Name: Captación de pequeñas vesículas extracelulares con marca fluorescente in vitro y en la médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a marcar vesículas extracelulares pequeñas con PKH y rastrear su captación in vitro y en médula espinal mediante inyección intratecal. Este protocolo permite estudiar su potencial terapéutico en trastornos espinales.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones de NIH NINDS R01NS102836 y el Departamento de Salud de Pensilvania Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) otorgado a Seena K. Ajit. Agradecemos al Dr. Bradley Nash por la lectura crítica del manuscrito.

NOTA: Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. Se utilizaron ratones CD-1 preñados en el tiempo para el cultivo astrocítico, y todas las presas se recibieron 15 días después de la impregnación. Se utilizaron ratones C57BL/6 de diez o doce semanas de edad para experimentos de captación in vivo.
1. Aislamiento de sEV de células macrófagos RAW 264.7
<ol><li>Cultivo de células RAW 264,7 en matraces de 75 cm2 en medio agotado de exosomas DMEM que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) agotado de exosomas y un 1% de penicilina-estreptomicina (pen-strep) durante 24-48 h.</li>
	<li>Recoger 300 ml de medio acondicionado y centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante y la centrífuga a 2.000 × g durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a los tubos de la centrífuga, centrífuga durante 35 min a 12.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante y filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.</li>
	<li>Transferir a tubos de ultracentrífuga y centrífuga durante 80 min a 110.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Guarde el sobrenadante (medio agotado con exosomas), resuspante el pellet en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y centrífuga durante 1 h a 110.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 100 μL de PBS para su posterior caracterización utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o en el tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) para western blotting.</li>
</ol>2. Caracterización de los sEVs
<ol><li>Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) NOTA: La distribución del tamaño y el número de partículas/ concentración de los sEV purificados de las células RAW 264.7 se midieron mediante NTA.<ol>
<li>Diluya los sEV en PBS filtrados para obtener 20-60 vesículas por campo de visión para un seguimiento óptimo.</li>
		<li>Introduzca la muestra diluida en una celda de flujo utilizando una bomba de jeringa con un caudal constante.</li>
		<li>Toma 3-5 videos de 30 s cada uno. Establezca la velocidad de obturación y la ganancia, y enfoque manualmente la configuración de la cámara para que el número máximo de vesículas sea visible y pueda rastrearse y analizarse.</li>
		<li>Avance las muestras entre cada grabación para realizar mediciones replicadas. Optimice la configuración posterior a la adquisición de NTA y mantenga la configuración constante entre las muestras.</li>
		<li>Analice cada video utilizando el software NTA para obtener el tamaño promedio y la concentración de las vesículas.</li>
		<li>Realice todas las mediciones de NTA con la misma configuración del sistema para mayor consistencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Mancha occidental<ol>
<li>Cuantifique las cantidades totales de proteínas en sEV, lisatos celulares y medios agotados por exosomas utilizando un kit de ensayo de proteínas siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Para la preparación de lisato celular, culta las células RAW 264.7 en matraces de 75 cm2 hasta un 80-90% de confluencia. Separe las células con tripsina al 0,25% durante 10-15 min, neutralice la tripsina con medios de cultivo y glet las células girando a 400 × g durante 5 min. Resuspend las células en medio de crecimiento fresco.</li>
		<li>Cuente las células usando un hemocitómetro y transfiera 1 × 106 células a otro tubo. Lave las células con PBS dos veces utilizando las mismas condiciones de centrifugación que las anteriores y agregue 50 μL de tampón de lisis (tampón RIPA con cóctel inhibidor de proteasa agregado) al pellet celular desde el giro final.</li>
		<li>Vórtice las células y manténgalas en hielo durante 20 minutos. Someta la mezcla a centrifugación a 10.000 × g durante 30 min a 4 °C, recoja el sobrenadante (es decir, el lisato) en tubos de microcentrífuga frescos y manténgalo a -80 °C hasta su uso.</li>
		<li>Concentre 2 ml de medios agotados por exosomas a 100 μL utilizando filtros centrífugos de corte de 3 kDa antes de cuantificar la cantidad de proteína. Mezcle los sEV con tampón de lisis en una proporción de 1: 1, vórtice durante 30 s e incube en hielo durante 15 minutos para cuantificar la cantidad de proteína.</li>
		<li>Mezcle cantidades iguales de proteína (2 μg) de los sEV, lisato de células RAW 264.7 y medios agotados por exosomas con tampón de muestra reductor.</li>
		<li>Desnaturaliza las muestras a 95 °C durante 5 min, manténgalas en hielo durante 5 min y gire durante 2 min a 10.000 × g. Cargue las muestras en un gel de proteína Tris-glicina al 12% y ejecute el gel a 125 V durante 45 min.</li>
