Name: Modelado de accidente cerebrovascular en ratones: lesiones corticales focales por fototrombosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprende a inducir lesiones corticales focales en ratones mediante fototrombosis con Rose Bengal e iluminación láser de 561 nm. Este modelo estandarizado permite estudiar mecanismos post-ictus con alta reproducibilidad y baja mortalidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a todos nuestros socios de colaboración de los Consorcios de Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) por sus sugerencias y discusiones. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania en el marco del Clúster de Munich para neurología de sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) y bajo las subvenciones LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 y LL-112/1-1.

Los experimentos reportados en este video se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices nacionales para el uso de animales de experimentación, y los protocolos fueron aprobados por los comités gubernamentales alemanes (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Los ratones utilizados en este estudio fueron ratones machos C57Bl / 6J, de 10-12 semanas de edad, y enviados por Charles River Germany. Los animales fueron alojados a temperaturas controladas (22 °C ± 2 °C), con un período de ciclo luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimentos granletados y agua ad libitum.
1. Preparación del material y los instrumentos
<ol><li>Disolver Rosa de Bengala en solución salina al 0,9% para alcanzar una concentración final de 10 mg/ml. Conecte la manta térmica para mantener caliente el área de operación y mantenga la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 ° C.</li>
	<li>Prepare tijeras, fórceps, trozos de algodón, ungüento ocular dexpantenol y material de sutura. Prepare una jeringa con solución salina (sin aguja) para mantener el área de operación hidratada. Preparar el gasestésicos (100% O2 + isoflurano).</li>
</ol>2. Preparación del animal
<ol><li>Inyecte analgesia 30 min antes de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).</li>
	<li>Registre el peso corporal del ratón para ajustar la dosis de rosa de bengala a inyectar (10 μL/ g, es decir, 100 μg / g).</li>
	<li>Coloque el ratón en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que se detenga el movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.</li>
	<li>Transfiera el ratón al marco estereotáctico y colóquelo en una posición prona con la nariz en la máscara de anestesia. Fije el animal y mantenga la concentración de isoflurano al 4% durante 1 min. Luego reduzca y mantenga la concentración de isoflurano en un 2%.</li>
	<li>Inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos. Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C.</li>
	<li>Aplique ungüento de dexpantenol para los ojos en ambos ojos y limpie la piel y el pelaje circundante con un agente desinfectante.</li>
</ol>3. Modelo de fototrombosis
<ol><li>Haga una incisión longitudinal de 2.0-2.5 cm y retraiga para exponer el cráneo. Realice la exposición del cráneo con un solo corte para evitar complicaciones en la herida.</li>
	<li>Retire el periostio suavemente con algodón e identifique las suturas coronales.</li>
	<li>Ponte las gafas protectoras, enciende el láser de 561 nm y marca el bregma +3 mm a la izquierda.</li>
	<li>Apague el láser, coloque una pegatina con un orificio de 4 mm de diámetro colocado en las coordenadas marcadas mencionadas anteriormente.</li>
	<li>Inyecte al ratón con rosa de Bengala (10 μL/g), por vía intraperitoneal. Coloque el rayo láser a 4-5 cm del cráneo, encienda el láser de 561 nm e ilumine el cráneo durante 20 minutos.</li>
	<li>Aplique dos gotas de solución salina al 0,9% en el cráneo para rehidratarse, suturar la herida y colocar al animal en una cámara de recuperación a 37 ° C para recuperarse de la anestesia. Después de 1 h, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.</li>
	<li>Inyecte analgesia cada 12 h durante 3 días después de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).</li>
</ol>4. Operación simulada
<ol><li>Llevar a cabo dos procedimientos diferentes de operaciones Simuladas como se describe en los pasos 4.1.1 y 4.1.2.<ol>
<li>Realice todos los procedimientos de forma idéntica a la operación descrita anteriormente. Inyecte Rose Bengal sin encender el láser. Después de 20 minutos bajo anestesia, permita que los animales permanezcan en la cámara de recuperación durante 1 h para recuperarse, antes de ser devueltos a sus jaulas.</li>
		<li>Realice todos los procedimientos de manera idéntica a la operación descrita anteriormente, encendiendo el láser. No se inyecte Rosa de Bengala. Después de 20 minutos de iluminación láser, permita que los animales permanezcan en la cámara de recuperación durante 1 h para recuperarse de la anestesia, antes de ser devueltos a sus jaulas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Manchas láser
<ol><li>Conecte la manta calentada para mantener caliente el área de operación y mantenga la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 ° C.</li>
	<li>Coloque el ratón en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que se detenga el movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas y luego transfiera el ratón al marco estereotáctico.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición prona con la nariz en la máscara de anestesia. Fijar el animal y mantener la concentración de isoflurano al 4% durante 1 min. T gallina reducirla y mantenerla en el 2%.</li>
