Name: Análisis constante de resorte molecular mediante espectroscopia de sonda de fuerza de biomembrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a medir constantes de resorte moleculares en células vivas mediante espectroscopía de fuerza dinámica con la sonda de fuerza de biomembrana. Este método proporciona información mecánica sobre interacciones de membrana.

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Agradecemos a Guillaume Troadec por la útil discusión, a Zihao Wang por la consulta de hardware y a Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning y Simon Ringer por el apoyo a nuestra startup de laboratorio. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Descubrimiento del Consejo australiano de Investigación (DP200101970 - L.A.J.), el Programa de Desarrollo de Capacidades Cardiovasculares de NSW (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), el premio Sydney Research Accelerator (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), y The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju es miembro del Consejo Australiano de Investigación DECRA (DE190100609).

1. Obtener eventos DFS analizables
<ol><li>Inicie el experimento en el software (por ejemplo, LabVIEW VI) para el control BFP y la configuración de parámetros(Figura S1A).</li>
	<li>Observe los toques repetitivos de perlas/celdas de la sonda en el software para BFP Monitor(Figura S1B).</li>
	<li>Pruebe y logre la frecuencia de adhesión ≤ 20% dentro de los primeros 50 toques ajustando la fuerza de pinzamiento y el tiempo de contacto, por lo que se asegura que ≥ el 89% del evento de adhesión DFS esté mediado por enlaces simples12,13,14. NOTA: Para cada par Bead-Cell/Bead, realizamos 200 ciclos táctiles repetitivos. Para obtener la calidad de los datos publicables, generalmente realizamos n ≥ 3 pares Bead-Bead o Bead-Cell.<ol>
<li>Guarde los datos, en forma de Fuerza vs. Tiempo, en la carpeta dirigida por el usuario al final de cada par, según lo solicite el software para el control BFP y la configuración de parámetros.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recopile los datos brutos de Fuerza vs. Tiempo de los eventos de Bond, como se ejemplifica en la Figura 2A,utilizando la plataforma de adquisición BFP(Figura S1C).<ol>
<li>Abra el software de análisis de datos BFP. Haga clic en el icono de la carpeta amarilla y seleccione el archivo de datos sin procesar correspondiente haciendo doble clic en ellos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute el programa y, a continuación, haga clic en el botón arriba y abajo para cambiar entre eventos. Utilice los criterios de exclusión de valores atípicos (Figura S2) para descartar eventos no válidos. Seleccione el tipo de datos de exportación como formato Fuerza vs. Tiempo y haga clic en el botón Exportar datos de gráficos.</li>
</ol>2. Convierta la curva fuerza vs. tiempo a la curva Fuerza vs. Desplazamiento
<ol><li>Exporte el segmento de datos correspondiente a la etapa de retracción a una hoja de cálculo(Figura 2A, marquesina cuadrada),que es relevante para el análisis de constantes de resorte.</li>
	<li>Traza la curva de fuerza vs. tiempo usando un software de hoja de cálculo. Para obtener la curva Fuerza vs. Desplazamiento, convierta los valores de tiempo(Figura 2A,eje x)a los valores de desplazamiento total (Δxtot)multiplicando los valores de tiempo con la velocidad de movimiento piezoeléctrico (es decir, 4.000 nm/s por preset).</li>
	<li>Cero el primer punto de datos restando el valor de desplazamiento más pequeño de cada valor de desplazamiento adquirido. Esta transformación horizontal no afecta a las pendientes ascendentes de la etapa de retracción ni al cálculo posterior de la constante de resorte.</li>
	<li>En particular, el BFP se considera como un sistema de resorte en serie en el que Δxtot (Tabla 1) suman las deformaciones del RBC, ΔxRBC (Tabla 1), el enlace molecular, Δxmol (Tabla 1), y la célula objetivo, Δxcelda (Tabla 1), como el Eq. 2: <img alt="Ecuación de equilibrio estático Δxtot = ΔxRBC + Δxmol + Δxcell, fórmula matemática." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> (Eq. 2)</li>
	<li>Grafíe la curva Fuerza (F) vs. Desplazamiento (Δxtot) como se muestra en la Figura 2B.</li>
</ol>3. Análisis de Cnstant de resorte del modo de celda de perla