		<li>Transfiera la proteína a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a 25 V durante 2 h.</li>
		<li>Después de la transferencia, bloquee las membranas de PVDF con tampón de bloqueo (consulte la Tabla de materiales)durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar la mancha con anticuerpos primarios en un agitador durante la noche a 4 °C. NOTA: Los anticuerpos primarios utilizados fueron la proteína X (Alix) anti-CD81 (1:1.000), la proteína X (Alix) anti-alfa-1,3/1,6-manosiltransferasa (ALG-2) (1:1.000), la anti-calexina (1:1.000) y la antigliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (1:1.000).</li>
		<li>Lave las manchas 3 x 15 min con 1x solución salina tamponada tris, 0,1% Tween 20 (TBST), e incube a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados igG-rábano de cabra IgG-rábano (HRP)- o burro anti-conejo IgG-HRP conjugados (1:10.000) durante 1 h en la coctelera.</li>
		<li>Lave las manchas 3 x 15 min con 1x TBST y detecte las proteínas utilizando un sustrato HRP.</li>
		<li>Analice las manchas mediante quimioluminescencia mejorada utilizando un imager de western blot.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)<ol>
<li>Corregir los sEV resuspendiéndolos en paraformaldehído al 2% (PFA) en tampón de fosfato (PB) de 0,1 M; vórtice para 2 x 15 s.</li>
		<li>Coloque una gota de 10 μL de suspensión sEV sobre parafilm limpio. Flote la rejilla formvar recubierta de carbono en la gota con su lado recubierto frente a la suspensión. Deje que las membranas se absorban durante 20 min en un ambiente seco.</li>
		<li>Coloque las rejillas (lado de la membrana hacia abajo) sobre una gota de PB para lavar durante 3 x 2 min.</li>
		<li>Transfiera las rejillas a 50 μL de glutaraldehído al 1% durante 5 min.</li>
		<li>Lavar las rejillas con 100 μL de agua destilada durante 8 x 2 min.</li>
		<li>Contraste la muestra colocando las rejillas en una gota de acetato de uranilo al 1% durante 2 min.</li>
		<li>Incrustale la muestra con 50 μL de acetato de uranilo al 0,2% con solución de metilcelulosa al 2% durante 10 min en una placa de hielo cubierta de parapelícula.</li>
		<li>Use bucles de acero inoxidable para sostener las rejillas y eliminar el exceso de líquido con papel de filtro.</li>
		<li>Seque al aire la rejilla durante 10 minutos mientras aún está en el bucle.</li>
		<li>Observar bajo un microscopio electrónico de transmisión a 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Etiquetado de los sEV
<ol><li>Diluir 20 μg de sEV en 1 ml de tampón de diluyente o el mismo volumen de PBS en 1 ml de tampón de diluyente para el control de colorantes.</li>
	<li>Diluir 3 μL de colorante PKH67 o PKH26 en 1 ml de tampón diluyente y mezclar mediante pipeteo.</li>
	<li>Agregue el tinte PKH diluido a los sEV diluidos y mezcle mediante pipeteo. Incubar durante 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Para un control de tinte, mezcle el tinte diluido con PBS diluido del paso 3.1.</li>
	<li>Agregue 2 ml de albúmina sérica bovina al 1% (BSA) en PBS al tubo con el tinte y la mezcla sEV y al tubo de control del tinte para absorber el exceso de tinte.</li>
	<li>Centrifugadora durante 1 h a 110.000 × g a 4 °C. Deseche el sobrenadante, vuelva a colocar el pellet en 2 ml de PBS y centrífuga durante 1 h a 110.000 × g a 4 °C. Repita el lavado con PBS y vuelva a utilizar los sEV etiquetados o el control de tinte en un volumen igual de PBS.</li>
	<li>Cuantificar la cantidad de proteína total por el método de Bradford.</li>
</ol>4. Captación de sEV por las células Neuro-2a
<ol><li>Coloque las cubiertas de 18 mm en una placa de 12 pozos y la placa 10 × 104 células Neuro-2a en cada pozo en un total de 1 ml de medio DMEM completo que contenga 10% de FBS y 1% de estreptococo de pluma.</li>
	<li>Cambie el medio a medio agotado por exosomas DMEM cuando la confluencia celular sea del 80-90%. Agregue 1, 5 o 10 μg de sEV etiquetados en cada pozo durante 1, 4 y 24 h para la absorción dependiente de la dosis y el tiempo, o agregue un volumen igual de control del tinte.</li>
</ol>5. Cultivos astrocíticos primarios
<ol><li>Anestesiar a 4 cachorros postnatales 4 días después del nacimiento induciendo hipotermia.</li>
	<li>Recoja los cerebros en una placa de Petri de 60 mm que contenga solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) helada suplementada con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico (HEPES) de 10 mM.</li>
	<li>Diseccionar ambos lóbulos corticales y retirar las meninges. Picar los pañuelos con una cuchilla esterilizada.</li>
	<li>Transfiera los tejidos a un tubo cónico de 15 ml que contenga tampón de disociación de papaína/desoxirribonucleasa I e incube durante 20 min a 37 °C. Remolino cada 5 min. NOTA: Para 4 cortezas de ratón, 9 ml de papaína de 7,5 U/ml en HBSS se activan a 37 °C durante al menos 30 min, se filtran a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y se mezclan con desoxirribonucleasa I a una concentración final de 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y agregue 5 ml de DMEM completo para inactivar la actividad enzimática. Triturar cuidadosamente para disociar los tejidos con una pipeta serológica de vidrio de 5 ml y una pipeta Pasteur pulida al fuego.</li>