	<li>Inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos. Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 ° C y aplique ungüento ocular dexpantenol en ambos ojos. Limpie la piel y el pelaje circundante con un agente desinfectante.</li>
	<li>Haga una incisión longitudinal de 2.0-2.5 cm y retraiga para exponer el cráneo. Realice la exposición del cráneo con un solo corte para evitar complicaciones en la herida.</li>
	<li>Coloque el marco estenotáctico debajo de la mancha láser y ajuste la altura para obtener una imagen nítida. Enfoque la cámara de imágenes de perfusión moteada con láser (LSI) en la ventana craneal. Configure el sistema de cámara de imágenes de manchas láser (LSI) de alta resolución como se describió anteriormente15.</li>
	<li>Adquiera datos de un campo de visión de 1 cm x 1 cm utilizando una longitud de onda de 785 nm y láseres de 80 mW con una velocidad de fotogramas de 21 imágenes/s a una distancia de trabajo de 1 cm durante 1 min.</li>
	<li>Después de la imagen, aplique dos gotas de solución salina al 0,9% en el cráneo para rehidratarse, suturar la herida y colocar al animal en una cámara de recuperación a 37 ° C para recuperarse de la anestesia durante 1 h. Después de 1 h, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.</li>
</ol>6. Neuropuntuación
NOTA: Para el análisis del déficit neurológico, se utiliza una escala neurológica modificada publicada por Eckenstein et al. en 199715.
<ol><li>Puntuar a los animales por déficits generales (Tabla 1) y focales (Tabla 2). Esta escala compuesta oscila entre 0 (sin déficits) y 46 (deficiencias graves).</li>
	<li>Realice el neuropuntuación a la misma hora todos los días y use ropa quirúrgica para mantener un olor neutro.</li>
	<li>Habitúe a los ratones durante 30 minutos en la habitación con una jaula abierta antes de la prueba y permítales observar cada elemento durante 30 s.</li>
</ol>7. Perfusión
<ol><li>Prepare una jeringa de 20 ml que contenga PBS-heparina (2 U/ml) y colóquela 1 m por encima del banco para facilitar/asegurar la perfusión impulsada por la gravedad.</li>
	<li>Inyecte por vía intraperitoneal 100 μL de ketamina y xilazina (120/16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Espere 5 minutos y corrobore el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.</li>
	<li>Fijar al animal en posición supina y desinfectar la superficie corporal abdominal con etanol al 100%. Haga una incisión de 3 cm de largo en el abdomen; cortar el diafragma y las costillas para visualizar completamente el corazón.</li>
	<li>Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha e inserte la cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo y perfunda con 20 ml de PBS-heparina.</li>
	<li>Después de la perfusión, decapitar al animal y extraer el cerebro, congelarlo con hielo seco y almacenarlos a -80 ° C hasta su uso posterior.</li>
</ol>8. Volumetría de infarto
<ol><li>Crioseccionación: Cortar el cerebro en serie en un criostato a secciones de 20 μm de espesor cada 120 μm y montar en diapositivas. Guarde las diapositivas a -80 °C hasta su posterior procesamiento.</li>
	<li>Tinción de violeta cresil (CV)<ol>
<li>Para preparar la solución de tinción, mezcle 0,5 g de acetato CV en 500 ml de H2O. Revuelva y caliente (60 °C) hasta que los cristales se disuelvan. Deje que la solución se enfríe y guárdelo en una botella oscura. Vuelva a calentar a 60 °C y filtre (filtro de papel) antes de cada uso.</li>
		<li>Secar los toboganes a temperatura ambiente durante 30 min. Colóquelos en etanol al 95% durante 15 minutos, seguido de etanol al 70% durante 1 minuto, y luego en etanol al 50% durante 1 minuto.</li>
		<li>Coloque los toboganes en agua destilada durante 2 minutos, refresque el agua destilada y vuelva a colocar los toboganes en agua durante 1 minuto. Luego, coloque las diapositivas en la solución de tinción precalentada durante 10 minutos a 60 ° C. Lave los toboganes dos veces en agua destilada durante 1 min.</li>
		<li>Coloque las diapositivas en etanol al 95% durante 2 min. Luego colóquelos en etanol al 100% durante 5 minutos, refresque el etanol al 100% y coloque las diapositivas en etanol al 100% nuevamente durante 2 minutos. Después, cubra las diapositivas con un medio de montaje.</li>
		<li>Análisis: Escanear las diapositivas y analizar el volumen del infarto indirecto por el método de Swanson16 para corregir el edema: Área isquémica = (región isquémica)-((hemisferio ipsilateral) - (hemisferio contralateral)).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Tinción tunel (kit de detecciónde apoptosis in situ)
<ol><li>Secar los portaobjetos, post-fijar en paraformaldehído al 4% en PBS (ph 7.4) durante 10-20 min en RT. Lavar en PBS, post-fijar en etanol preenfriado: ácido acético 2:1 durante 5 min a -20 °C.</li>
	<li>Lavar en PBS y aplicar tampón de equilibrio (10 s a un máximo de 60 min en RT) y aplicar la enzima TdT de fuerza de trabajo (1 h a 37 °C en cámara humidificada)</li>
	<li>Aplique la enzima de parada/ lavado de fuerza de trabajo (10 min a RT), lave en PBS y aplique conjugado anti-digoxigenina de fuerza de trabajo calentada (RT) (30 min a RT en la oscuridad)</li>
	<li>Lavar en PBS, incubar con DAPI durante 5 min en RT y montar los portaobjetos con medios fluoromontables.</li>
</ol>

