In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

Este protocolo describe un ensayo de angiogénesis de brotes in vitro que recapitula muchas características de la formación de vasos sanguíneos y se puede usar para probar medicamentos. Este método es fácil de implementar en un laboratorio, robusto y escalable. Tiene muchas similitudes con los ensayos que utilizan células endoteliales humanas y microesferas.

Este modelo imita robustamente el fenotipo que muestra una selección defectuosa de las células de la punta endotelial y una migración de células endoteliales orientada que conduce a la angiogénesis patológica. El trabajo puede proporcionar información sobre los mecanismos que regulan la angiogénesis germinada, los genes clave y las vías de señalización involucradas, especialmente mediante la realización de exámenes genéticos. El principal desafío es mantener la calidad o la pluripotencia de las células madre embrionarias de ratón en cultivo. Es importante verificar regularmente las etapas de pluripotencia y la morfología de las líneas celulares.

También es importante realizar un cariotipo de las líneas celulares, ya que tienden a cultivar para perder o ganar cromosomas. Comience cubriendo un pocillo de la placa de cultivo celular de seis pozos con 500 microlitros de solución de gelatina al 0,1% y colóquela en una incubadora de dióxido de carbono durante 30 minutos. Luego lave las placas recubiertas de gelatina con PBS y agregue 500 microlitros de CM recién preparado más menos medio.

Para obtener una población pura de células madre embrionarias de ratón o mESCs, tripsinizar la placa de cultivo celular con tampón TVP 10x durante 30 segundos a temperatura ambiente. Luego resuspenda las células en un mililitro de medio de diferenciación de mesodermo antes de transferirlas a la placa de seis pocillos recubierta de gelatina durante 30 minutos para permitir que los fibroblastos embrionarios de ratón se adhieran mientras las mESCs permanecen en suspensión. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros antes de contar las células vivas utilizando un hemocitómetro Neubauer en colorante azul de tripano.

Luego centrifugar las celdas a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en un volumen apropiado de medio de diferenciación de mesodermo. Prepare cuatro platos de poliestireno de 94 milímetros de baja fijación agregando 15 mililitros de agua estéril al fondo.

Después de transferir la suspensión celular a un depósito de plástico estéril, cargue cuatro posiciones de una pipeta multicanal con 22 microlitros de suspensión celular por canal. Levante y coloque la tapa invertida del plato de 94 milímetros sobre la superficie limpia del gabinete de flujo con el lado interior hacia arriba. Deposite 40 gotas de la suspensión celular en la superficie interna de cada tapa e invierta cuidadosamente la tapa sin perturbaciones para volver a colocarla en el plato, de modo que las gotas miren hacia el agua.

Incubar los platos en una incubadora de dióxido de carbono durante cuatro días, considerando esto como diferenciación día cero. Después de cuatro días de incubación, recoger las gotas colgantes en un tubo cónico de 15 mililitros con una pipeta P1000. Deje que el EB sedimente en el tubo antes de retirar el sobrenadante.

Resuspender los EB en tres mililitros de medio de diferenciación vascular 2x antes de transferir y distribuir uniformemente la suspensión de EB en un plato recubierto de agar de 60 milímetros. Incubar los platos en una incubadora de dióxido de carbono hasta el día nueve con un refresco medio cada dos días. Prepare un plato de cultivo de 35 milímetros agregando un mililitro del medio de germinación a su fondo.

Para inducir la gelificación, incubar el plato a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Recoja los EB de nueve días de edad de un plato de agar en un tubo cónico de 15 mililitros y retire el sobrenadante. Resuspender los EB en dos mililitros de medio de germinación en frío para transferir a la placa de cultivo recubierta con la primera capa de medio de brotación.

Distribuya los EB por todo el plato, asegurándose de que estén a la misma distancia entre sí. La primera formación de brotes debe ser evidente después de la incubación durante aproximadamente 24 a 48 horas. El día 12, use una espátula para transferir cuidadosamente el gel de colágeno que contiene EB a un portaobjetos de vidrio.

Retire el exceso de líquido con una pipeta y deshidrate el gel colocando una gasa de lino de nylon y tarjetas de filtro absorbente encima del gel. Aplicar presión con un peso de 250 gramos durante dos minutos. Luego retire los papeles de nylon para permitir que las diapositivas se sequen al aire durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después del secado, fije los EB con solución de zinc durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire el fijador antes de lavar las diapositivas cinco veces con PBS. Permeabilizar los EBs y PBS que contienen 0.1% Triton X-100.

Después de 15 minutos, retire la solución de permeabilización para lavar los portaobjetos cinco veces con PBS durante cinco minutos. Incubar los EB en el tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente y lavar con PBS durante cinco minutos. Luego agregue el anticuerpo primario diluido en el tampón de bloqueo e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.

Luego incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario Goat anti-Rat Alexa 555 en un tampón de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos y una vez con agua antes de montarlos para microscopía. El ensayo de angiogénesis de brotes 3D se llevó a cabo en tres EB con dos fármacos, DC101 y DAPT.

Ambos compuestos bloquearon progresivamente la angiogénesis en el modelo EB con concentraciones crecientes. Las diversas concentraciones de fármacos en EB mostraron que altas dosis de DC101 inhiben el número y la longitud de los brotes de los vasos. DAPT tuvo efectos opuestos a la dosis de un micromol por litro.

DAPT aumentó fuertemente el número de células de la punta endotelial por brotes de vasos que tienen un fenotipo de desorientación incluso a dosis bajas, en comparación con DC101. Se observó una brotación defectuosa de los vasos en las eEB de telangiectasia hemorrágica hereditaria del control de ACVRL1 y los genotipos heterocigotos ACVRL1 con numerosos fenotipos de desorientación que brotan en ángulos aleatorios en relación con los vasos parentales. Las mezclas de una línea mESC de tipo salvaje en una proporción de uno a uno con una línea de tipo salvaje mESC no marcada, condujeron a una contribución igual a las principales células de la punta endotelial.

Se realizó un análisis microscópico de esta EB quimérica representativa para identificar el origen genotípico de las principales células de la punta endotelial. Para cuantificar la cobertura celular mural del brote del vaso, se fijaron y tiñeron EB para marcadores de células endoteliales, PECAM, y marcador de células murales, actina alfa del músculo liso. Una imagen de gran aumento reveló que un brote de vaso individual estaba rodeado por celdas murales.

La transformación binaria se realizó después de la separación del canal de color y se cuantificó la proporción de vasos PECAM positivos cubiertos por células murales alfa SMA positivas. Los antecedentes genéticos de la línea de células madre embrionarias también son un factor clave que los investigadores deben considerar, ya que algunas líneas brotan mejor que otras. Este método se puede utilizar para realizar cribado genético utilizando enfoques de ARNi o un banco de células madre embrionarias de ratón que albergan mutaciones genéticas.