Name: Tres métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN: limma, EdgeR, DESeq2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a realizar análisis de expresión diferencial en RNA-seq usando limma, EdgeR y DESeq2 con datos de Cholangiocarcinoma. Este protocolo computacional permite identificar genes diferencialmente expresados en estudios de secuenciación masiva.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 81860276) y los Proyectos clave del Fondo Especial del Programa Nacional de I + D Clave (Subvención No. 2018YFC1003200).

NOTA: Abra el programa R-studio y cargue el archivo R "DEGs.R", el archivo se puede adquirir desde Archivos suplementarios / Scripts.
1. Descarga y preprocesamiento de datos
<ol><li>Descargue los datos de recuento de secuenciación de alto rendimiento (HTSeq) de colangiocarcinoma (CHOL) del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA). Este paso se puede lograr fácilmente con el siguiente código R.<ol>
<li>Haga clic en Ejecutar para instalar paquetes de R.</li>
		<li>Haga clic en Ejecutar para cargar paquetes de R. if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE)) + install.packages("BiocManager") BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "SummarizedExperiment"))</li>
		<li>Establezca el directorio de trabajo. biblioteca (TCGAbiolinks) library(ResumenExperimento) setwd("C:/Usuarios/LIUSHIYI/Escritorio")</li>
		<li>Elija el tipo de cáncer. cáncer <- "TCGA-CHOL"</li>
		<li>Ejecute el código R desde el archivo "GDCquery.R" para descargar los datos. El archivo "GDCquery.R" se puede adquirir a partir de archivos complementarios/scripts: source("Archivos suplementarios/Scripts/GDCquery.R") cabeza(cnt) ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##ENSG00000000003 4262 ##ENSG00000000005 1 ##ENSG00000000419 1254 ##ENSG00000000457 699 ##ENSG00000000460 239 N.º #ENSG00000000938 334 NOTA: Después de la ejecución, los datos de recuento de CHOLHTSeq se descargarán y se denominarán "cnt", donde las filas representan los identes de genes de conjunto y las columnas representan los identificados de muestra. Tenga en cuenta los números en las posiciones 14-15 en las identificaciones de muestra; números que van de 01 a 09 indican tumores y que van de 10 a 19 indican tejidos normales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convierta los ID de genes de conjunto en símbolos genéticos.<ol>
<li>Importe el archivo de anotación a R de acuerdo con su ruta de almacenamiento. El archivo de anotación (gencode.v22.annotation.gtf) se puede adquirir desde archivos suplementarios. gtf_v22 <- rtracklayer::import('Archivos suplementarios/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>Ejecute el código R desde el "gtf_v22. R", que se puede adquirir a partir de archivos complementarios/scripts: source("Archivos suplementarios/Scripts/gtf_v22. R")</li>
		<li>Aplique la función "ann" para convertir los ID de genes del conjunto en símbolos de genes. cnt=ann(cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtrado de genes de baja expresación<ol>
<li>Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete de R "edgeR". BiocManager::install("edgeR")</li>
		<li>Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete de R "edgeR". biblioteca(edgeR)</li>
		<li>Ejecute el siguiente código R para mantener genes con valores de recuento por millón (CPM) superiores a uno de al menos dos muestras. keep <- rowSums(cpm(cnt)>1)>=2 cnt <- as.matrix(cnt[keep,]) NOTA: El valor de recuentos por millón (CPM) se utiliza en lugar del recuento de lectura para eliminar la desviación causada por diferentes profundidades de secuenciación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análisis de expresión diferencial a través de "limma"
<ol><li>Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete R "limma". BiocManager::install("limma")</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para cargar los paquetes de R "limma", "edgeR". biblioteca(limma) biblioteca(edgeR)</li>
	<li>Ejecute el siguiente código de R para crear la matriz de diseño. grupo <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information grupo [grupo %in% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue grupo [grupo %en% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue grupo <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>Cree la matriz de diseño. design <- model.matrix (~group) rownames(design) <- colnames(cnt)</li>
		<li>Cree el objeto DGEList. dge <- DGEList(counts = cnt, group = group)</li>