<ol><li>GBD 2016 Causes of Death Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+age-sex+specific+mortality+for+264+causes+of+death%2C+1980-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%3A+The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+Neuro+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).</li>
<li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation%3A+effect+of+aspirin+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li>
<li>Bergeron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+photochemical+cortical+lesions+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inducing photochemical cortical lesions in rat brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+ischemia+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model.</a> Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).</li>
<li>Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+cerebral+infarction.+I.+Early+microvascular+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations.</a> Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).</li>
<li>Labat-gest, V., Tomasi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombotic+ischemia%3A+a+minimally+invasive+and+reproducible+photochemical+cortical+lesion+model+for+mouse+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370(2013).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journals+unite+for+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Journals unite for reproducibility.</a> Science. 346 (6210), 679(2014).</li>
<li>Llovera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+preclinical+randomized+controlled+multicenter+trial+%28pRCT%29%3A+Anti-CD49d+treatment+for+acute+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulating+multicentre+clinical+stroke+trials%3A+a+new+paradigm+for+studying+novel+interventions+in+experimental+models+of+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%3A+Official+Journal+of+the+INternational+Stroke+Society%22%5BJournal%5D)">Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke.</a> International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+The+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+%26+Pharmacotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).</li>
<li>Llovera, G., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+step+in+translational+research%3A+lessons+learned+from+the+first+preclinical+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial.</a> Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).</li>
<li>Gnyawali, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retooling+laser+speckle+contrast+analysis+algorithm+to+enhance+non-invasive+high+resolution+laser+speckle+functional+imaging+of+cutaneous+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation.</a> Scientific Reports. 7, 41048(2017).</li>
<li>Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+differences+in+the+early+detection+of+breast+cancer+in+metropolitan+Detroit%2C+1978+to+1987%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987.</a> Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423(2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).</li>
<li>Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).</li>
<li>Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice%3A+permanent+coagulation+of+the+distal+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729(2014).</li>
<li>Cramer, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+widefield+calcium+imaging+of+the+mouse+cortex+for+analysis+of+network+connectivity+in+health+and+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease.</a> Neuroimage. 199, 570-584 (2019).</li>
<li>Heindl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+morphological+analysis+of+microglia+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Automated morphological analysis of microglia after stroke.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).</li>
<li>Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-function+injectable+angiogenic+biomaterial+for+the+repair+of+brain+tissue+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke.</a> Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).</li>
<li>Rust, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo-A+targeted+therapy+promotes+vascular+repair+and+functional+recovery+following+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).</li>
<li>Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).</li>
<li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+%28Mus+musculus%29+after+a+focal+motor+cortex+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).</li>
<li>Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonocclusion+and+spontaneous+recanalization+rates+in+acute+ischemic+stroke%3A+a+review+of+cerebral+angiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies.</a> Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).</li>
<li>Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardware+and+methodology+for+targeting+single+brain+arterioles+for+photothrombotic+stroke+on+an+upright+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope.</a> Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

