Análisis de la restricción SAMHD1 por citometría de flujo en células mieloides humanas U937
13 de junio de 2021
Aquí se describe un método establecido para determinar el grado de restricción del VIH-1 por la proteína inhibidora celular SAMHD1. Las células U937 del linaje mieloide humano se transducen con un vector de expresión SAMHD1 que coexpresa YFP, se diferencian y luego se desafían con VIH-RFP. El nivel de restricción se determina mediante análisis de citometría de flujo.
Con el creciente interés en el papel de los factores celulares en la infección por VIH de los macrófagos, hemos desarrollado un sistema flexible de análisis, particularmente para SAM HG uno, que no se expresa en las células U937. La principal ventaja del sistema es su flexibilidad. Una vez que está configurado, se puede usar para analizar una variedad de proteínas, células o virus objetivo.
Es importante mantener la salud de las células y también sentirse cómodo con la citometría de flujo multicolor. Encienda el citómetro y la computadora 10 minutos antes de comenzar el análisis. Asegúrese de que los residuos estén vacíos y que el tanque de la vaina esté lleno.
Luego inicie sesión y abra el software de análisis. Después de mover el brazo, retire el tubo de agua. Ajuste el caudal a alto y pulse prime.
Espere a que se apague la luz y repita este proceso tres veces más. Vuelva a colocar el tubo de agua y funcione a un caudal alto durante tres minutos. Luego, ajuste el caudal a bajo y presione el modo de espera hasta la adquisición.
Seleccione experimento, nuevo experimento y presione OK para seleccionar experimento en blanco, haga clic derecho en el experimento y agregue una nueva muestra. Presione OK para el panel en blanco. Haga clic derecho para cambiar el nombre con un nombre apropiado y abra la muestra haciendo clic en el signo más para revelar un nuevo tubo.
Haga doble clic en el tubo para ver la configuración del citómetro en el inspector. En el menú de parámetros, elimine los fluorocromos no necesarios, excepto el láser azul 53030 y el láser amarillo 61020. En la hoja de cálculo, cree un diagrama de puntos de área de dispersión directa frente a área de dispersión lateral, histograma YFP, histograma RFP y gráfico de puntos RFP versus YFP haciendo clic en el icono correspondiente y cambiando los ejes haciendo clic en la etiqueta del eje.
Cargue el control no infectado y no transducido y presione ejecutar en la máquina. A continuación, pulse adquirir en el panel de adquisiciones. Ajuste los voltajes de dispersión directa y lateral en el tablero para colocar las celdas en el cuadrante inferior izquierdo.
Puerta alrededor de esta población y etiquétela como P uno. Haga clic derecho en las otras gráficas y seleccione mostrar P uno para eliminar los restos del análisis posterior. Ajuste los voltajes RFP y YFP hacia abajo para que el pico se encuentre a la izquierda del histograma.
Cargue el control de color único para YFP y presione adquirir. Ajuste el voltaje YFP en el tablero para que las celdas más fluorescentes estén dentro del rango del detector. A continuación, repita lo mismo para el control RFP.
Seleccione el experimento. Vaya a la configuración de compensación y seleccione crear controles de compensación y esté bien para alternar a una hoja de trabajo normal y luego seleccione una hoja de trabajo normal sin teñir. Presione sobre la marcha y adquiera para el control sin mancha.
Dibuje una puerta P alrededor de las celdas intactas y registre. Retire el tubo y ponga la máquina en modo de espera. Haga clic derecho en P uno.
Haga clic en aplicar a todos los controles de compensación y cambie a la hoja de trabajo normal de RFP. Presione la ejecución y grabe el control RFP de un solo color y el software bloqueará automáticamente las celdas positivas. Ponga la máquina en modo de espera y repita lo mismo para el control YFP.
Seleccione experimento, vaya a configuración de compensación, seleccione calcular compensación y luego haga clic en el enlace y guarde. Cambie a la hoja de cálculo global y vuelva al tubo de muestra. Adquirir las células transducidas con SAM HD de tipo salvaje infectadas con RFP de VIH, y comprobar que se pueden ver cuatro poblaciones distintas en las esquinas de los cuadrantes alineadas vertical y horizontalmente para YFP y RFP.
Retire el tubo y pulse el modo de espera. Vuelva a cargar la muestra no transducida y no infectada y pulse ejecutar. En el panel de adquisición, establezca la puerta de detención en P uno y los eventos para registrar 30, 000 eventos.
Registro de prensa. Repita lo mismo para otras muestras y controles presionando el siguiente tubo entre cada tubo. Cambie el nombre de las muestras mientras se ejecuta o post-hawk, y exporte los datos como archivos punto FCS.
Abra el software y arrastre todos los archivos FCS al tablero. Seleccione los controles de compensación y arrástrelos a la subcarpeta de compensación. Haga doble clic en el tubo no transducido y no infectado para abrir el archivo y dispersar hacia adelante una gráfica de dispersión versus lateral.