		<li>Normalizar los datos. dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")</li>
		<li>Ejecute el siguiente código de R para realizar el análisis de expresión diferencial basado en el método limma-trend. dge ##An objeto de la clase "DGEList" ##$counts ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##TSPAN6 4262 ##DPM1 1254 ##SCYL3 699 ##C1orf112 239 N.º #FGR 334</li>
		<li>Calcule el valor de CPM. logdge <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)</li>
		<li>Haga clic en Ejecutar para ajustar un modelo lineal para predecir los datos o inferir la relación entre variables. ajuste <- lmFit (logdge, diseño)</li>
		<li>Calcule el valor T, el valor F y las probabilidades logarítmos basadas en bayesiano. fit <- eBayes(fit, trend=TRUE)</li>
		<li>Extraiga la tabla de resultados. res_limma<- as.data.frame(topTable(fit,n=Inf)) cabeza(res_limma) ## logFC AveExpr t P.Value adj. P.Val B ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 #The resultado del análisis de expresión diferencial se guarda en "res_limma", que incluye el id del gen, el valor de cambio log2 fold (logFC), el nivel medio de expresión log2 del gen en el experimento (AveExpr), la estadística t modificada (t), el valor relavent p (P.Value), la tasa de descubrimiento falso (FDR) corregido p valor (adj. P.Val) y las probabilidades logarítmosa de genes expresados diferencialmente (B) NOTA: La función "calcNormFactors()" del "edgeR" se utilizó para normalizar los datos para eliminar la influencia causada por la preparación de muestras o la construcción y secuenciación de bibliotecas. En la construcción de la matriz de diseño, es necesario hacer coincidir el diseño experimental (por ejemplo, tipo de tejido: tejidos normales o tumorales) con las muestras de las direcciones de la matriz. limma-trend es adecuado para datos cuya profundidad de secuenciación es la misma, mientras que limma-voom es adecuado: (i) cuando el tamaño de la biblioteca de muestras es diferente; ii) datos no normalizados por TMM; (iii) hay mucho "ruido" en los datos. Un logFC positivo significa que el gen está regulado al pie en el experimento, mientras que el número negativo significa que el gen está regulado a la baja.</li>
		<li>Identificar los DEG. res_limma$sig <- as.factor( ifelse(res_limma$adj. P.Val < 0.05 & abs(res_limma$logFC) > 2, ifelse(res_limma$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) # El valor de adj.p < 0.05 y el |log2FC| > = 2 son umbrales para identificar los DEG resumen(res_limma$sig) ##down no arriba ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>Genere la tabla de resultados en un archivo. write.csv(res_limma, archivo = 'result_limma.csv')</li>
		<li>Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete de R "ggplot2". install.packages("ggplot2")</li>
		<li>Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete R "ggplot2". biblioteca(ggplot2)</li>
		<li>Ejecute el código R desde el "volcán". R" para crear la trama del volcán. El archivo "volcán. R" se puede adquirir a partir de archivos complementarios. source("Archivos suplementarios/Scripts/volcano. R") volcano(res_limma,"logFC","adj. P.Val",2,0.05) NOTA: Los genes se pueden mapear a diferentes posiciones de acuerdo con sus valores log2FC y adj-p, los DEG regulados hacia arriba están coloreados en rojo y los DEG regulados hacia abajo están coloreados en verde.</li>
		<li>Haga clic en Exportar para guardar el gráfico del volcán. NOTA: Los diagramas de volcanes se pueden generar y descargar en diferentes formatos (por ejemplo, pdf, TIFF, PNG, formato JPEG). Los genes se pueden mapear a diferentes posiciones de acuerdo con sus valores log2FC y adj p, los DEG regulados al pie (log2FC > 2, adj p < 0.05) están coloreados en rojo, y los DEG regulados a la baja (log2FC < -2, adj p < 0.05) están coloreados en verde, los no DEG están coloreados en gris.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de expresión diferencial a través de "edgeR"
<ol><li>Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete de R "edgeR". biblioteca(edgeR)</li>
	<li>Ejecute el siguiente código de R para crear una matriz de diseño. grupo <-subcadena(colnames(cnt),14,15) grupo [grupo %en% "01"] <- "Cáncer" grupo [grupo %en% "11"] <- "Normal" grupo=factor(grupo, niveles = c("Normal","Cáncer")) design <-model.matrix(~group) rownames(diseño) = colnames(cnt)</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para crear el objeto DGEList. dge <- DGEList(counts=cnt)</li>