	<li>Pasar la suspensión celular a través de un colador celular de 40 μm y centrifugar las células a 250 × g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el medio y sembrar las células en 10 mL de DMEM completo en un matraz de 75 cm2. Reemplace el medio sobrenadante con 15 ml de medio DMEM fresco 4 h después del emplatado.</li>
	<li>Después de 14 días in vitro,transfiera el matraz a un agitador orbitario para separar la microglía y los oligodendrocitos a 320 rpm durante 6 h.</li>
	<li>Tripsinizar los astrocitos restantes utilizando 5 ml de la enzima de disociación celular(Tabla de materiales)durante 10 min a 37 °C. Añadir 5 ml de DMEM completo para inactivar la acción enzimática y gletizar las células a 250 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspend las células en DMEM completo. Semilla 5 × 104 celdas en fundas de 12 mm #1.5 en una placa de 24 pozos.</li>
</ol>6. Captación de sEV por astrocitos
<ol><li>Cuando los astrocitos alcancen el 80-90% de confluencia, cambie el medio a medio agotado por exosoma DMEM.</li>
	<li>Agregue 1 μg de sEV etiquetados y etiquetados, un volumen igual de control de colorantes o PBS a las células. Utilice las células para la tinción 1 h y 24 h después del tratamiento con sEV.</li>
</ol>7. Inmunofluorescencia
<ol><li>Enjuague las células con PBS 3x y corríjalas con 4% de PFA en PB durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las células fijas 3 x 5 min con PB y permeabilizarlas usando 0.1% Triton X-100 en PB durante 10-15 min y lavar con PB 3 x 5 min.</li>
	<li>Bloquee las células con suero de cabra normal (NGS) al 5% en PB durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las células con anticuerpos primarios: proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2A, 1:500) para células Neuro-2a o proteína ácida fibrilar glial (GFAP, 1:500) para astrocitos primarios en NGS/PB fresco al 5% durante la noche a 4 °C con agitación suave.</li>
	<li>Lavar 3 x 10 min con PB y añadir anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; o Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) en NGS al 5% e incubar durante 2 h a temperatura ambiente en un balancín.</li>
	<li>Lavar 3 x 10 min con PB e incubar con 1 μg/mL de tinción nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min a temperatura ambiente. Lave las células de nuevo 3 veces con PB.</li>
	<li>Monte los cubrecubos en las diapositivas #1 utilizando un medio de montaje antifade. Déjelos secar durante la noche en la oscuridad y guarde los portaobjetos de vidrio preparados a 4 ° C hasta obtener imágenes en un microscopio confocal.</li>
</ol>8. Absorción in vivo de los sEV
<ol><li>Realizar una inyección intratecal de 5 μg de sEV no etiquetados o etiquetados resuspendidos en 10 μL de PBS, o en un volumen igual (10 μL) de control de colorantes (como se prepara en la sección 3) en ratones C57BL/6.</li>
	<li>Después de 6 y 18 h después de la inyección de sEV, anestesiar profundamente a los ratones mediante inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de peso corporal de ketamina y 10 mg / kg de peso corporal de xilazina.</li>
	<li>Realice perfusión intracárdica de ratones con solución salina al 0,9% para eliminar la sangre, seguida de PFA / PB al 4% recién hecho y helado.</li>
	<li>Diseccionar la médula espinal y fijar en 4% PFA/PB a 4 °C durante 24 h. Crioproteger los tejidos en sacarosa al 30% en PB a 4 °C durante 24 h o hasta que los tejidos se hundan. Conservar los tejidos a 4 °C hasta la inmunohistoquímica.</li>
</ol>9. Inmunohistoquímica
<ol><li>Incrustar la médula espinal L4-L5 en el compuesto O.C.T. Congelar sobre hielo seco hasta que esté completamente solidificado.</li>
	<li>Seccionar los tejidos a 30 μm (transversalmente para la médula espinal) usando un criostato, y recoger las secciones en una placa de 24 pozos que contenga PB. Lavar las secciones 3 x 5 min con Tritón al 0,3% en PB.</li>
	<li>Bloquee los sitios de unión no específicos con 5% NGS en Tritón/PB al 0,3% durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Anticuerpos primarios diluidos: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 para microglia (1:2.000) con NGS al 5% en Tritón/PB al 0,3%, e incubar las secciones durante la noche a 4 °C en un agitador.</li>
	<li>Lave las secciones 3 x 5 min con Tritón/PB al 0,3% y añada anticuerpos secundarios (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500, o Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) en NGS/PB al 5% durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar 3 x 5 min con PB, e incubar las secciones en 1 μg/mL de DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar las secciones 3 x 5 min con PB.</li>
	<li>Monte las secciones en una diapositiva adhesiva limpia(Tabla de materiales)con un pincel fino bajo un microscopio de luz.</li>
	<li>Humedezca el cubrecubres con el medio de montaje. Curar durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Imagen bajo un microscopio confocal con los respectivos láseres.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