<ol><li>En la curva Fuerza vs. Desplazamiento, se pueden identificar dos pendientes distintas, donde cada una puede representar la fase de compresión y la fase de tracción. Ajuste una línea de regresión a cada grupo de datos (Figura 2B), donde la pendiente de ajuste lineal más grande representa la constante total del resorte en fase de compresión (Figura 2B, rojo), denotada como k1 (Tabla 1); y la pendiente de ajuste lineal más pequeña representa la constante total del resorte en fase tensilla(Figura 2B, azul),denotada como k2 (Tabla 1).</li>
	<li>Para los resortes conectados en serie por la descripción del paso 2.2, exprese el recíproco de la constante de resorte total, ktot (Tabla 1), como la suma de los inversos constantes de resorte de RBC, kRBC (Tabla 1), el enlace molecular, kmol (Tabla 1), y la celda objetivo, kcelda (Tabla 1). Durante la fase de compresión del modo Bead-Cell, el enlace molecular no se estira, porlo tanto, kmol no se tiene en cuenta. El recíproco del ktot en este escenario (1/k1) se expresa como <img alt="Ecuación que representa la cinética celular en biología; Diagrama de constantes cinéticas: k1, kRBC, kcell." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"> (Eq. 3). En los datos de ejemplo, kRBC está predeterminado (0,25 pN/nm de forma predeterminada). kcelda se puede derivar de la Eq. 3 con el k1 adquirido y kRBC ( Figura3B).</li>
	<li>Durante la fase de tracción, se forma adhesión entre el par ligando-receptor. Expresar el recíproco del ktot en este escenario (1/k2) como <img alt="Ecuación de resistencia en serie, que muestra 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell, utilizada en el estudio cinético." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> (Eq. 4) donde k2 (Tabla 1) representa la constante total de resorte durante la fase de tracción.</li>
	<li>Derive kmol de restar 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 3 vs. Eq. 4).</li>
</ol>4. Análisis constante de resorte del modo de cuentas
<ol><li>Ajuste una línea de regresión a los datos de la fase de compresión para obtener k1 (similar a la Figura 2B, rojo). Cabe destacar que, en el modo Perla-Perla, la célula diana es reemplazada por una cuenta de vidrio recubierta con el receptor de interés(Figura 1C). Dado que la deformación de la perla es insignificante, el términode celda 1 /kse puede eliminar de los Eq. 3 y Eq. 4 en consecuencia. El ktot recíproco de la fase compresiva (1/k1) puede expresarse como: <img alt="Ecuación que muestra la relación: 1/k1 = 1/kRBC; Clave para las constantes de velocidad cinética en el análisis bioquímico." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> (Eq. 5)</li>
	<li>Ajuste una línea de regresión a los datos de la fase de tracción para obtener k2 (similar a la Figura 2B, azul). El ktot recíproco de la fase de tracción (1/k2) puede expresarse como: <img alt="Ecuación de velocidad de reacción, diagrama de constantes de velocidad inversa; k2, kRBC, términos kmol para análisis cinético." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> (Eq. 6)</li>
	<li>Derive kmol de restar 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 5 vs. Eq. 6).</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe%3A+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).</li>
<li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li>
<li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li>
<li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li>
<li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580(1995).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+regulated+conformational+change+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Force regulated conformational change of integrin αVβ3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+force+spectroscopy+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447(2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos que informar con respecto al presente estudio.

En resumen, hemos proporcionado un protocolo detallado de análisis de datos para preprocesar los datos brutos de DFS y derivar constantes de resorte molecular en los modos de análisis BFP Bead-Bead y Bead-Cell. Se presentan los modelos biomecánicos y las ecuaciones necesarias para determinar las constantes de resorte moleculares y celulares. Aunque se estudian diferentes integrinas, el kmol medido por el modo Bead-Bead y el modo Bead-Cell posee diferencias de rango significativas(...