	<li>Normalizar los datos. dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para estimar la dispersión de los valores de expresión génica. dge <- estimateDisp(dge, diseño, robusto = T)</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para ajustar el modelo y contar los datos. ajuste <- glmQLFit(dge, diseño)</li>
	<li>Realizar una prueba estadística. ajuste <- glmQLFTest(fit)</li>
	<li>Extraiga la tabla de resultados. El resultado se guarda en "res_edgeR", que incluye el valor de cambio de pliegue de registro, CPM de registro, F, valor de p y valor de p corregido de FDR. res_edgeR=as.data.frame(topTags(fit, n=Inf)) cabeza(res_edgeR) ## logFC logCPM F PValue FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 #The resultado se guarda en "res_edgeR", que incluye el valor de cambio de pliegue de registro (logFC), CPM de registro, F, valor de p y valor de p corregido de FDR</li>
	<li>Identificar los DEG. res_edgeR$sig = as.factor( ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05 & abs(res_edgeR$logFC) > 2, ifelse(res_edgeR$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) resumen(res_edgeR$sig) ##down no arriba ##1578 15965 3121</li>
	<li>Genere la tabla de resultados en un archivo. write.csv(res_edgeR, archivo = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>Crea la trama del volcán. volcano(res_edgeR,"logFC","FDR",2,0.05)</li>
	<li>Haga clic en Exportar para guardar el gráfico del volcán.</li>
</ol>4. Análisis de expresión diferencial a través de "DESeq2"
<ol><li>Haga clic en Ejecutar para instalar los paquetes de R "DESeq2". BiocManager::install("DESeq2")</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para cargar los paquetes de R "DESeq2". biblioteca(DESeq2)</li>
	<li>Ejecute el siguiente código de R para determinar el factor de agrupación. grupo <-subcadena(colnames(cnt),14,15) grupo [grupo %en% "01"] <- "Cáncer" grupo [grupo %en% "11"] <- "Normal" grupo=factor(grupo, niveles = c("Normal","Cáncer"))</li>
	<li>Cree el objeto DESeqDataSet. dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(group), design = ~group) Dds ##class: DESeqDataSet ##dim: 20664 45 ##metadata(1): versión ##assays(1): cuenta ##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 ##rowData nombres(0): ##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... ##colData nombres(1): grupo</li>
	<li>Realizar el análisis. dds <- DESeq(dds)</li>
	<li>Genere la tabla de resultados. res_DESeq2 <- data.frame(results(dds)) cabeza(res_DESeq2) ## baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 NOTA: El resultado se guarda en "res_DESeq2", que incluye la media del recuento de lectura normalizado (baseMean), el valor de cambio de pliegue de registro (log2FoldChange), el error estándar de cambio de pliegue de registro (lfcSE), la estadística de Wald (estadística), el valor p original (pvalue) y el valor p corregido (padj)</li>
	<li>Identificar DEGs. res_DESeq2$sig = as.factor( ifelse(res_DESeq2$padj < 0.05 & abs(res_DESeq2$log2FoldChange) > 2, ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange > 2 ,'up','down'),'not')) resumen(res_DESeq2$sig) ##down no arriba ##1616 16110 2938</li>
	<li>Genere la tabla de resultados en un archivo. write.csv(res_DESeq2, archivo = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>Crea la trama del volcán. volcano(res_DESeq2,"log2FoldChange","padj",2,0.05)</li>
	<li>Haga clic en Exportar para guardar el gráfico del volcán.</li>
</ol>5. Diagrama de Venn
<ol><li>Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete R "VennDiagram". install.packages("VennDiagram")</li>
	<li>Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete R "VennDiagram". biblioteca (VennDiagram)</li>
	<li>Haga un diagrama de Venn de los DEG regulados. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="arriba",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up",]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== "arriba",])), NULL,altura = 3,ancho = 3,unidades = "en", col="negro",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alfa=c(0.5, 0.5, 0.5),main = "DEGs regulados al up"))</li>
	<li>Haga clic en Exportar para guardar el diagrama de Venn.</li>
	<li>Haga un diagrama de Venn de DEG regulados hacia abajo. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ limma[res_limma$sig=="abajo",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig== "abajo",]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="abajo",])), NULL,altura = 3,ancho = 3,unidades = "en", col="negro",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alfa=c(0.5, 0.5, 0.5),main = "DEGs regulados a la baja"))</li>
	<li>Haga clic en Exportar para guardar el diagrama de Venn.</li>
</ol>