En este protocolo, mostramos el etiquetado de los sEV con colorantes PKH y la visualización de su captación en la médula espinal. Los colorantes fluorescentes lipofílicos PKH son ampliamente utilizados para el etiquetado de células por citometría de flujo y microscopía fluorescente3,5,6,12,24,25. Debido a su vida media relati...

Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) son vesículas de tamaño nanométrico derivadas de membranas con un rango de tamaño de 50-150 nm. Se originan a partir de cuerpos multi-vesiculares (MVB) y se liberan de las células tras la fusión de los MVB con la membrana plasmática. Los sEV contienen miRNAs, mRNAs, proteínas y lípidos bioactivos, y estas moléculas se transfieren entre las células en forma de comunicación de célula a célula. Los sEV pueden ser internalizados por las células receptoras por una variedad de vías endocíticas, y esta captura de sEV por las células receptoras está mediada por el reconocimiento de moléculas de superficie tanto en los VE como en las células diana1.
Los sEV han ganado interés debido a su capacidad para desencadenar cambios moleculares y fenotípicos en las células aceptoras, su utilidad como agente terapéutico y su potencial como portadores de moléculas de carga o agentes farmacológicos. Debido a su pequeño tamaño, las imágenes y el seguimiento de los sEV pueden ser un desafío, especialmente para estudios in vivo y entornos clínicos. Por lo tanto, se han desarrollado muchos métodos para etiquetar e imagenar los sEV para ayudar a su biodistribución y seguimiento in vitro e in vivo2.
La técnica más común para estudiar la biodistribución de sEV y las interacciones de las células diana consiste en etiquetarlas con moléculas de colorante fluorescente3,4,5,6,7. Los vehículos eléctricos se etiquetaron inicialmente con tintes de membrana celular que se usaban comúnmente para obtener imágenes de las células. Estos colorantes fluorescentes generalmente tiñen la bicapa lipídica o las proteínas de interés en los sEV. Varios colorantes lipofílicos muestran una fuerte señal fluorescente cuando se incorporan al citosol, incluyendo DiR (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-yoduro de tetrametilindotricarbocianina), DiL (1, 1′-dioctadecil-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina perclorato) y DiD (1, 1′-dioctadecil-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indocarbocianina 4-clorobencenosulfonato de sal)8,9,10,11.
Otros colorantes lipofílicos, como PKH67 y PKH26, tienen un grupo de cabeza polar altamente fluorescente y una larga cola de hidrocarburos alifáticos que se intercala fácilmente en cualquier estructura lipídica y conduce a la retención de colorantes a largo plazo y a una fluorescencia estable12. Los colorantes PKH también pueden etiquetar EV, lo que permite el estudio de las propiedades EV in vivo13. Se han utilizado muchos otros colorantes para observar exosomas utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, incluidos los colorantes de marcación lipídica14 y los colorantes permeables a las células, como el éster de acetato de carboxifluoresceína succinimidil (CFDA-SE)15,16 y el éster de calceína acetoximetil (AM)17.
Los estudios de diafonía mediada por sEV entre diferentes células del SNC han proporcionado información importante sobre la patogénesis de las enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas18. Por ejemplo, los sEV de las neuronas pueden propagar péptidos beta-amiloides y proteínas tau fosforilados y ayudar en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer19. Además, los vehículos eléctricos derivados de los eritrocitos contienen grandes cantidades de alfa-sinucleína y pueden cruzar la barrera hematoencefálica y contribuir a la patología del Parkinson20. La capacidad de los sEV para cruzar barreras fisiológicas21 y transferir sus biomoléculas a las células diana los convierte en herramientas convenientes para administrar fármacos terapéuticos al SNC22.
La visualización de la absorción de sEV por una miríada de células del SNC en la médula espinal permitirá tanto estudios mecanicistas como la evaluación de los beneficios terapéuticos de los sEV administrados exógenamente de diversas fuentes celulares. Este artículo describe la metodología para etiquetar los sEV derivados de macrófagos e imagen de su absorción in vitro e in vivo en la médula espinal lumbar por neuronas, microglía y astrocitos para confirmar cualitativamente la entrega de sEV mediante visualización.