Como una técnica de DFS de células vivas, BFP diseña un glóbulo rojo humano (RBC; Figura 1) en un transductor de fuerza ultrasensible y sintonizable con un rango constante de resorte compatible a 0.1-3 pN/nm1,2,3. Para sondear la interacción ligando-receptor, BFP permite mediciones de DFS a ~1 pN(10 -12 N), ~3 nm(10 -9 m) y ~0.5 ms (10-3 s) en resolución de fuerza, espacial y temporal4,5. Su configuración experimental consiste en dos micropipetas opuestas, a saber, la sonda y el objetivo. La micropipeta de la sonda aspira un glóbulo rojo y una cuenta se pega en su ápice a través de una interacción biotina-estreptavidina. La cuenta está recubierta con el ligando de interés(Figura 1A). La micropipeta objetivo aspira una célula o una cuenta que lleva el receptor de interés, correspondiente a los modos Bead-Cell (Figura 1B) y Bead-Bead (Figura 1C), respectivamente5.
La construcción de BFP, el montaje y los protocolos experimentales DFS se describieron en detalle anteriormente1,6. Brevemente, un ciclo táctil BFP consta de 5 etapas: Aproximación, Incidente, Contacto, Retracción y Disociación(Figura 1D). La posición horizontal del ápice de RBC se denota como ΔxRBC. Al principio, la deformación de RBC no astresada (fuerza cero) ΔxRBC es 0 (Tabla 1). El objetivo es entonces impulsado por un piezotraduclador para inmisionar y retraerse de la cuenta de sonda (Figura 1D). La sonda RBC es comprimida primero por el Target con deformación negativa de RBC ΔxRBC &lt; 0. En un evento de Bond, la etapa de retracción pasa de una fase compresiva a una fase de tracción con deformación positiva deRBC ΔxRBC &gt; 0 ( Figura2C y D). De acuerdo con la ley de Hooke, la fuerza de soporte BFP puede medirse como F = kRBC × ΔxRBC, donde kRBC (Tabla 1)es la constante de resorte RBC del BFP. Tras la ruptura del enlace y la finalización de un ciclo de toque, la cuenta de sonda vuelve a la posición de fuerza cero con ΔxRBC = 0 (Figura 1D).
Para determinar el kRBC,medimos y registramos los radios del orificio interno de la micropipeta de la sonda (Rp), el RBC (R0) y el área de contacto circular (Rc) entre el RBC y la cuenta de la sonda ( Figura1A). Luego se calcula kRBC de acuerdo con el modelo de Evan (Eq. 1)7,8 utilizando un programa LabVIEW que actúa como un instrumento virtual (VI) para operar el BFP(Figura S1A)8,9.
<img alt="Ecuación de equilibrio estático para kRBC en dinámica de fluidos, mostrando variables y términos logarítmicos." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> (Eq. 1)
Con un BFP establecido y datos brutos DFS obtenidos, a continuación presentamos cómo analizar la constante de resorte del par ligando-receptor o células. Los datos brutos de DFS sobre la interacción de la proteína glicosilada Thy-1 y la integrina portadora de células K562 α5β1 (Thy-1-α5β1; Figuras 3A y 3B)10 y la de la integrina recubierta de fibrinógeno y cuentas αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 se han utilizado para demostrar los modos de análisis Bead-Cell y Bead-Bead, respectivamente.
Preparación experimental BFP Para obtener detalles sobre la preparación experimental y la instrumentación de BFP, consulte los protocolos publicados anteriormente3. En resumen, los glóbulos rojos humanos se han biotinilado utilizando la biotina-PEG3500-NHS en el tampón de carbono / bicarbonato. Las proteínas de interés se han acoplado covalentemente a las perlas de vidrio de borosilicato utilizando MAL-PEG3500-NHS en el tampón de fosfato. Para adherirse al RBC biotinilado, la perla de la sonda también está recubierta con estreptavidina (SA) utilizando el MAL-SA. Consulte la Tabla de materiales y la Tabla 2.
Para ensamblar el BFP(Figura 1, izquierda),se utilizará la tercera micropipeta denominada 'Ayudante' para entregar la cuenta de sonda y pegarla al vértice1,3del RBC. La interacción covalente entre la cuenta de sonda recubierta de SA y los glóbulos rojos biotinilados es mucho más fuerte que el enlace ligando-receptor de interés. Por lo tanto, la etapa disociada puede interpretarse como la ruptura del enlace ligando-receptor en lugar del desprendimiento de la cuenta de sonda del RBC.

