Name: Tinción del Ca2+ citoplasmático con Fluo-4/AM en pulpa de manzana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a detectar Ca²⁺ citoplasmático en protoplastos de pulpa de manzana usando Fluo-4/AM. Este método no invasivo permite el estudio de la señalización de calcio en frutas.

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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Mejora de Variedades Agrícolas de la Provincia de Shandong (2019LZGC007) y el equipo de innovación de árboles frutales del sistema de tecnología de la industria agrícola moderna de Shandong (SDAIT-06-05).

1. Extracción de protoplastos
<ol><li>Preparar la solución básica: 20 mM De CaCl2, 5 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico y 0,4 M de D-sorbitol. NOTA: El pH de la solución básica se ajustó a 5,8 con tampón Tris de 0,1 M, se filtró a través de filtros solubles en agua de 0,22 μm y se almacenó a 4 °C.</li>
	<li>Preparar la solución enzimática: Mezclar 0,3% (p/v) Macerozyme R-10 y 0,5% (p/v) celulasa R-10 con la solución básica.</li>
	<li>Añadir 0,5 ml de solución enzimática en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Elige una manzana sana y madura. Luego corte la pulpa en 10 x 5 x 1 mm3 tamaño (Figura 1A-1C).</li>
	<li>Coloque las piezas de pulpa de fruta de manzana en un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contenga solución enzimática y luego cierre el tubo (Figura 1D).</li>
	<li>Incubar el tubo a 28 °C durante 1 h, agitando a 70 rpm/min en un agitador en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar los trozos de pulpa. Aspire toda la solución enzimática y luego agregue 0.5 ml de la solución básica.</li>
	<li>Centrifugadora a 300 x g durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para obtener una suspensión de protoplasto, aspire la solución desde la parte inferior del tubo de la centrífuga (Figura 1E).</li>
</ol>2. Tinción de fluorescencia de iones de calcio de molécula pequeña
<ol><li>Prepare la solución de carga Fluo-4/AM con 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 y solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS:80 mM Na2HPO4, 1.36 M NaCI, 20 mM KH2PO4y 26 mM KCI) en una proporción de 1:1:2.</li>
	<li>Añadir 1 μL de solución de carga fluo-4/AM a 99 μL de la suspensión de protoplasto presente en los tubos centrífugos de 1,5 ml. Asegúrese de que la concentración final del colorante fluorescente sea de 5 μM. Mezcle la solución y luego cierre el tubo.</li>
	<li>Tratamiento La3+: Preparar 100 μM La3+ solución con 98 μL de la suspensión protoplasta, 1 μL de 10 mM La3+y 1 μL de solución de carga Fluo-4/AM. Mezcle la solución y cierre el tubo.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar los protoplastos por centrifugación a 300 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Aspire 70 μL de la solución y agregue 70 μL de la solución básica.</li>
	<li>Incubar la suspensión de protoplastos a 37 °C durante 30 min para desesterrificar completamente.</li>
	<li>Aspirar 15 μL de la suspensión del protoplasto y gotear sobre un portaobjetos.</li>
	<li>Observar bajo un microscopio de fluorescencia (Figura suplementaria S1). NOTA: Utilice una cámara a color con alta sensibilidad, es decir, un sensor CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) con una resolución de píxeles de 3,45 μm.</li>
	<li>Seleccione el canal GFP para la obtención de imágenes (20x). Establezca el brillo en 0.5. NOTA: La iluminación son cubos de luz LED de intensidad ajustable con un conjunto de filtros recubiertos de dureza integrados. La longitud de onda de excitación de Fluo-4/AM es de 490 nm.</li>
</ol>3. Ensayo de viabilidad de Protoplast
<ol><li>Prepare la solución de diacetato de fluoresceína (FDA): Disuelva la FDA en acetona hasta que la concentración final sea de 1 mg / ml.</li>
	<li>Prepare la solución de trabajo de la FDA con 1 μL de la solución de almacenamiento y 99 μL de acetona.</li>
	<li>Añadir 1 μL de solución de trabajo fda a 99 μL de suspensión de protoplastos. Mezcle la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y luego cierre el tubo. NOTA: La concentración final de la FDA es de 100 μg/L.</li>
	<li>Mancha a temperatura ambiente durante 5 min en la oscuridad.</li>
	<li>Prepare las diapositivas y observe bajo un microscopio de fluorescencia.</li>
	<li>Seleccione el canal GFP para la obtención de imágenes(Figura 1F).</li>
</ol>4. Análisis de imágenes
<ol><li>Analice las imágenes adquiridas utilizando software de análisis de imágenes y hojas de cálculo (por ejemplo, Image-Pro Plus y Excel 2010).</li>
	<li>Seleccione dos diámetros verticales de los protoplastos para calcular la intensidad de fluorescencia (Figura suplementaria S2). Se midió la intensidad de fluorescencia de todos los protoplastos bajo diferentes tratamientos. Para el procesamiento final, utilice el software de edición de fotos.</li>
</ol>5. Análisis estadístico
<ol><li>Realizar análisis estadísticos utilizando software estadístico(Figura suplementaria S3). Los datos se presentan en Media ± SD. Se utilizó la prueba tdel estudiante para analizar las diferencias entre los grupos experimentales.</li>
</ol>