<table><tbody><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra 0,5 mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Alix</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Calnexina</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-CD81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-GAPDH (14C10)</td><td>Señalización celular Tecnología</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-glial</td> antiglial antiproteína ácida <td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 para IF; 1:1000 para IHC</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MAP2A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12.000 x g</td></tr><tr><td>Cobro, 12 mm, #1,5</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Cobertora, 18 mm, #1,5</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I (ADNasa I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Conejo IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Burro Anti-Conejo IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Portaobjetos de Microscopio Doble Esmerilado, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sin Calcio y Magnesio</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal empobrecido en exosomas</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M sistema de imagen ProteinSimple</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Microscopio Confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Sustrato</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo de intercepción, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Tampón de muestras</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Sistema Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software NanoSight NTA 3.2</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Línea celular Neuro-2A</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio de vector de suero de cabra normal</td><td>S-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compuesto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Ciencias de Microscopía Electrónica de</td><td>Paraformaldehído</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Thermo Scientific 1862209</td><td></td><td></td></tr><tr><td>membrana de transferencia de PVDF</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 línea celular</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold</td><td>Portaobjetos Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>portaobjetos adhesivos</td></tr><tr><td>T-75 Frascos</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Microscopio electrónico de transmisión digital</td><td>FEI Empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Grids</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Gel de proteína de tris-glicina, 12%</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ejecución de Tris-Glicina SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de transferencia de Tris-Glicina</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>enzima</td></tr> <tr>de disociación celular<td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0.25%</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Ultracentrífugos</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110,000 x g</td></tr></tbody></table>