<table><tbody><tr><td>3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS)</td><td>Uct, Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funcionalización de perlas de vidrio</td></tr><tr><td>Anhy. Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Preparación de tampón de fosfato Adquisición</td></tr> de <tr><td>datos BFP VI</td><td>Control LabVIEW</td><td></td><td>BFP y configuración de parámetros</td></tr><tr><td>Análisis de datos BFP VI</td> Análisis de <td>datos brutos</td>de <td>LabVIEW</td><td></td> BFP</tr><tr><td>Biotinilación</td><td></td><td></td><td></td> de biotin-PEG3500-NHS JenKem A5026-1 RBC</tr><tr><td>Perlas de vidrio de borosilicato</td><td>Tecnología de partículas Distrilab, Países Bajos</td><td>9002</td><td>Funcionalización de perlas de vidrio</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Cámara de funcionalización de ligandos</td></tr><tr><td>VI</td><td>LabVIEW</td><td></td><td>BFP Monitorización</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Tyrode' s preparación de tampón</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode' s Preparación de tampón</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Funcionalización de perlas</td></tr><tr><td>de vidrio Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tyrode' s Preparación tampón</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Preparación tampón de carbonato/bicarbonato; Tirodo' </td></tr><tr><td>Carbonato de sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparación de tampón de carbonato/bicarbonato</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tyrode' s Preparación tampón</td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio Monobásico Monohidrato (NaH2PO4&bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparación de tampón de fosfato</td></tr><tr><td>Estreptavidina-Maleimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funcionalización de perlas de vidrio</td></tr></tbody></table>

análisis constante de resorte molecular mediante espectroscopia de sonda de fuerza de biomembrana

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

Una sonda de fuerza de biomembrana (BFP) ha surgido recientemente como una nanoherramienta de espectroscopia de fuerza dinámica (DFS) de superficie celular nativa o in situ que puede medir la cinética de unión molecular única, evaluar las propiedades mecánicas de las interacciones ligando-receptor, visualizar los cambios conformacionales dinámicos de proteínas y dilucidar de manera más emocionante los mecanismos de menosensión celular mediados por el receptor. Más recientemente, BFP se ha utilizado para medir la constante de resorte de los enlaces moleculares. Este protocolo describe el procedimiento paso a paso para realizar el análisis DFS constante de resorte molecular. Específicamente, se discuten dos modos de operación BFP, a saber, los modos Bead-Cell y Bead-Bead. Este protocolo se centra en derivar constantes de resorte del enlace molecular y la célula a partir de datos brutos de DFS.

En este trabajo, hemos demostrado el protocolo del análisis de constantes de resorte BFP. Para el modo de análisis Bead-Cell, se analizó el kmol del enlace molecular entre la proteína glicosilada Thy-1 recubierta en la cuenta probe y la integrina α5β1 expresada en la célula Target K562 (Thy-1-integrina α5β1; Figura 3A) 10. Lacelda ktambién se deriva del modo Bead-Cell (K562 Cell; <str...

Una sonda de fuerza de biomembrana (BFP) es una técnica de espectroscopia de fuerza dinámica in situ (DFS). BFP se puede utilizar para medir la constante de resorte de las interacciones moleculares en las células vivas. Este protocolo presenta análisis constantes de resorte para enlaces moleculares detectados por BFP.