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<li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
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<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
</ol>

El manuscrito no ha sido publicado antes y no está siendo considerado para su publicación en otro lugar. Todos los autores han contribuido a la creación de este manuscrito para un contenido intelectual importante y han leído y aprobado el manuscrito final. Declaramos que no hay conflicto de intereses.

Las abundantes transcripciones aberrantes en los cánceres se pueden identificar fácilmente mediante el análisis diferencial de ARN-seq5. Sin embargo, la aplicación del análisis de expresión diferencial RNA-seq a menudo está restringida, ya que requiere ciertas habilidades con el lenguaje R y la capacidad de elegir métodos apropiados. Para abordar este problema, proporcionamos una introducción detallada a los tres métodos más conocidos (limma, EdgeR y DESeq2) y tutoriales para aplicar el análisis d...

La secuenciación de ARN (RNA-seq) es una de las tecnologías más utilizadas en transcriptómica con muchas ventajas (por ejemplo, alta reproducibilidad de datos), y ha aumentado drásticamente nuestra comprensión de las funciones y dinámicas de procesos biológicos complejos1,2. La identificación de transcripciones aberrantes bajo diferentes contextos biológicos, que también se conocen como genes expresados diferencialmente (DEG), es un paso clave en el análisis de ARN-seq. RNA-seq permite obtener una comprensión profunda de los mecanismos moleculares relacionados con la patogénesis y las funciones biológicas. Por lo tanto, el análisis diferencial ha sido considerado como valioso para el diagnóstico, pronóstico y terapéutica de tumores3,4,5. Actualmente, se han desarrollado más paquetes R/Bioconductor de código abierto para el análisis de expresión diferencial RNA-seq, particularmente limma, DESeq2 y EdgeR1,6,7. Sin embargo, el análisis diferencial requiere ciertas habilidades con el lenguaje R y la capacidad de elegir el método apropiado, que falta en el plan de estudios de la educación médica.
En este protocolo, basado en los datos de conteo de ARN-seq de colangiocarcinoma (CHOL) extraídos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), se llevaron a cabo tres de los métodos más conocidos (limma8,EdgeR9 y DESeq210),respectivamente, por el programa R11 para identificar los DEG entre CHOL y tejidos normales. Los tres protocolos de limma, EdgeR y DESeq2 son similares pero tienen diferentes pasos entre los procesos del análisis. Por ejemplo, los datos de recuento normalizado de RNA-seq son necesarios para EdgeR y limma8,9, mientras que DESeq2 utiliza sus propias discrepancias de biblioteca para corregir datos en lugar de la normalización10. Además, edgeR es específicamente adecuado para datos de RNA-seq, mientras que el limma se utiliza para microarrays y RNA-seq. Limma adopta un modelo lineal para evaluar los DEGs12,mientras que las estadísticas en edgeR se basan en las distribuciones binomiales negativas, incluyendo estimación empírica de Bayes, pruebas exactas, modelos lineales generalizados y pruebas de cuasi-verosimilitud9.
En resumen, proporcionamos los protocolos detallados de análisis de expresión diferencial RNA-seq mediante el uso de limma, DESeq2 y EdgeR, respectivamente. Al consultar este artículo, los usuarios pueden realizar fácilmente el análisis diferencial RNA-seq y elegir los métodos de análisis diferencial apropiados para sus datos.

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>versión 3.6.2</td><td>software libre</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>software libre</td></tr></tbody></table>

tres métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de arn: limma, edger, deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

La secuenciación de ARN (RNA-seq) es una de las tecnologías más utilizadas en transcriptómica, ya que puede revelar la relación entre la alteración genética y los procesos biológicos complejos y tiene un gran valor en el diagnóstico, pronóstico y terapéutica de tumores. El análisis diferencial de los datos de RNA-seq es crucial para identificar transcripciones aberrantes, y limma, EdgeR y DESeq2 son herramientas eficientes para el análisis diferencial. Sin embargo, el análisis diferencial RNA-seq requiere ciertas habilidades con el lenguaje R y la capacidad de elegir un método apropiado, que falta en el currículo de la educación médica.
Aquí, proporcionamos el protocolo detallado para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) entre el colangiocarcinoma (CHOL) y los tejidos normales a través de limma, DESeq2 y EdgeR, respectivamente, y los resultados se muestran en gráficos de volcanes y diagramas de Venn. Los tres protocolos de limma, DESeq2 y EdgeR son similares pero tienen diferentes pasos entre los procesos del análisis. Por ejemplo, se utiliza un modelo lineal para la estadística en limma, mientras que la distribución binomial negativa se utiliza en edgeR y DESeq2. Además, los datos de recuento normalizado de RNA-seq son necesarios para EdgeR y limma, pero no son necesarios para DESeq2.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para tres métodos de análisis diferencial: limma, EdgeR y DESeq2. Los resultados de los tres métodos se superponen en parte. Los tres métodos tienen sus propias ventajas, y la elección del método solo depende de los datos.

