Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis
9 de junio de 2021
Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.
El protocolo estudia las neuronas granulares cerebelosas en diferentes etapas de desarrollo para visualizar el crecimiento morfológico clave. Las ventajas de la técnica incluyen la focalización específica de células, la expresión rápida de construcciones transfectadas y el etiquetado disperso de las células que permite el estudio de los efectos autónomos de las células. Comience cortando un segmento de 11,2 milímetros de la punta de una pipeta de carga y coloque la pieza cortada sobre la punta de la jeringa Hamilton como espaciador para limitar la profundidad de inyección a 1,5 milímetros.
Asegure el espaciador en la punta de la jeringa con adhesivo o parafilm. Para estudiar la morfología de CGN electroporados individuales de secciones cerebrales sagitales del cachorro experimental, tome imágenes de pila Z a 0,5 micrómetros por pila en un microscopio confocal. Imagen de una celda por ventana de imagen para permitir un fácil análisis de imágenes y reconstrucción 3D.
Analice la longitud de la neurita y la formación de garras dendríticas de manera ciega utilizando un trazador de neurita simple. Cargue imágenes de pila Z de un solo canal de CGN electroporadas en Fiji y haga clic en Plugins"Segmentation" y Simple Neurite Tracer"Seleccione Create New 3D Viewer" en el menú desplegable. Desplácese hasta la base de una dendrita que se conecta al soma celular e inicie un camino haciendo clic en la unión.
Trace manualmente la ruta haciendo clic en las secciones donde la señal de relleno de celda es más brillante y presionando Y para mantener el seguimiento. Traza hasta el final de la dendrita y confirma la ruta presionando F.Alternativamente, traza hasta la base de la garra. A continuación, trace la garra desde la base de la estructura hasta el final de la neurita más larga.
Para rastrear las ramas secundarias y terciarias, mantenga presionada la tecla Control en Windows o ALT en un macOS y haga clic en la ruta. Confirme la ruta pulsando F.Observe que las mediciones de las trazas son visibles en una ventana separada. Sume todos los tamaños de las ramas de la garra para obtener la longitud total de cada garra.
En el análisis representativo, las imágenes de proyección de CGNs electroporadas de 3 a 14 días después de la inyección mostraron una disminución progresiva en el número de dendritas. Las CGN se sometieron a una fase de crecimiento dendrítico seguida de un refinamiento de 3 DPI a 7 DPI que resultó en la poda de más del 50% del exceso de dendritas. Este evento coincide con el alargamiento gradual de los cenadores restantes en la formación de estructuras en forma de garra al final de cada dendrita que indica que estos procesos de desarrollo están ocurriendo simultáneamente.
A los 7 DPI, se encontraron garras en aproximadamente el 75% de las dendritas. Cada CGN marcado se reconstruyó en RMN para cuantificar el área de superficie y el volumen somatodendrítico total. No se observaron diferencias significativas en el tamaño de CGN a lo largo del desarrollo.
Aunque a 7 DPI, los CGN mostraron una disminución significativa del 20% en volumen en comparación con 3, 5 y 10 DPI. Lo más importante en el procedimiento es localizar con precisión el cerebelo antes de la inyección. El método se puede adaptar para manipular genéticamente genes in vivo para estudiar su papel en el desarrollo de neuronas granulares mediante la transfección de shRNAs, siRNAs o Cre Recombinase.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para estudiar el desarrollo morfológico de las neuronas granulosas cerebelosas (CGNs) en el cerebelo de ratón en desarrollo mediante electroporación in vivo. La técnica permite la marcación escasa y la manipulación genética de las CGNs, lo que posibilita un análisis detallado del crecimiento dendrítico, la formación de garras y la sinaptogénesis durante etapas clave del desarrollo. El método combina inyección precisa, imágenes confocales y análisis morfométrico cuantitativo para rastrear la maduración de las CGNs a lo largo del tiempo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Biología celular
Antecedentes
- Las neuronas experimentan cambios estructurales y funcionales significativos durante el desarrollo cerebral.
- El cerebelo de roedor es un sistema modelo para estudiar la morfogénesis a nivel celular, particularmente de las CGN.
- Las CGN forman garras dendríticas especializadas que son fundamentales para la entrada sináptica.
- Los métodos tradicionales de marcado a menudo carecen de especificidad celular o resolución temporal.
Objetivo del estudio
- Visualizar y cuantificar el desarrollo morfológico de neuronas granulares cerebelosas individuales in vivo.
- Seguir el crecimiento dendrítico, la poda y la formación de expansiones en garras a lo largo de puntos temporales del desarrollo.