Seleccione la herramienta de polígono y la puerta en la población de celdas intactas, excluyendo los residuos en la esquina inferior izquierda y asígnele el nombre de celdas. Mueva la etiqueta para que no oscurezca las celdas. Arrastre esta puerta a toda la población de tubos en la barra de todas las muestras.
Desplácese por toda la población utilizando los botones de flecha horizontal para garantizar la activación adecuada para cada tubo. Haga doble clic en las celdas y ajuste los ejes a la altura frente al área. Seleccione la población grande única utilizando una puerta rectangular para excluir dobletes y permitir que el software sugiera nombrarla como celdas individuales automáticamente.
Luego, arrastre esta puerta a todas las poblaciones de celdas y verifique que la puerta cerrada sea apropiada para todas las muestras. Seleccione la población de células individuales para la muestra no infectada y no transducida. Cambie el eje Y a láser azul compensado para YFP y el eje X a láser amarillo compensado para RFP.
Seleccione la herramienta de activación por cuadrante y haga clic en el extremo superior derecho de la población de celdas negativas. Aplique esta activación preliminar a todas las poblaciones de células individuales arrastrando a la puerta principal en la barra de todas las muestras. Si las puertas del cuadrante no separan la población satisfactoriamente, compuerta los cuadrantes individuales utilizando la herramienta polígono.
Desplácese hasta el tipo salvaje SAM HD una sola muestra para verificar la activación correcta entre las células YFP negativas y YFP positivas no transducidas. Utilice la vista de contorno para discriminar las celdas negativas de las células YFP atenuadas. Use la mejor división entre YFP negativo y positivo que sea válida para todas las muestras y desplácese por las muestras para verificar la activación con respecto a la positividad de YFP.
Desplácese hasta la muestra infectada con RFP de VIH no transducida y verifique si la activación entre la RFP negativa no infectada y la RFP positiva infectada es correcta. Utilice la vista de contorno si es necesario y desplácese por las muestras restantes para comprobar que la puerta de acceso es válida para todas las muestras. Cada muestra requiere cuatro cuadrantes.
Q1 YFP positivo, Q2 doble positivo, Q3 RFP positivo y Q4 doble negativo. Abra el editor de tablas y arrastre las cuatro puertas del cuadrante al tablero. Seleccione para archivar y sobresalir en el menú desplegable.
Elija el destino de su archivo y haga clic en crear tabla. Guarde la hoja de cálculo generada de acuerdo con las convenciones de nomenclatura de archivos locales. Haga clic en el icono del editor de diseño para exportar las representaciones de parcelas y estrategias de acceso.
Seleccione cada población y arrástrela al editor con los ejes, el etiquetado y el espaciado necesarios. Para crear un diseño con los mismos gráficos que se muestran para todas las muestras en la sección de lotes, introduzca uno en la columna y pulse crear informe de lotes. En el menú de archivo, seleccione la escala a ancho y evite saltos de página.
A continuación, guarde en el formato de archivo requerido. En la hoja de cálculo exportada, genere las columnas como se describe en el texto manuscrito. Utilice el software de análisis de datos adecuado para promediar los datos replicados para cada construcción SAM HD y calcular los valores de la relación de restricción.
Se generaron gráficos representativos de YFP versus RFP para datos óptimos y subóptimos. La gráfica de datos subóptimos indica que la infección por VIH era demasiado baja y creaba dificultades con la compensación y la recuperación. La relación de restricción fue de 0,5, que es más alta que la relación esperada de 0,3.
Los gráficos de relación de restricción para las variantes de SAM HD uno con respecto al tipo salvaje y control negativo se generaron para los datos óptimos y subóptimos. En los datos óptimos, el tipo salvaje mostró la restricción esperada de aproximadamente 0,2 y el control negativo HD 206 a siete AA tuvo la relación de restricción de 1,0. La variante R372D era significativamente diferente del tipo salvaje, pero no significativamente diferente del control negativo y perdió la capacidad de restringir.
En los datos subóptimos, el control negativo se comportó como se esperaba, pero el tipo salvaje mostró una relación de restricción de 0,5 debido a la baja tasa de infección. El R143D mostró un fenotipo intermedio estadísticamente diferente del tipo salvaje y el control negativo. La variante G209S era significativamente diferente del tipo salvaje, pero no significativamente diferente del control negativo y, por lo tanto, ha perdido la capacidad de restringir.
Es importante tener muchas de sus células de control, especialmente si es nuevo en la citometría de flujo. Después de esto o en paralelo, se puede llevar a cabo un análisis bioquímico de los mismos mutantes para formar una imagen holística.
Descripción general
Este artículo describe un ensayo flexible de citometría de flujo de dos colores para analizar la actividad restrictiva de SAMHD1 frente al VIH-1 en células U937. El método permite la evaluación cuantitativa de la restricción viral mediada por SAMHD1 y la caracterización de variantes de SAMHD1, proporcionando una plataforma robusta para estudiar las interacciones huésped-virus en células mieloides.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Biología Celular
- Inmunología
Antecedentes
- SAMHD1 es una proteína celular que restringe la replicación del VIH-1 en células mieloides en reposo.