Análisis constante de resorte molecular mediante espectroscopia de sonda de fuerza de biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

Este video describe los procedimientos paso a paso sobre el uso de la sonda de fuerza de biomembrana, o BFP para medir la constante de resorte molecular. En la sonda de fuerza, BFP ha surgido recientemente en la superficie celular nativa o en el análisis de espectroscopia de fuerza dinámica SITU. El objetivo principal de esta técnica es medir la genética de unión a una sola molécula.Este procedimiento de análisis de datos es un mensaje simple pero poderoso y proporciona información mecánica, específicamente la fuerza dinámica y la inflamación de las moléculas que expresan la membrana celular. Durante el ciclo de experimento BFP, el microbioma de la sonda apuesta con el glóbulo rojo y la sucesión, la célula objetivo y el enlace molecular del receptor de ligando entre la sonda y el objetivo puede considerarse como un sistema cerebral conectado en serie. Basado en la ley de Hooke, el recíproco de la constante de resorte total de un sistema de resorte conectado en serie es igual a la suma de la constante de resorte inverso de cada componente individual, como muestra la ecuación.La constante de resorte de los glóbulos rojos se calcula en función del movimiento de los eventos, que depende de la radial de la micropipeta de la sonda en el orificio. El glóbulo rojo, el área de contacto circular entre el glóbulo rojo y la sucesión y la presión aspiradora de micro-pipeta. Los datos de la carretera BFP se obtienen mediante un instrumento virtual de vista izquierda casero, que controla el movimiento de la micro-pipeta objetivo por un traductor de PA.Un ciclo táctil PFP completo consta de cinco etapas. Approach.Impinge.Contact. Retraerse y disociarse. Al principio, enfatiza que la posición robusto de APICS se denota como X es igual a 0 en negro deshine.El objetivo es entonces impulsado por una pieza o traductor para incider y comprimir el robusto para causar un movimiento de sucesión negativo. Lo notas como X más pequeño que cero en la línea de guión roja. En la etapa de retracción, el vértice busto rojo se mueve de la posición X más pequeña que cero a la posición X igual a cero conocida como la fase de compresión.Si se forma un enlace entre el complejo de moléculas receptoras de ligando, el glóbulo rojo sería aún más diferente a otra dirección positiva. Este período X mayor que cero se conoce como la fase de tracción de la etapa de retracción. La etapa de retracción es la parte más crítica para determinar la constante de resorte de la molécula de enlace.Recopile datos de carretera de fuerza versus tiempo utilizando la plataforma de adquisición de datos BSP. Cada experimento suele grabar de 50 a 200 ciclos táctiles, Abra el software de análisis de datos PFP. Haga clic en el icono de carpeta amarilla y seleccione el archivo de datos de fila correspondiente haciendo doble clic en ellos.Estamos en el programa. Luego haga clic en los botones de flecha arriba y abajo para cambiar entre eventos. Uso de los criterios de exclusión de valores atípicos para descartar eventos no válidos.Seleccione el tipo de datos de exportación que se fuerza al formato de tiempo y elija el intervalo de tiempo de estado adecuado. Haga clic en el botón exportar datos de gráfico. Los datos exportados se guardan como archivo de texto de forma predeterminada.Este archivo de texto contiene dos columnas de datos. Es la primera columna que representa los papás del tiempo y la segunda columna que representa la fuerza correspondiente en cada punto de tiempo. Traza la curva de fuerza versus tiempo usando software de hojas de cálculo para obtener la curva forzada versus desplazamiento.Multiplica el valor de tiempo de cada punto de datos por el movimiento PSO de Willow Steel. Cero el primer punto de datos restando el valor de desplazamiento más pequeño de cada punto de datos. Esta transformación horizontal no afecta al cálculo posterior de la constante de resorte.En la curva de fuerza versus desplazamiento, dos grupos de actores distintos fueron diferentes si se puede identificar la nueva pendiente de fuerza. Cada uno representa la fase compresiva y la fase de estilo 10. Ajuste una línea de regresión a cada grupo de datos.La línea con pendiente más pronunciada representa la constante total del resorte en una fase de compresor denotada como K1. Y la línea que era la parte superior más pequeña representa la línea en esta fase de estilo 10 denotada como K2.As he mencionado, la constante de resorte total es la recíproca del hijo de la constante de resorte de serie de cada componente. Durante la fase de compresión del modo latido a célula, el enlace molecular no se estira, por lo tanto, no se tiene en cuenta la constante de resorte de enlace molecular. La constante de resorte de la celda objetivo se describe como la ecuación que se muestra donde K1 representa la constante de resorte total durante la fase del compresor.En la fase de estilo 10 del modo beat to sell, la constante total de primavera es la constante de primavera del sol de la constante de primavera inversa del enlace molecular de glóbulos rojos. Y la célula objetivo, use la ecuación que se muestra para calcular la constante de resorte de enlace del molécular, que K2 representa la constante de resorte total. Lees la fase de 10 paradas.En el modo latido a latido, dado que la deformación B es insignificante, el término que describe el inverso de la constante de resorte de la célula objetivo se acerca a cero, por lo tanto, la constante de resorte total en la fase del compresor es equivalente a la constante de resorte de glóbulos rojos que se muestra como la siguiente ecuación. En la fase de tracción, la constante de resorte del enlace molecular se puede calcular restando el efecto del glóbulo rojo que se muestra como la siguiente ecuación. Recopile las constantes de resorte del complejo de integración de viento lateral B, beta 3, la celda K562 y el complejo de actitud integradora de febrifugina B Beta tres, calcule la media y la desviación estándar de las constantes de resorte derivadas a una escala de Newton o nanómetros.Ahora debe tener una mejor comprensión de cuáles son los requisitos para la medición y la constante de resorte de los datos VFD. Se deben notar las diferencias entre el modo beat to cell y el modo beat to beat. Diferentes moléculas que presentan servicio tendrán diferentes defensas a la medida de la constante de resorte.En conclusión, este procedimiento paso a paso describe cómo realizar análisis constantes de resorte molecular utilizando BFP. Prevemos que se harán esfuerzos futuros para automatizar e integrar la adquisición de datos BFP y el análisis DFS en un programa de descanso informático. Haciendo que todo el análisis de datos de operación de BFP sea más fácil de usar y alto en todo momento.