captación de pequeñas vesículas extracelulares con marca fluorescente in vitro y en la médula espinal

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) son vesículas de 50-150 nm secretadas por todas las células y presentes en los fluidos corporales. Los sEV transfieren biomoléculas como ARN, proteínas y lípidos del donante a las células aceptoras, lo que las convierte en mediadores clave de señalización entre las células. En el sistema nervioso central (SNC), los sEV pueden mediar la señalización intercelular, incluidas las interacciones neuroinmunes. Las funciones de sEV se pueden estudiar mediante el seguimiento de la absorción de sEV etiquetados en células receptoras tanto in vitro como in vivo. Este artículo describe el etiquetado de los sEV de los medios acondicionados de las células macrófagos RAW 264.7 utilizando un tinte de membrana PKH. Muestra la captación de diferentes concentraciones de sEVs etiquetados en múltiples puntos de tiempo por células Neuro-2a y astrocitos primarios in vitro. También se muestra la captación de sEV administrados intratecalmente en neuronas de la médula espinal de ratón, astrocitos y microglía visualizados por microscopía confocal. Los resultados representativos demuestran una variación dependiente del tiempo en la absorción de sEV por diferentes células, lo que puede ayudar a confirmar la entrega exitosa de sEV en la médula espinal.

Después del aislamiento de los sEV de los medios acondicionados RAW 264.7 mediante centrifugación, se utilizó NTA para determinar la concentración y la distribución del tamaño de los sEV purificados. El tamaño medio promedio de los sEV derivados de RAW 264.7 fue de 140 nm, y el tamaño máximo de partícula fue de 121.8 nm, lo que confirma que la mayoría de las partículas detectables en la medición de dispersión de luz cayeron dentro del rango de tamaño de los exosomas o sEV a 50-150 nm(Figura 1A).</str...

Describimos un protocolo para etiquetar pequeñas vesículas extracelulares derivadas de macrófagos con colorantes PKH y observar su captación in vitro y en la médula espinal después del parto intratecal.

Captación de pequeñas vesículas extracelulares con marca fluorescente in vitro y en la médula espinal