El protocolo presentado describe el modelo experimental de accidente cerebrovascular de fototrombosis iluminando el cráneo intacto con un láser de 561 nm, con una inyección intraperitoneal previa de Rosa de Bengala. Hasta hace poco, el uso de este modelo ha sido bajo, pero está aumentando constantemente.
La mortalidad durante la inducción del accidente cerebrovascular en este modelo está ausente. La mortalidad global de menos del 5% surge durante la operación debido a complicaciones anestesiol...

El accidente cerebrovascular isquémico sigue siendo una de las principales causas de muerte y discapacidad adulta adquirida en los paísesdesarrollados en el siglo XXI, lo que representa aproximadamente 2,7 millones de muertes en 2017 en todo el mundo1. Incluso con los inmensos esfuerzos de la comunidad científica, hay pocos tratamientos disponibles. Además, con criterios de exclusión tan altos, estas opciones ya limitadas no son accesibles para muchos pacientes, lo que resulta en una necesidad urgente de nuevos tratamientos para mejorar la recuperación funcional después del accidente cerebrovascular.
Teniendo en cuenta la incapacidad de los modelos in vitro para replicar las complejas interacciones del cerebro, los modelos animales son esenciales para la investigación preclínica del accidente cerebrovascular. Los ratones son el modelo animal más utilizado en el campo de la investigación del accidente cerebrovascular. La mayoría de estos modelos de ratón tienen como objetivo inducir infartos bloqueando el flujo sanguíneo dentro de la arteria cerebral media (AME), ya que la mayoría de las lesiones de accidente cerebrovascular humano se encuentran en el territorio de la AQM2. Aunque estos modelos recapitulan mejor las lesiones de accidente cerebrovascular humano, implican cirugías convulsas con alta variabilidad del volumen del infarto.
Desde la propuesta de Rosenblum y El-Sabban del modelo fototrombótico en 19773,y más tarde la aplicación de este modelo a ratas Watson et al.4,se ha utilizado ampliamente en la investigación del accidente cerebrovascular isquémico5,6. El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico induce un infarto cortical local y definido como resultado de la fotoactivación de un tinte sensible a la luz previamente inyectado en el flujo sanguíneo. Esto causa trombosis local de los vasos en las áreas expuestas a la luz. Brevemente, tras la exposición a la luz del tinte fotosensible inyectado, se induce una lesión oxidativa localizada de la membrana celular endotelial, lo que lleva a la agregación plaquetaria y la formación de trombos, seguida de una interrupción local del flujo sanguíneo cerebral7.
La principal ventaja de esta técnica reside en su simplicidad de ejecución y la posibilidad de dirigir la lesión a la región deseada. A diferencia de otros modelos experimentales de accidente cerebrovascular, se necesita experiencia quirúrgica menor para realizar el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico a medida que la lesión se induce a través de la iluminación del cráneo intacto. Además, los bordes bien delimitados(Figura 2A y Figura 5B)y la flexibilidad para inducir la lesión a una región específica del cerebro pueden facilitar el estudio de las respuestas celulares dentro del área cortical isquémica o intacta8. Por estas razones, este enfoque es adecuado para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la plasticidad cortical.
En las últimas décadas, la creciente preocupación por la falta de reproducibilidad entre los grupos de investigación se ha acuñado como la llamada crisis de replicación9. Después de la coordinación del primer estudio preclínico aleatorizado controlado multicéntrico en 201510,una herramienta propuesta para mejorar la investigación preclínica11 , 12,13, se confirmó que una causa de falla en la reproducibilidad entre los estudios preclínicos de laboratorios independientes fue la falta de estandarización suficiente de los modelos experimentales de accidente cerebrovascular y los parámetros de resultado14. En consecuencia, cuando se estableció el consorcio ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), una colaboración que tiene como objetivo comprender las interacciones cerebro-inmune subyacentes a los principios mecanicistas de la recuperación del accidente cerebrovascular, la estandarización de todos los modelos experimentales de accidente cerebrovascular entre cada grupo de investigación fue esencial.
Aquí se describe el procedimiento estandarizado para la inducción del modelo fototrombótico utilizado en el consorcio de investigación mencionado anteriormente. Brevemente, un animal se sometió a anestésicos, recibió una inyección de rosa de Bengala (10 μL / g) por vía intraperitonal, y el cráneo intacto, a 3 mm que quedaba de bregma, fue iluminado inmediatamente por un láser de 561 nm durante 20 minutos(Figura 1). Además, se informa un método histológico y conductual relacionado para analizar el resultado del accidente cerebrovascular en este modelo. Todos los métodos se basan en procedimientos operativos estándar desarrollados y utilizados en el laboratorio.