Existen diversos enfoques para visualizar el resultado del análisis de expresión diferencial, entre los que se utilizan particularmente la gráfica del volcán y el diagrama de Venn. limma identificó 3323 DEGs entre el CHOL y los tejidos normales con el |logFC|≥2 y adj. P.Val &lt;0,05 como umbrales, entre los cuales 1880 fueron regulados a la baja en los tejidos CHOL y 1443 fueron regulados al pie(Figura 1a). Mientras tanto, edgeR identificó los 1578 DEG regulados a la baja y 3121 DEG regulado...

Se proporcionó un protocolo detallado de métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN: limma, EdgeR, DESeq2.

Tres métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

Tres métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN: limma, EdgeR y DESeq2. Abra el programa RStudio y luego cargue el archivo R, DEGs. El archivo se puede adquirir a partir de archivos complementarios. Uno.Descarga y preprocesamiento de datos.1.1. Descargue los datos de recuento de secuenciación de alto rendimiento del colangiocarcinoma del Atlas del Genoma del Cáncer. Esta pestaña se puede lograr fácilmente con el siguiente código.Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete R. Haga clic en ejecutar para cargar el paquete de R. Establecer directorio de trabajo.Elija el tipo de cáncer. Ejecute el código R desde el archivo GDCquery para descargar los datos. El archivo GDCquery se puede adquirir a partir de archivos/scripts complementarios.Después de la ejecución, los datos del recuento de secuenciación de ARN del colangiocarcinoma se pueden descargar y denominar CNT, donde las filas representan id de genes de conjunto y las columnas representan id. de símbolos. Tenga en cuenta los números en la posición 14 a 15 en los ID de símbolos. Los números van del 01 al 09 que indican tumores y del 10 al 19 indican tejidos normales.1.2.Conversación de id.ids de genes de conjunto a símbolos de genes. Importe el archivo de anotación en R, de acuerdo con su ruta de almacenamiento. El archivo de anotación se puede adquirir a partir de archivos complementarios.Ejecute el código R desde el archivo gtf v22. Que se puede adquirir a partir de archivos / scripts complementarios. Aplicar la función inn"y convertir los ID de genes del conjunto en símbolos de genes.1.3.Filtrar genes de baja expresada. Haga clic en ejecutar para instalar el paquete edgeR"Haga clic en ejecutar para cargar el paquete de R edgeR"Ejecute el código de R para mantener los genes con recuentos por millón de valores superiores a uno de al menos dos ejemplos. Dos. Análisis de expresión diferencial a través de limma"Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete de R limma"Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete de R limma"edgeR"Ejecute el siguiente código de R para crear una matriz de diseño.Extraer información del grupo. Establezca 01" como tejido tumoral. Establecer 11" como tejido normal.Crear matriz de diseño. Cree el objeto DGEList. Normalizar los datos.Ejecute el siguiente código de R para realizar el análisis de expresión diferencial basado en el método limma-trend. Calcule el valor de CPM. Haga clic en Ejecutar para ajustar un modelo lineal para predecir los datos o inferir la relación entre variables.Calcule el valor T, el valor F y las probabilidades logarítmos basadas en bayesiano. Extraiga la tabla de resultados. Los resultados del análisis de expresión diferencial se guardan en res_limma", que incluye el valor de cambio log2 fold.El nivel medio de expresión log2 del gen en el experimento. La estadística T modificada, el valor P, la tasa de descubrimiento falso corrigieron el valor p y las probabilidades logarítimas de genes expresados diferencialmente. Identificar los genes expresados diferencialmente.Por lo tanto, el valor ajustado de P menor que 0,05 y el valor absoluto del cambio falso logarítsi mayor o igual a dos son umbrales para examinar los genes expresados diferencialmente. Los resultados muestran que, en comparación con los tejidos normales, 1.443 genes están regulados al pie, y 1.880 genes están regulados a la baja en los tejidos del colangiocarcinoma. Genere la tabla de resultados en un archivo.Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete R ggplot2"Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete R ggplot2"Ejecute el código R desde el archivo volcano para crear el diagrama volcano y el volcán archivo volcano se puede adquirir desde archivos complementarios. Los genes se pueden mapear a diferentes posiciones de acuerdo con su cambio de pliegue log2 y valores de P ajustados. Por lo tanto, los genes expresados diferencialmente regulados al pie están coloreados en rojo.y los genes expresados diferencialmente regulados a la baja están coloreados en verde. Haga clic en exportar" para guardar la gráfica del volcán. Tres. Análisis de expresión diferencial a través de edgeR"Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete de R edgeR"Ejecute el siguiente código de R para crear una matriz de diseño.Haga clic en Ejecutar para crear el objeto DGEList y normalizar los datos. Haga clic en Ejecutar para estimar el valor de dispersión de la expresión génica. Haga clic en Ejecutar para ajustar el modelo y contar los datos.Realizar pruebas estadísticas. Extraiga la tabla de resultados. El resultado se guarda en res edgeR", que incluye el valor de cambio de pliegue de registro, logCPM, F, valor p y el valor p corregido de tasa de descubrimiento falso.Identificar los genes expresados diferencialmente. El resultado res edgeR"muestra que, en comparación con los tejidos normales, 3, 121 genes están regulados al pie y 1, 578 genes están regulados a la baja en los tejidos del colangiocarcinoma. Genere la tabla de resultados en un archivo.Crea la trama del volcán. Haga clic en exportar para guardar el gráfico del volcán. Cuatro. Análisis de expresión diferencial a través de DESeq2.Haga clic en Ejecutar para instalar el paquete de R DESeq2"Haga clic en Ejecutar para cargar el paquete de R DESeq2"Ejecute el siguiente código de R para determinar el factor de manoseo. Cree el objeto de conjunto de datos DESeq2. Realizar análisis.Genere la tabla de resultados. El resultado se guarda en res DESeq2, que incluye la media del recuento de lectura normalizado, el valor de cambio de pliegue de registro, la flecha estándar de cambio de pliegue de registro, la estadística de soldadura, el valor de P original y el valor de P corregido. Identificar DEGs.El resultado res DESeq2 muestra que, en comparación con los tejidos normales, dos mil novecientos treinta y ocho genes están regulados al pie, y mil seiscientos dieciséis genes están regulados a la baja en los tejidos del colangiocarcinoma. Genere la tabla de resultados en un archivo. Crea la trama del volcán.Haga clic en exportar para guardar el gráfico del volcán. Cinco. Diagrama de Venn. Haga clic en Ejecutar para instalar el diagrama de venn del paquete R.Haga clic en Ejecutar para cargar el diagrama de venn del paquete R. Haga un diagrama de Venn de genes expresados diferencialmente regulados al pie. Haga clic en exportar para guardar el diagrama de van, Hacer un diagrama de Venn de genes expresados diferencialmente regulados a la baja.Haga clic en exportar para guardar el diagrama de Venn. Seis. Resultados representativos. La figura uno muestra las gráficas de volcanes de todos los genes adquiridos por limma, edgeR y DESeq2.El valor negativo de log p se traza contra el cambio de pliegue de log. Los puntos rojos representan los genes expresados diferencialmente regulados hacia arriba, y los puntos verdes representan los genes expresados diferencialmente regulados hacia abajo. Limma identifica los mil ochocientos ochenta genes expresados diferencialmente regulados a la baja, y los mil cuatrocientos cuarenta y tres genes expresados diferencialmente regulados hacia arriba en los tejidos del colangiocarcinoma.EdgeR identifica los mil quinientos setenta y ocho genes expresados diferencialmente regulados a la baja, y tres mil ciento veintiún genes expresados diferencialmente regulados hacia arriba. DESeq2 identifica mil seiscientos dieciséis genes expresados diferencialmente regulados a la baja, y dos mil novecientos treinta y ocho genes expresados diferencialmente regulados hacia arriba. Figura dos, los diagramas de Venn muestran superposición entre los resultados de la división de limma edgeR y DESeq2.Compare los resultados de estos tres métodos, Mil cuatrocientos treinta y un genes expresados diferencialmente regulados hacia arriba, y mil quinientos treinta y un genes expresados diferencialmente regulados hacia abajo se superponen. Siete.Conclusión. En este protocolo, proporcionamos aquí un protocolo detallado de diferentes tipos de análisis de medidas para una secuencia alta de datos de recuento mediante el uso de paquetes R, limma, edgeR y DESeq2. Tres métodos tienen similares y personal entre su proceso de análisis.Y luego su de esos tres medicamentos se superpone en parte. Los tres medicamentos tienen sus propias ventajas. Y la elección solo depende del tiempo de sus datos.Si hay mis datos actuales, limma debe darse con prioridad, pero se prefieren los datos de secuenciación de generación, en edgeR y DESeq2.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

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RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

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