<ol><li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+calcium%3A+Transport+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).</li>
<li>Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Sciences+in+China%22%5BJournal%5D)">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li>
<li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li>
<li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color%2C+flavor%2C+texture%2C+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables%3A+desirable+levels%2C+instrumental+and+sensory+measurement%2C+and+the+effects+of+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li>
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<li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+across+plant+membranes%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li>
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<li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+%27Huangguan%27+pears+during+cold+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li>
<li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Horticulture+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li>
<li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Agricultural+Research+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
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<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+practical+red+fluorescent+probe+for+cytoplasmic+calcium+ions+with+greatly+improved+cell-membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability.</a> Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).</li>
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<li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

En este estudio, se obtuvieron protoplastos viables por hidrólisis enzimática. Tenga en cuenta que este método requiere manzanas frescas. El presente protocolo permite el aislamiento rápido de un gran número de protoplastos de pulpa de fruta para su uso en estudios de investigación. La aplicabilidad de este método no se limita a 'Fuji'; los protoplastos de la pulpa de manzana de 'Dounan' y 'Honey Crisp' también se pueden extraer a través del mismo protocolo(Figura suplementaria S4). La solución de protop...

Ca2+ juega un papel importante en la transducción de señales y el metabolismode las plantas 1,2. Además, regula los rasgos de calidad de la fruta3,4, incluida la dureza, el contenido de azúcar y la susceptibilidad a los trastornos fisiológicos durante el almacenamiento5,6. El Ca2+ citoplasmático juega un papel importante en la transducción de señales y regula el crecimiento y desarrollo de las plantas7. La alteración de la homeostasis del calcio celular puede inducir hueso amargo en manzanas8,enfermedad de manchas marrones en peras9y pudrición umbilical en tomates10,afectando la calidad de la fruta y causando graves pérdidas económicas3,11. Las imágenes de calcio tienen suficiente resolución espacial y temporal y es un método importante para observar la dinámica de Ca2+ en células vivas12,13.
En la actualidad, hay dos métodos principales para la obtención de imágenes de calcio intracelular en células vivas: uno emplea sondas fluorescentes químicas de pequeño molecular14, y el otro es el sensor de codificación de genes (GECI)15,16. Dada la dificultad de establecer un sistema transgénico estable en los árboles frutales y un desarrollo más largo de la fruta, GECIS no es adecuado para la obtención de imágenes de fluorescencia Ca2+ de la fruta.
Las sondas fluorescentes de moléculas pequeñas como Fluo-4/AM tienen una ventaja particular: su forma de éster AM (derivado del acetoximetilo éster permeable a las células) puede cargarse fácilmente a granel en las células vivas sin necesidad de transfección, lo que la hace flexible, rápida y no citotóxica17. Fluo-4 / AM podría cargarse con éxito en el tubo de polen de Pyrus pyrifolia18 y Petunia,19, así como en las células de guardia20 y el vello de la raíz de Arabidopsis21.
En la actualidad, hay pocos informes sobre la tinción de fluorescencia de calcio de las células pulpares22. Como elemento mineral importante, el calcio juega un papel clave en el crecimiento y control de calidad de los frutos de los árboles como las manzanas. Los manzanos son reconocidos mundialmente como una especie económica importante, y las manzanas se consideran un alimento saludable23. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de pulpa de fruta de manzana a través de hidrólisis enzimática y luego cargamos reactivos fluorescentes de moléculas pequeñas en el citoplasma para detectar Ca2 +.