<table><tbody><tr><td>Láser de longitud de onda de 561 nm</td><td>Solna</td><td>Cobolt HS-03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma Life Science</td><td></td> 695092 <td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para isoflurano</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Peroxidasa Kit de detección de apoptosis in situ Millipore</td><td></td><td>S7100</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Bepanthen Bayer</td><td></td><td>1578681</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J ratones</td><td>Charles River 000664</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colímetro</td><td>Thorlabs</td><td>F240APC-A</td><td></td></tr><tr><td>Cotons</td><td>NOBA Verbondmitel Danz 974116</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violeta</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Macherey-Nagel</td><td>432018</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>Manta calefactora</td><td>FHC DC Temperature Controller</td><td>&nbsp; 40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Speckle</td><td>Perimed PeriCam</td><td>PSI HR</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Mayor</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato PH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Gafas de protección</td><td>Laser 2000</td><td>NIR-ZS2-38</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>198250-5G</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit medio de montaje</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáctico</td><td>Stoelting</td><td>51500U</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Guías</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Xilacine</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelado de accidente cerebrovascular en ratones: lesiones corticales focales por fototrombosis

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad adulta adquirida en los países desarrollados. A pesar de la extensa investigación de nuevas estrategias terapéuticas, sigue habiendo opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con accidente cerebrovascular. Por lo tanto, se necesita más investigación para las vías fisiopatológicas como la inflamación posterior al accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Dada la incapacidad de los modelos in vitro para reproducir la complejidad del cerebro, los modelos experimentales de accidente cerebrovascular son esenciales para el análisis y la posterior evaluación de nuevos objetivos farmacológicos para estos mecanismos. Además, se necesitan urgentemente modelos estandarizados detallados para todos los procedimientos a fin de superar la llamada crisis de replicación. Como un esfuerzo dentro del consorcio de investigación ImmunoStroke, se describe un modelo de ratón fototrombótico estandarizado que utiliza una inyección intraperitoneal de Rose Bengal y la iluminación del cráneo intacto con un láser de 561 nm. Este modelo permite la realización de ictus en ratones con asignación a cualquier región cortical del cerebro sin cirugía invasiva; por lo tanto, permitiendo el estudio del accidente cerebrovascular en diversas áreas del cerebro. En este video, se demuestran los métodos quirúrgicos de inducción del accidente cerebrovascular en el modelo fototrombótico junto con el análisis histológico.

El modelo descrito aquí es un modelo de trazo fototrombótico por inyección de Rose Bengal e iluminación intacta del cráneo durante 20 min, a una longitud de onda constante de 561 nm y una potencia de salida de 25 mW en la fibra. Aunque la cirugía fototrombótica completa dura 30 min, el animal se mantiene bajo anestesia baja y el daño cerebral es moderado. Aproximadamente 10 minutos después de la transferencia a sus jaulas, todos los animales estaban despiertos, moviéndose libremente en la jaula e interactuando con sus co...