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

La visualización de la absorción de pequeñas vesículas extracelulares, también conocidas como sEV, por diferentes células de la médula espinal, puede confirmar una entrega exitosa de sEV. Esto permite estudios mecanicistas y terapéuticos de sEV administrados intratecalmente de diversas fuentes en modelos de roden. Este protocolo se puede utilizar para visualizar la absorción de sEV por las células en una médula espinal leve, y puede ayudar a evaluar el papel de los sEV y sus moléculas de carga en los trastornos de la columna vertebral, el dolor y la inflamación.Este procedimiento será demostrado por mí, junto con Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, los dos estudiantes graduados en el laboratorio del Dr. Seena Ajit. Comience colocando deslizamientos de cubierta de 18 milímetros en la placa de 12 pozos, luego placa neuro-2a células en cada pozo con un total de 1 mililitro de DMEM completo que contiene 10% FBS y 1% de estreptococo de pluma. Cuando la fluidez del recuento celular haya alcanzado el 80 al 90%, cambie el medio a medio agotado de exosoma DMEM en cada pozo, agregue uno, 5 o 10 microgramos de sEV etiquetados.Durante 1, 4 y 24 horas. Para la absorción dependiente de la dosis y el tiempo al resto de los pozos a un volumen igual de control del tinte. Recoge los cerebros de los cachorros postnatales en una placa de Petri de 60 milímetros que contiene una solución de sal equilibrada Hanks helada suplementada con 10 hepes milimolares, disecciona ambos lóbulos corticales y elimina las meninges.Luego pica los tejidos con una cuchilla esterilizada. Transfiera los tejidos a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga Pepane o desoxirribonucleo un tampón de disociación e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados, girando el tubo cada 5 minutos, aspire el sobrenadante y agregue 5 mililitros de DMEM completo al tubo. Para inactivar la actividad enzimática, trate de calificar cuidadosamente para disociar los tejidos con una pipeta serológica de vidrio de 5 mililitros y una pipeta de pasto pulida con llama.Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrómetros, y luego centrífuga las células a 250 veces G durante 5 minutos a 4 grados Celsius, aspire el medio y vea las células en 10 mililitros de DMEM completo en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Después de 4 horas de chapado, reemplace el sobrenado y el medio con 15 mililitros de medio DMEM fresco. Después de 14 días in vitro para separar la microglía y los oligodendrocitos, transfiera el matraz a un agitador orbitario a 320 RPM durante 6 horas.Use 5 mililitros de la enzima de disociación celular durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Para tripsinizar, los astrocitos restantes, para inactivar la acción enzimática, agregue 5 mililitros de DMEM completo y luego peletice las células a 250 veces G durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Resuspenda las celdas en DMEM completo y vea las celdas en los deslizamientos de la cubierta de 12 milímetros número 1.5 en una placa de 24 pozos.Usando PBS enjuague las células 3 veces y luego corríjalas con formaldehído o PFA de 4% de potencia en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave las células fijas 3 veces durante 5 minutos con PBS y permeabilícelas usando 0.1%Triton X 100 en PBS durante 10 a 15 minutos. Luego repita los lavados con PBS.Use suero de cabra normal al 5% o NGS en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear las células, incube las células neuro-2a con anticuerpos bidireccionales map y los astrocitos primarios con anticuerpos GFAP en una proporción de 1 a 500 en 5% NGS fresco o PBS durante la noche a 4 grados Celsius con agitación suave. Después de lavar las células 3 veces en PBS, agregue los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo en 5% NGS. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente protegido de la luz en un balancín.Repita el lavado con PBS e incube la celda con 1 microgramo por mililitro de DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una vez más, lave las células 3 veces con PBS. Usando un medio de montaje antidesvanección, monte los resbalones de la cubierta en las diapositivas número 1, déjelas secar durante la noche en la oscuridad y guarde las diapositivas de vidrio preparadas a 4 grados Celsius hasta obtener imágenes en un microscopio confocal.Diseccionar la médula espinal y fijarla en 4% PFA en PBS a 4 grados Celsius durante 24 horas. Proteja previamente los tejidos en sacarosa al 30% en PBS a 4 grados Celsius durante 24 horas o hasta que los tejidos se hundan y luego almacene los tejidos a 4 grados Celsius hasta inmunohistoquímica, inmbró la médula espinal L4 L5 en el compuesto OCT, luego congeló en hielo seco hasta que esté completamente solidificada. Use un criostato para seccionar los tejidos a 30 micrómetros y recolectar las secciones en una placa de 24 pozos que contenga PBS.Lave las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una con 0.3% Tritón en PBS, Bloquee los sitios de unión no específicos usando 5% MGS en 0.3% Tritón PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Incubar las secciones durante la noche a 4 grados centígrados en una coctelera. Lavar las secciones 3 veces durante 5 minutos con 0.3% Tritón en Pbs.Luego agregue la concentración adecuada de los anticuerpos secundarios. Según el manuscrito del texto, incube a temperatura ambiente durante dos horas, lave las secciones usando solo PBS e incube en 1 microgramo por mililitro de DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego repita los lavados de PBS bajo un microscopio de luz, monte las secciones en una diapositiva adhesiva transparente con un pincel fino.Humedezca el resbalón de la cubierta con el medio de montaje y cure durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente, adquiera imágenes bajo un microscopio confocal con los láseres respectivos, El tamaño medio promedio de ra 2 6 4 0.7 sEV derivados fue de 140 nanómetros y el tamaño máximo de partícula fue de 121.8 nanómetros. Con las partículas más detectables que caen dentro del rango de tamaño de los exosomas o sEVS. A 50 a 150 nanómetros, el western blotting de sEV, Lisato celular y medios exodpleted, demostró que las muestras de proteínas derivadas de sEV contenían las proteínas marcadoras de sEV Alix CD81 y GAPDH.El lisato celular se enriqueció con retículo endoplásmico, proteína residente Calnexin por lo que Calnexin sirvió como un marcador negativo para la contaminación celular ya que estaba ausente en los sEV. Se observó que la absorción de los sEV ocurrió a 1 hora y para los sEV de 1, 5 y 10 microgramos, la fluorescencia posterior a la incubación se pudo detectar a las 4 horas, para 4, 5 y 10 microgramos de sEV. Se examinó la captación de SEV etiquetados con PKH 26 por los astrocitos primarios y se observó la máxima fluorescencia de la captación de sEVS en los astrocitos corticales primarios a las 24 horas En que se tomaron los sEV etiquetados con PKH26 y se observó la máxima fluorescencia a las 6 horas, después de la inyección en las neuronas astrocitos y las células microgliales.La inclusión de controles, sEV sin etiquetar y control de tinte crea código a un viento falso positivo señales recientes debido al etiquetado ahora específico de la danza Opry de las costas de parches de tinte unbound. La absorción de seVs se puede confirmar investigando la transferencia de carga biomolecular a la receta y las células y tejidos y determinando los cambios en los niveles de expresión de biomoléculas o genes diana. También se pueden realizar estudios de comportamiento para investigar el impacto funcional de la administración de sEV.