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JoVE Journal

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Bioingeniería

En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

En este video, se utilizan sondas de fuerza de biomembrana (BFP) para medir las fuerzas entre receptores y ligandos. Esta técnica puede detectar interacciones mediante el monitoreo de la presión necesaria para romper los enlaces entre el pMHC conjugado en las perlas de la sonda y los TCR en las celdas objetivo.

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Los celulosomas son complejos multienzimáticos diseñados para digerir la celulosa. Se utilizó SMFS basado en AFM para estudiar las propiedades mecánicas y la configuración de plegamiento de los ensamblajes de proteínas asociados al celulosoma. Presentamos un flujo de trabajo completo para la inmovilización de proteínas, la adquisición de datos y el análisis de datos para estudiar las interacciones de los complejos receptor-ligando individuales involucrados en el ensamblaje del celulosoma.

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Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Aquí se presenta un protocolo para medir la fuerza de las interacciones entre una superficie inorgánica bien definido y, o bien péptidos o aminoácidos mediante medidas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula usando un microscopio de fuerza atómica (AFM). La información obtenida de la medición es importante para entender mejor la interfase material peptídico-inorgánico.

Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Muchas proteínas en la célula de sensación e inducen curvatura de la membrana. Se describe un método para nanotubos de membrana de las vesículas de lípidos para el estudio de la interacción de proteínas o cualquier molécula activa de curvatura con membranas curvo in vitro.

Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

La unión covalente de moléculas de sonda a puntas voladizas de la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica esencial para la investigación de sus propiedades físicas. Esto nos permite determinar la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de los polímeros a través de la espectroscopia de fuerza de molécula única basada en AFM con alta reproducibilidad.

Adjunto covalente de moléculas únicas para espectroscopia de fuerza basada en AFM

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Aprende a medir constantes de resorte moleculares en células vivas mediante espectroscopía de fuerza dinámica con la sonda de fuerza de biomembrana. Este método proporciona información mecánica sobre interacciones de membrana.

Análisis constante de resorte molecular mediante espectroscopia de sonda de fuerza de biomembrana

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