Aquí se describe el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico, donde se produce un accidente cerebrovascular a través del cráneo intacto mediante la inducción de la oclusión microvascular permanente utilizando iluminación láser después de la administración de un tinte fotosensible.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones: lesiones corticales focales por fototrombosis

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

El enfoque del modelo de accidente cerebrovascular de fototrombosis puede ser adecuado para estudios celulares y moleculares de plasticidad cortical debido a los bordes limitados y la flexibilidad para inducir lesiones en diferentes áreas de la corteza. Tres ventajas principales distinguen el modelo de fototrombosis de otros modelos de accidente cerebrovascular, la posibilidad de dirigir la lesión a la región deseada, su alta reproducibilidad y baja mortalidad. La dosificación adecuada de rosa de bengala es fundamental para el éxito y la estabilidad del modelo.Los resultados dependen de especificaciones técnicas como la potencia del láser, el tiempo de aplicación cruzada y el chelín óptico de la corteza no afectada. Comience disolviendo la rosa de bengala en una solución salina al 0,9% para una concentración final de 10 miligramos por mililitro. Esterilice meticulosamente todos los instrumentos con un esterilizador de plomo caliente y desinfecte todas las superficies antes y después de la cirugía con un aerosol desinfectante microbiano.Prepare una jeringa llena de solución salina para mantener el área de operación hidratada y prepare el gas de anestesia. Mida el peso corporal del ratón para ajustar la dosis de rosa de bengala a inyectar. Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón.Una vez que el ratón esté completamente anestesiado y fijado en el marco estereotáctico, inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura corporal del ratón durante todo el procedimiento quirúrgico. Aplique el ungüento ocular de pantenol Dex en ambos ojos y limpie la piel y el pelaje circundante con un agente desinfectante. Use tijeras para hacer una sola incisión longitudinal de dos a dos centímetros y medio y retraiga para exponer el cráneo.Use algodón para quitar suavemente el periostio y localizar las suturas coronales. Use gafas protectoras mientras enciende el láser de 561 nanómetros y marque los más de tres milímetros a la izquierda, luego apague el láser y enganche la pegatina con un orificio de cuatro milímetros de diámetro en las coordenadas marcadas. Inyecte el ratón intraparietal con rosa de bengala.Coloque el rayo láser a una distancia de cuatro a cinco centímetros del cráneo. Encienda el láser e ilumine el cráneo durante 20 minutos. Rehidrata el cráneo aplicando dos gotas de solución salina al 0,9%.Después de suturar la herida, coloque el ratón en una cámara de recuperación a 37 grados centígrados para recuperarse de la anestesia. Después de una hora, coloque el ratón de nuevo en la jaula en una habitación con temperatura controlada. La tinción violeta cristalina a las secciones cerebrales coronales seriadas se utilizó para el análisis de entrada de volumen de infarto después de 24 horas de la inducción del accidente cerebrovascular.La variabilidad de este modelo de accidente cerebrovascular fue baja, y el volumen medio de infarto fue de 29,3 milímetros cúbicos, lo que representa el 23% del hemisferio cerebral. La lesión de fototrombosis causó un deterioro motor sensorial moderado y a largo plazo indicado por la puntuación neuro compuesta. Los animales con accidente cerebrovascular tuvieron un cambio significativo en la puntuación neuro 24 horas después de la cirugía.A pesar de que las diferencias persistieron, los ratones con accidente cerebrovascular mejoraron con el tiempo. En los ratones sometidos a la rosa de bengala más iluminación, el peso corporal y la temperatura corporal disminuyeron 24 horas después de la cirugía. Sin embargo, dentro de los tres días posteriores a la cirugía, se observó recuperación.Los cambios isquémicos se confirmaron mediante imágenes láser. Los resultados indicaron que la rosa de bengala o la iluminación láser por sí sola no produjeron una lesión, mientras que la aplicación simultánea de ambas generó un área redonda hipoperfundida rodeada por la estrecha zona oligomérica. La tinción violeta de cristal y túnel para la evaluación del volumen del infarto 24 horas después de la cirugía no reveló daño tisular ni en las cirugías de rosa de bengala ni en las de iluminación láser.Por otro lado, la rosa de bengala más la iluminación láser generaron una lesión bien demarcada. Es importante medir el peso corporal del animal para ajustar la inyección de rosa de bengala. La condición correcta de los conmutadores forenses es importante para inducir una lesión consistente entre los animales.Dado que este protocolo deja el cráneo intacto e incluso se puede realizar a través de ventanas craneales, se puede combinar con imágenes in vivo de campo amplio o multi fotones.

modeling-stroke-in-mice-focal-cortical-lesions-by-photothrombosis

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra el procedimiento para generar un accidente cerebrovascular fototrombótico en un modelo de ratón mediante la iluminación láser de un cráneo intacto después de la administración de un tinte fotosensible.