- Las células U937 se utilizan comúnmente debido a su baja expresión endógena de SAMHD1.
- La citometría de flujo permite la cuantificación precisa de las poblaciones de células infectadas y transducidas.
- Comprender la función de SAMHD1 y sus variantes es importante para elucidar los mecanismos de restricción viral.
Objetivo del estudio
- Desarrollar y utilizar un ensayo de citometría de flujo de dos colores para medir la restricción del VIH-1 mediada por SAMHD1 en células U937.
- Evaluar el impacto de las mutaciones en SAMHD1 sobre la actividad restrictiva.
- Proporcionar un sistema flexible para analizar diversas proteínas, tipos celulares y virus.
Métodos Utilizados
- Transducción de células U937 con partículas similares a virus de la leucemia murina que expresan SAMHD1 y YFP.
- Diferenciación de células mediante acetato de forbol miristato para inducir un fenotipo quiescente.
- Infección con partículas similares al virus VIH-1 que expresan RFP como marcador.
- Análisis por citometría de flujo para distinguir y cuantificar poblaciones positivas para YFP y RFP.
- Análisis de datos para calcular las relaciones de restricción y comparar construcciones de SAMHD1 de tipo silvestre y mutante.
Resultados principales
- La expresión de SAMHD1 en células U937 provoca una reducción de cinco veces en la infección por VIH (relación de restricción ~0.2).
- Los constructos mutantes de SAMHD1 (por ejemplo, HD206-7AA) pierden la actividad de restricción (relación de restricción ~1.0).
- Las variantes como R372D y G209S también pierden la restricción, mientras que R143D muestra un fenotipo intermedio.
- El rendimiento del ensayo depende de tasas óptimas de infección y de una compensación y selección adecuadas en citometría de flujo.
Conclusiones
- El ensayo de citometría de flujo de dos colores es eficaz para cuantificar la restricción del VIH-1 mediada por SAMHD1.
- El sistema es adaptable para analizar diferentes variantes de SAMHD1 y condiciones experimentales.
- Los controles adecuados y las estrategias de selección de poblaciones celulares son fundamentales para obtener resultados confiables.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis cuantitativo de la restricción del VIH-1 mediada por SAMHD1 en células U937 proporciona una plataforma robusta para investigar las interacciones huésped-patógeno y la validación funcional de dianas en el descubrimiento de antivirales. El ensayo de citometría de flujo de dos colores permite una medición precisa de los fenotipos de restricción y apoya la desestimación mecanicista de variantes candidatas. Este flujo de trabajo es directamente relevante para la selección en fases iniciales de carteras y para la confianza predictiva en la evaluación de dianas antivirales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de SAMHD1 como un factor de restricción en un contexto celular controlado.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos mediante la cuantificación del impacto de sustituciones específicas de aminoácidos en la actividad de restricción.
- Facilita el análisis comparativo de construcciones de tipo silvestre y mutantes para informar la confianza en el blanco.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un ensayo cuantitativo y reproducible para evaluar fenotipos de restricción en múltiples constructos.
- Normaliza estrategias de selección de poblaciones celulares y compensación para obtener lecturas de citometría de flujo de alto contenido y confiables.
- Prepara sistemas celulares validados para el cribado posterior de moduladores de SAMHD1 o variantes virales.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relaciona los fenotipos de restricción con la diferenciación celular y el estado metabólico para aumentar la relevancia en enfermedades.
- Permite adaptarse para estudiar los efectos de modificadores de SAMHD1, apoyando la exploración traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación en modelos preclínicos al evaluar factores de restricción del huésped.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este ensayo se integra en la continuidad del descubrimiento, desde estudios mecanicistas iniciales hasta la identificación de compuestos líder y la validación preclínica de factores de restricción del hospedador.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función de SAMHD1 y el análisis de vías en células mieloides.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para comparar la actividad restrictiva entre diferentes constructos y condiciones.
- Análisis: Ofrece mediciones de la razón de restricción y resultados estadísticos para comparaciones sólidas entre condiciones.
- Investigación Traducional: Permite evaluar la actividad restrictiva en distintos estados de diferenciación y metabolismo, favoreciendo la alineación traslacional.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma flexible y adaptable para analizar diversas proteínas, tipos celulares y dianas virales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de hospedador-patógeno.
- Valor Operacional: Favorece la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de ensayos para aplicaciones de alto rendimiento.
- Valor Estratégico: Orienta las decisiones de continuar/no continuar y mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos asociados a dianas antivirales.
- Impacto en el Portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de dianas y constructos candidatos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en citometría de flujo multicolor y estrategias de selección de poblaciones para una adquisición precisa de datos.
- Depende del acceso a instrumentación de citometría de flujo y software analítico compatible.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos en cuanto a controles, compensación y protocolos de selección de poblaciones.
- Adaptable a diferentes sistemas celulares y constructos virales con una optimización adecuada.
- El rendimiento del ensayo es sensible a las tasas de infección y a la precisión en la selección de poblaciones, lo que afecta la fiabilidad de los datos.