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Investigación

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Neurociencia

Se describe una técnica sencilla y de bajo costo para la introducción de alta concentración de colorantes fluorescentes y sensible de calcio en las neuronas o cualquier aparato neuronal con una pipeta de succión de polietileno.

Cargando retrógrada de los nervios, panfletos, y las raíces espinales con tintes fluorescentes

En este video, demostramos un ensayo para visualizar y cuantificar la absorción celular de vesículas extracelulares o EV. Este ensayo utiliza imágenes fluorescentes en 3D utilizando un microscopio confocal y permite distinguir los EV internalizados de los adheridos a la superficie celular.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares: un método para visualizar y cuantificar la captación celular de vesículas extracelulares mediante la técnica de imágenes de fluorescencia 3D

Este video demuestra cómo las vesículas neuronales se marcan con proteínas fluorescentes específicas para visualizar su movimiento. Primero, un plásmido que codifica para una proteína fluorescente se incuba con un agente de transfección y luego se introduce en un cultivo de neuronas. Posteriormente, se adquieren imágenes de las neuronas y se analizan para rastrear el movimiento de las vesículas.

Visualización de las motilidades de las vesículas en las neuronas mediante imágenes de fluorescencia

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

En este trabajo, describimos protocolos para investigar el papel de las vesículas extracelulares (EVs) liberado por los eritrocitos Plasmodium falciparum infectados. En particular, nos centramos en las interacciones de EVs con las células endoteliales.

Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal

Este vídeo demuestra un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas E13 dorsal. Disociada neuronas comisurales son útiles para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento axonal y orientación.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Aprende a marcar vesículas extracelulares pequeñas con PKH y rastrear su captación in vitro y en médula espinal mediante inyección intratecal. Este protocolo permite estudiar su potencial terapéutico en trastornos espinales.

Captación de pequeñas vesículas extracelulares con marca fluorescente in vitro y en la médula espinal

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