<table><tbody><tr><td>10 veces; solución salina tamponada con fosfato</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS (solución tamponada con fosfato) es una solución tampón de fosfato, que puede proporcionar un entorno iónico relativamente estable y capacidad de amortiguación de pH. Es una solución salina tampón que se utiliza a menudo en biología para la clonación molecular y el cultivo celular. El pH es de 7.4.</td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>Tampón biológico</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>El cloruro de calcio dihidratado es un producto químico blanco o gris, principalmente en forma granular.</td></tr><tr><td>Celulasa R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7352</td><td>Degradar las paredes celulares de las plantas.</td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Solarbio</td><td>S8090</td><td>Tiene buenas propiedades hidratantes, evita la sequedad y evita que el azúcar, la sal, etc. se cristalicen.</td></tr><tr><td>F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6867</td><td>Pluronic F-127 es un poliol surfactante no iónico (peso molecular de aproximadamente 12500 Daltons), que se ha descubierto que es beneficioso para promover la disolución de tintes insolubles en agua y otros materiales en medios fisiológicos.</td></tr><tr><td>FDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td>FDA es un sustrato de esterasa permeable en células que puede servir como una sonda de viabilidad que mide tanto la actividad enzimática, que se requiere para activar su fluorescencia, como la integridad de la membrana celular, que se requiere para la retención intracelular de su producto fluorescente.</td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>El indicador de calcio fluorescente verde Fluo-4/AM es una versión mejorada del indicador de calcio Fluo-3/AM. El Fluo-4/AM se carga más rápido y es más brillante a la misma concentración. Se puede excitar bien con un láser de iones de argón de 488 nm.</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>Observe la imagen de fluorescencia.</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7351</td><td>Degrade el tejido vegetal para separar células individuales.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td>Es ampliamente utilizado en la preparación de tampones en experimentos de bioquímica y biología molecular.</td></tr></tbody></table>

tinción del ca2+ citoplasmático con fluo-4/am en pulpa de manzana

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

El Ca2+ citosólico juega un papel clave en el desarrollo de las plantas. La imagen de calcio es el método más versátil para detectar cambios dinámicos en Ca2+ en el citoplasma. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de células pulpares por hidrólisis enzimática. Los protoplastos aislados se incubaron con el reactivo fluorescente de molécula pequeña (Fluo-4/AM) durante 30 min a 37 °C. Las sondas fluorescentes tiñeron con éxito el Ca2+ citosólico pero no se acumularon en las vacuolas. La3+,un bloqueador de los canales de Ca2+, disminuyó la intensidad de la fluorescencia citoplasmática. Estos resultados sugieren que Fluo-4 / AM se puede utilizar para detectar cambios en ca2 + citosólico en la pulpa de la fruta. En resumen, presentamos un método para aislar eficazmente los protoplastos de las células de la carne de la fruta y detectar Ca2+ cargando un reactivo fluorescente de calcio de molécula pequeña en el citoplasma de las células pulpares.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, utilizamos el método enzimático para obtener protoplastos viables de la pulpa (Figura 1). Algunos protoplastos tenían vacuolas, mientras que otros no. Mientras que los protoplastos no exhibieron fluorescencia cuando el indicador fluorescente Ca2 + no se cargó en ellos. Cuando Fluo-4/AM se cargó en los protoplastos, el citoplasma, pero no la vacuola, se volvió fluorescente (Figura 2). Este resultado indicó...

