conjugado violeta a través de las concentraciones de ACE2 también interfirió con la determinación del porcentaje de inhibición por ACE2 en todo el rango de títulos de IgG. Para la detección de IgM, la ficoeritrina anti-IgM mostró señales más altas que las generadas por DyLight 549 anti-IgM humana. Al determinar la inhibición del ECA2 por ciento de la unión a IgM, hubo una diferencia leve pero insignificante entre los dos reactivos de detección de IgM.Por lo tanto, uno de los pasos más importantes en el procedimiento es preparar su mezcla de cuentas multiplex a partir de sus existencias de cuentas individuales y asegurarse de hacerlo correctamente. Por lo tanto, este procedimiento también se puede utilizar para medir la eficacia de las vacunas y monitorear las respuestas inmunes a otros patógenos también.

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Investigación

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Inmunología e Infección

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Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas (Video) | JoVE Journal

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