Modelado de accidente cerebrovascular fototrombótico en modelo de ratón: una técnica de iluminación láser a través del cráneo de ratón después de la administración de un tinte fotosensible para inducir fototrombosis

Photothrombosis es una técnica rápida, mínimamente invasivo para la inducción de infarto pequeño y bien delimitado en áreas de interés de una manera altamente reproducible. Es especialmente adecuado para el estudio de las respuestas celulares y moleculares que subyacen a la plasticidad cerebral en ratones transgénicos.

Isquemia photothrombotic: Un modelo de lesión cortical fotoquímico mínimamente invasiva y reproducible de Estudios Carrera Ratón

Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Aquí, describimos un enfoque de microscopía óptica semi-invasiva para la inducción de un coágulo fototrombótico de Bengala Rosa en la corteza somatosensorial de un ratón in vivo.  Se describen los aspectos técnicos del procedimiento de imagen, desde la inducción de un evento fototrombótico hasta la aplicación y la recopilación de datos.

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

La fototrombosis es un procedimiento mínimamente invasivo y altamente reproducible para inducir isquemia focal en la médula espinal y sirve como modelo de lesión de la médula espinal en ratones.

Photothrombosis inducida por isquemia focal como un modelo de lesión de médula espinal en ratones

Este manuscrito describe una técnica de modelado de infarto capsular. Aquí hemos utilizado una técnica photothrombotic modificado con baja intensidad de la luz después de la cartografía de destino antes de la cirugía. Usando esta técnica, hemos creado un modelo de infarto capsular circunscrita con deficiencia motora persistente.

Circunscrita capsular del infarto de modelado mediante técnica photothrombotic

Los modelos tradicionales de ictus fototrombótico (SPT) inducen principalmente agregados plaquetarios densos de alta resistencia al tratamiento lítico con activadores tisulares del plasminógeno (tPA). Aquí se introduce un modelo de PTS murino modificado mediante la coinyección de trombina y colorante fotosensible para la fotoactivación. El modelo de SPT potenciado con trombina produce coágulos mixtos de plaquetas:fibrina y es muy sensible a la trombólisis tPA.

Un modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico enriquecido con fibrina y sensible al tPA

Diferentes modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) se utilizan en la investigación experimental del accidente cerebrovascular. Aquí, se describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular de MCAo transitorio a través de la arteria carótida externa (ECA), que tiene como objetivo imitar el accidente cerebrovascular humano, en el que el trombo cerebrovascular se elimina debido a la lisis o terapia espontánea del coágulo.

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

Utilizando un enfoque totalmente óptico, se induce un accidente cerebrovascular isquémico mientras se registra simultáneamente la actividad neuronal de Ca2+ utilizando un biosensor fluorescente en el núcleo de accidente cerebrovascular emergente de un ratón despierto y que se comporta.

Fototrombosis y fotometría de fibra simultáneas para inducir y monitorear el accidente cerebrovascular isquémico en ratones que se comportan

Este protocolo proporciona un método integrado que incluye la administración viral, la implantación de optrode, la inducción fototrombótica, el registro simultáneo de la actividad de astrocitos y neuronales, y la estimulación optogenética de los astrocitos. Este método integrado tiene como objetivo proporcionar una investigación simultánea de la relación astrocito-neurona a lo largo de las etapas agudas a crónicas del ictus isquémico.

Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Aprende a inducir lesiones corticales focales en ratones mediante fototrombosis con Rose Bengal e iluminación láser de 561 nm. Este modelo estandarizado permite estudiar mecanismos post-ictus con alta reproducibilidad y baja mortalidad.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones: lesiones corticales focales por fototrombosis

Explorar más videos