Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten

Nuestro método permite monitorizar el aumento de la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales midiendo el aumento de su volumen. Este método no invasivo es muy bien tolerado, por lo tanto, se pueden programar múltiples sesiones de imágenes en el mismo animal experimental en el transcurso de dos semanas. Este método es ideal para evaluar el impacto del tratamiento farmacológico en la enfermedad metastásica.

Aplicamos este método al modelo de melanoma braf/pten, pero en principio, se puede adaptar para evaluar la eficacia de varios fármacos en una variedad de modelos preclínicos de cáncer metastásico en ratones. Marianna Vitiello, una post-doc de mi laboratorio, y la Dra. Claudia Kusmic, investigadora del IFC-CNR. Para la inducción del melanoma, aplique tres microlitros de 4-hidroxitamoxifeno cinco milimolares sobre aproximadamente un centímetro cuadrado de piel afeitada de la parte superior de la espalda durante tres días seguidos.

Seis semanas después de la pintura de la piel, use pinzas para medir el volumen del tumor primario y, finalmente, de las metástasis subcutáneas. Luego, use imágenes de ultrasonido para medir el volumen de los ganglios linfáticos inguinales. Después de analizar el tumor primario y los ganglios linfáticos mediante inspección visual, extirparlos para estudios histológicos.

Después de confirmar la anestesia, transfiera al animal a una tabla calentada de la estación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, manteniendo al animal en posición supina. Ajuste la temperatura de la placa con una sonda rectal lubricada con vaselina para mantener la temperatura corporal del ratón en el rango fisiológico. Cubra las patas delanteras y traseras con pasta conductora y péguelas con cinta adhesiva a los electrodos de la placa de ECG incrustados en la placa.

Compruebe que los parámetros fisiológicos se adquieren y muestran correctamente. Eliminar el vello de ambas zonas inguinales aplicando un agente depilatorio y recubrirlas con un medio de acoplamiento acústico. Luego, sujete la sonda lineal de ultrasonido de frecuencia ultra alta en un motor 3D especializado integrado en la estación de imágenes, lo que permite el movimiento automatizado y paso a paso de la sonda.

Orientar y ajustar adecuadamente la posición de la sonda de ultrasonido para obtener imágenes de acceso corto del ganglio linfático inguinal, y colocar la región de interés en la zona focal. Establezca la distancia de escaneo entre dos y cinco milímetros, el tamaño del paso a 44 micrómetros con un resultado de 46 a 114 pasos de escaneo por corte de ganglio linfático y un tiempo de adquisición de uno a tres minutos por animal. Escanee todo el volumen del ganglio linfático inguinal como una secuencia de imágenes 2D en modo B, adquiriendo imágenes a múltiples niveles mediante el movimiento lineal del transductor con tamaños de paso a escala micrométrica para generar datos 3D en términos de respiración y bucles de cine activados cardíacos.

Después de la obtención de imágenes, almacene digitalmente las imágenes adquiridas en formato RAW para realizar más análisis fuera de línea. Para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido, abra el conjunto de datos de las imágenes de ganglios linfáticos inguinales 3D, seleccione el método de corte múltiple y presione el botón Inicio para visualizar tanto los fotogramas actuales como las miniaturas de todos los fotogramas correspondientes a cada imagen capturada durante la adquisición 3D. Seleccione la miniatura del primer fotograma donde el ganglio linfático es evidente para cargarlo en la vista de contorno.

En la vista de contorno, haga clic con el botón izquierdo del mouse para colocar puntos a lo largo del borde del ganglio linfático. Una vez que se haya establecido el número deseado de puntos, lama derecha para completar el contorno. Una vez completado el primer contorno, utilice la vista en miniatura para seleccionar la siguiente imagen para el contorno.

Si es necesario, omita varias imágenes entre contornos para reducir el número de rastros manuales necesarios para cada volumen 3D. Repita este proceso hasta que se haya delineado todo el volumen, luego, haga clic en Finalizar. Mientras esté en el espacio de trabajo de la ventana de modo 3D, haga clic en el icono de medición de volumen debajo del área de visualización de la imagen para visualizar el valor numérico del volumen de los ganglios linfáticos y active la vista de superficie con la representación 3D del volumen de los ganglios linfáticos.

El tratamiento de ratones con 4-hidroxitamoxifeno induce la actividad de la enzima CreER, causando un cambio a nivel genómico de Braf de tipo salvaje a Braf V600E mutado, mientras que Pten se pierde. Cuatro semanas después del tratamiento con 4-hidroxitamoxifeno, los tumores primarios alcanzan un volumen de 50 a 100 milímetros cúbicos y su crecimiento puede medirse con pinzas durante dos semanas adicionales, mostrando así un aumento gradual de la pigmentación observada en los ganglios linfáticos inguinales. Los depósitos de melanina se deben invariablemente a la presencia de células de melanoma metastásicas, como lo confirma la tinción inmunohistoquímica del antígeno del melanoma MelanA y Braf V600E.

Al final de la fase de segmentación, todas las secciones mostraron la superposición del contorno externo del ganglio linfático. Las representaciones 3D de un ganglio linfático inguinal derecho, analizadas a las cuatro, cinco y seis semanas después del tratamiento con 4-HT se muestran aquí. También se cuantificó el aumento de volumen de los ganglios linfáticos inguinales izquierdo y derecho del mismo animal a lo largo del tiempo.

Se recomienda combinar las imágenes de ultrasonido con la tinción inmunohistoquímica adecuada, de modo que se confirme la presencia de células cancerosas a nivel molecular. Además de los ganglios linfáticos, el volumen de metástasis subcutáneas también se puede controlar a lo largo del tiempo mediante imágenes de ultrasonido. Si el período de dos semanas es demasiado corto para apreciar los efectos del fármaco en estudio, seleccione un sitio de inducción más periférico o un genotipo menos propenso a tumores.