Los protoplastos aislados de células de pulpa de manzana se cargaron con un reactivo fluorescente de calcio para detectar la concentración citoplasmática de Ca2+.

Tinción del Ca2+ citoplasmático con Fluo-4/AM en pulpa de manzana

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

Como elemento mineral importante, el calcio juega un papel clave en el crecimiento y el control de calidad de los frutos de los árboles como la manzana, puede regular la dureza, el contenido de azúcar, el período de almacenamiento y el trastorno fisiológico durante el almacenamiento. Las imágenes de calcio son el método más occidental para detectar cambios dinámicos en los iones de calcio en el citoplasma. Los indicadores fluorescentes de moléculas pequeñas, como fluo-4 / AM tienen selectividad específica de iones de calcio y pueden cargarse de forma no invasiva mediante incubación de esterificación, que es flexible, rápida y no citotóxica.Este protocolo introducirá un método para cargar el reactivo fluorescente químico de molécula pequeña fluo-4 / AM en protoplastos de plantas. Extracción de protoplastos Agregue 0.5 mililitros de solución enzimática en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Elija una manzana sana y madura, luego corte la pulpa en 10 veces 5 veces 1 mililitro cúbico de tamaño.Coloque las piezas de pulpa en una solución enzimática, luego cierre el tubo. Incubar el tubo a 28 grados durante una hora. Encadenado a 70 rpm en la oscuridad.Después de eso, lave las piezas de pulpa, aspire toda la solución enzimática y luego agregue la solución básica de 0.5 mililitros. Centrifugar a una velocidad de 300 g durante 2 minutos. La suspensión de protoplastos se puede obtener aspirando la solución inferior.Tinción de reactivos de fluorescencia química de moléculas pequeñas. Prepare la solución de carga fluo-4/AM con un fluo-4/AM de 2 milimolares, 20% de etilo127 y la solución salina tamponada con fosfato 10X en una proporción de uno a uno a dos. Añadir 1 solución de carga de microlitros de fluo-4/AM a la suspensión de protoplastos de 99 microlitros.La concentración final de colorantes fluorescentes es de 5 micromolares. Mezcle la solución y luego cierre el tubo. Al mismo tiempo, el lantano plancha el calcio o singularidad del pequeño agente químico molecular fluorescente.Agregue un microlitro o 10 microlitros más de hierro lantano y luego una solución de carga de microlitros de fluo-4 / AM a la suspensión de protoplastos de 98 microlitros. La concentración final de hierro lantano es de 100 micromolares. Mezcle la solución y luego cierre el tubo.Incubar a 37 grados durante 30 minutos en la oscuridad. Después de eso, centrífuga a la velocidad de 300 G durante dos minutos. Aspire a la solución de 17 microlitros y agregue una solución básica de 17 microlitros.Incubar la suspensión de protoplastos a 37 grados durante 30 minutos para completar completamente Después de eso, aspirar 50 microlitros de suspensión de protoplastos y gotear sobre un portaobjetos. Observar bajo microscopio de fluorescencia. Seleccione el aumento de 20 veces y el canal GFP para observar.Ajuste uniformemente el brillo a 0.5. Un paso crítico en este método propuesto es lavar la mancha en los protoplastos e incubarlos durante 30 minutos. El lavado insuficiente causa un respaldo excesivo en la fluorescencia durante la observación y la incubación permite una mejor carga o la sonda en el citoplasma.Ensayo de viabilidad de los protoplastos Tome 99 microlitros de suspensión de protoplastos después de incubar a 37 grados durante 30 minutos. Añadir 1 ml en la solución FD a la suspensión de protoplastos. Mezcle la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces y luego cierre el tubo.Permanezca a temperatura ambiente durante cinco minutos en la oscuridad. Prepare las diapositivas y obsérnese en el microscopio de fluorescencia con canal GFP. Te presentamos los resultados Siguiendo la figura uno.Utilizamos el método enzimático para obtener protoplastos a partir de la pulpa. Algunos protoplastos tenían una vacuola, mientras que otros no. Los protoplastos se tiñeron con FD durante cinco minutos y muestran la florescente en el citoplasma indicando que la alta temperatura, 37 grados no afecta a la viabilidad o protoplastos Figura dos.Los protoplastos no exhibieron fluorescencia en uno de los indicadores de fluorescencia de los hierros de calcio o no está cargado en ellos. Que en fluo-4/AM se cargó en el protoplasto, el ciplasto, pero no una vacuola se volvió fluorescente. Los hierros de lantano que bloquean eficazmente los canales de calcio son la membrana celular se agregaron a la carga de Protoplast fluo-4 / AM.A la concentración final de 100 hierros lantanos micromolares reducen significativamente la intensidad de la fluorescencia del calcio. Estos resultados demostraron además que la fluo-4 / AM se mantiene efectivamente en los hierros de calcio en el ciplasto y muestra cambios dinámicos en el contenido de hierros de calcio. Figura tres Los resultados de fluo-4/AM se analizaron utilizando la tinción fluo-4/AM aprobada por IMH más el software 6.0 con adición de hierros lantanos redujo significativamente el valor de florescencia de los hierros de calcio citoplasmáticos.En este video, todos los protoplastos se obtuvieron por hidrólisis enzimática. Cargamos con éxito las sondas fluorescentes en un protoplasto a 37 grados. Más aún, el método no afectó la viabilidad de los protoplastos.En resumen, el método descrito aquí en especie detallado. Los cambios dinámicos en los iones de calcio citoplasmáticos en las células de la pulpa de manzana proporcionan así 10 soportes iguales para el propósito adicional de los estudios relacionados con el calcio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