- Proporcionar una plataforma para la manipulación genética autónoma a nivel celular de las neuronas granulares cerebelosas.
Métodos Utilizados
- Electroporación in vivo de progenitores de neuronas granulares en el cerebelo en desarrollo del ratón.
- Etiquetado escaso de CGNs para un claro análisis morfológico.
- Microscopía confocal con imágenes de cortes en Z para reconstrucción 3D.
- Trazado manual y cuantificación de la longitud de las neuritas y de las estructuras de garras dendríticas utilizando Fiji y Simple Neurite Tracer.
Resultados principales
- Las imágenes de proyección desde los 3 hasta los 14 días posteriores a la inyección (DPI) revelaron una disminución progresiva en el número de dendritas por NCG.
- Entre los 3 y 7 DPI, las NCG experimentaron una poda dendrítica, eliminando más del 50 % de las dendritas excesivas.
- Se formaron estructuras en forma de garra en los extremos de las dendritas restantes, estando presentes las garras en aproximadamente el 75 % de las dendritas al llegar a los 7 DPI.
- El tamaño de las NCG permaneció en gran medida constante, aunque se observó una disminución significativa del 20 % en el volumen a los 7 DPI en comparación con otros puntos temporales.
Conclusiones
- El protocolo permite un análisis detallado y específico de células sobre el desarrollo morfológico de las CGN in vivo.
- El recorte dendrítico y la formación de garras son procesos simultáneos durante la maduración de las CGN.
- El método es adaptable para manipulación genética con el fin de estudiar la función génica en el desarrollo de las CGN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis cuantitativo in vivo de la morfología de las neuronas granulares cerebelosas (CGN) y del desarrollo de la sinapsis aborda una necesidad crítica para obtener confianza predictiva en la validación de dianas en el desarrollo neurológico. Las capacidades de marcado escaso y de manipulación genética permiten reducir riesgos mecanicistas en las primeras etapas del descubrimiento del sistema nervioso central (CNS). Este enfoque favorece la continuidad traslacional al vincular la morfogénesis celular con la integración sináptica, orientando las decisiones estratégicas en I+D centrada en neurobiología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la función génica en la morfogénesis y sinaptogénesis de las CGN.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de efectos autónomos celulares in vivo.
- Proporciona lecturas cuantitativas para la validación de objetivos basada en hipótesis.
- Facilita la triage de objetivos del desarrollo neurológico basado en fenotipos morfológicos y sinápticos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Establece flujos de trabajo validados y reproducibles de imagen y análisis para la morfología neuronal.
- Proporciona métricas cuantitativas como el número de dendritas, la formación de espinas y la longitud de los neuritos para cribados posteriores.
- Posibilita la estandarización de ensayos mediante análisis morfométrico asistido por software y a ciegas.
- Prepara sistemas biológicos robustos para cribados de compuestos o genéticos en líneas de investigación del sistema nervioso central.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona fenotipos morfológicos con el desarrollo sináptico relevante para enfermedades en modelos de roedores.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica de intervenciones neurodesarrolladoras.
- Ofrece una plataforma para evaluar biomarcadores traducibles de la maduración sináptica.
- Reduce los riesgos del avance al vincular cambios celulares con resultados sinápticos funcionales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos activos en la investigación del sistema nervioso central, permitiendo la verificación iterativa de hipótesis y la fenotipificación cuantitativa de intervenciones genéticas o farmacológicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis nulas sobre la función génica en la morfogénesis neuronal y la formación de sinapsis.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para el análisis de la estructura dendrítica y sináptica.
- Análisis: Ofrece mediciones asistidas por software y realizadas a ciegas de la longitud de los neuritas, las expansiones dendríticas y el volumen celular.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos celulares con el desarrollo sináptico relevante para enfermedades in vivo.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a diversas manipulaciones genéticas y sistemas modelo del SNC en distintos programas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas neurodesarrolladoras y en la reducción de riesgos mecanicistas.
- Valor operativo: Estandariza la imagenología in vivo y el análisis morfométrico para garantizar reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al vincular la perturbación génica con fenotipos neuronales cuantificables.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas del sistema nervioso central basada en datos sólidos in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neuroanatomía de roedores y técnicas precisas de inyección estereotáxica.
- Exige acceso a microscopía confocal y software avanzado de análisis de imágenes (por ejemplo, Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Necesita estandarización entre equipos para el análisis ciego y la interpretación de datos.
- Adaptable a diversas construcciones genéticas (shRNA, siRNA, recombinasa Cre) para estudios autónomos a nivel celular.
- La precisión en la inyección y la eficiencia del etiquetado celular son fundamentales para obtener resultados reproducibles.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