La actividad espontánea de la creación de redes neuronales se puede medir con AM-éster formas de tintes indicadores sensibles de calcio. Cambios en el calcio intracelular, lo que indica la activación neuronal, se detectan los cambios transitorios de la fluorescencia con un indicador o imagen de dos fotones. Este protocolo puede ser adaptado para una serie de redes neuronales del desarrollo que dependen...

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

En este video, describimos un procedimiento de tinción para visualizar la deposición de celulosa dentro de las paredes celulares de Arabidopsis thaliana, una planta dicotiledónea, utilizando blanco de calcofluor, que se une específicamente a los glucanos ligados a β, exhibiendo fluorescencia bajo luz UV.

Tinción con blanco de calcoflúor: un método simple para la visualización de fluorescencia inducida por UV de depósitos de celulosa en las paredes celulares de secciones de tallo de plantas dicotiledóneas

Se describe el uso de colorantes de estirilo FM a la imagen de reciclado de vesículas sinápticas en las terminales nerviosas funcionales. Este protocolo se puede aplicar no sólo a evocada, sino también espontánea y actividades sinápticas en miniatura. El protocolo se expande la variedad de eventos sinápticas que pueden ser evaluados de manera eficaz.

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La composición de la pared celular de la planta varía según el tipo de tejido y puede incluir lignina, celulosa, hemicelulosas y pectina. Se han desarrollado varias técnicas de tinción para visualizar las diferencias a nivel de tipo de célula. Este artículo es una recopilación de las técnicas de tinción de pared celular más utilizadas.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

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Los colorantes fluorescentes vitales son herramientas esenciales para el análisis de imágenes de células vivas en la biología moderna de células fúngicas. Este artículo detalla la aplicación de colorantes fluorescentes establecidos y menos conocidos para el seguimiento de la dinámica de la membrana plasmática, la endo-/exócicosis y la morfogénesis de la pared celular en hongos filamentosos.

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Aquí, se describe un método para hacer que los tejidos vegetales sean transparentes mientras se mantiene la estabilidad de las proteínas fluorescentes. Esta técnica facilita la obtención de imágenes profundas de tejidos vegetales despejados sin seccionamiento físico.

Limpieza óptica de tejidos vegetales para imágenes de fluorescencia

Aprende a detectar Ca²⁺ citoplasmático en protoplastos de pulpa de manzana usando Fluo-4/AM. Este método no invasivo permite el estudio de la señalización de calcio en frutas.

Tinción del Ca²⁺ citoplasmático con Fluo-4/AM en pulpa de manzana

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