Name: Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a modelar el accidente cerebrovascular en ratones mediante oclusión transitoria de la arteria cerebral media con técnica de filamento. Este protocolo estandarizado permite la restauración completa del flujo sanguíneo cerebral.

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Agradecemos a todos nuestros socios colaboradores de los Consorcios ImmunoStroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) por sus sugerencias y discusiones. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania en el marco del Clúster de Munich para la Neurología de Sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) y bajo las subvenciones LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 y LL-112/1-1.

Los experimentos reportados en este video se llevaron a cabo siguiendo las pautas nacionales para el uso de animales de experimentación, y los protocolos fueron aprobados por los comités gubernamentales alemanes (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Se utilizaron ratones machos C57Bl/6J de diez semanas de edad y se alojaron a temperatura controlada (22 ± 2 °C), con un período de ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimentos granulados y agua ad libitum.
1. Preparación del material y los instrumentos
<ol><li>Conecte la manta térmica para mantener la temperatura del área de operación y la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 °C.</li>
	<li>Tijeras y fórceps en autoclave, prepare una solución de etanol al 70% y mantenga disponible el ungüento ocular dexpantenol, varias piezas de algodón y la sutura de poliéster trenzado recubierto 5-0 listo para su uso. Prepare una jeringa de 1 ml con solución salina al 0,9% (sin aguja) para mantener hidratado el sitio de incisión del animal. Preparar el gasestésico (100% O2 + isoflurano).</li>
	<li>Prepare un soporte para la sonda Láser Doppler cortando la punta de una punta de pipeta de 10 μL (longitud de 3-5 mm). NOTA: Todos los instrumentos se esterilizan utilizando un esterilizador de cuentas calientes. Las superficies también se desinfectan antes y después de la cirugía con un aerosol desinfectante microbiano. Antes de la cirugía, las áreas que rodean la cabeza y el pecho de los ratones se desinfectan con un aerosol de desinfección de heridas.</li>
</ol>2. Preparación del láser Doppler
<ol><li>Inyecte analgesia al ratón 30 min antes de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina, por vía intraperitoneal).</li>
	<li>Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% hasta el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición prona en el área de operación con la nariz en la máscara de anestesia. Mantenga la concentración de isoflurano al 4% durante otro minuto, luego redúzcala y manténgala en un 2%.</li>
	<li>Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 ° C e inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos.</li>
	<li>Aplique ungüento ocular dexpantenol en ambos ojos.</li>
	<li>Desinfecte la piel y el cabello que rodea el ojo izquierdo y el oído con etanol al 70%.</li>
	<li>Corte el cuero cabelludo entre la oreja izquierda y el ojo (1 cm de largo) para exponer el hueso del cráneo.</li>
	<li>Cortar y retirar el músculo temporal para visualizar el MCA debajo del cráneo.</li>
	<li>Fije con pegamento la parte exterior de la punta que sujeta la sonda/ fibra Doppler láser en la parte superior del MCA izquierdo con pegamento. Luego, pegue la piel para cerrar la herida alrededor del soporte de la punta. Aplique 2-3 gotas de pegamento endurecedor para acelerar el proceso. Asegúrese de que la fibra Doppler láser no esté pegada y se pueda quitar fácilmente del soporte de la punta en cualquier momento.</li>
</ol>3. Modelo MCAo transitorio (oclusión)
<ol><li>Gire el ratón en posición supina. Coloque el hocico en el cono de anestesia y fije las patas con cinta adhesiva.</li>
	<li>Desinfecte la piel y el cabello que rodea el pecho y haga una incisión en la línea media de 2 cm de largo en el cuello.</li>
	<li>Use fórceps para separar la piel y las glándulas submandibulares. Use retractores para sostener el músculo esternomastoideo, exponer el campo quirúrgico y encontrar la arteria carótida común izquierda (CCA). Diseccionar el CCA libre de tejido conectivo y nervios circundantes (sin dañar el nervio vago) y realizar una ligadura transitoria antes de la bifurcación.</li>
	<li>Diseccionar la arteria carótida externa (ECA) y atar un nudo permanente en la parte visible más distal. Coloque otra sutura debajo del ECA, cerca de la bifurcación, y prepare un nudo suelto para usarlo más tarde.</li>
	<li>Diseccionar la arteria carótida interna (ICA) y colocar un clip microvascular sobre ella, 5 mm sobre la bifurcación. Asegúrese de no dañar el nervio vago.</li>
	<li>Cortar un pequeño agujero en el ECA entre las ligaduras apretadas y sueltas; tenga cuidado de no cortar todo el TCE.</li>
	<li>Introduce el filamento y avanza hacia el CCA. Apriete la ligadura suelta en la ECA alrededor de la luz para asegurar brevemente el filamento en esa posición y evitar el sangrado al retirar el clip microvascular.</li>
	<li>Retire el clip microvascular e inserte el filamento a través del ICA hasta que se alcance el origen del MCA mediante la detección de una reducción brusca (>80%) en el flujo sanguíneo cerebral medido por el láser Doppler. Fije el filamento en esta posición apretando aún más el nudo alrededor del ECA. NOTA: Cuando el filamento va hacia la dirección apropiada, avanza suavemente y no se debe observar resistencia.</li>
	<li>Registre los valores doppler del láser antes y después de la inserción del filamento.</li>
	<li>Retire el retractor y reubique el músculo esternomastoideo y las glándulas submandibulares antes de suturar la herida. Retire la sonda Láser Doppler y coloque al animal en una cámara de recuperación a 37 °C durante 1 h (hasta la extracción del filamento).</li>
</ol>4. Modelo MCAo transitorio (reperfusión)
<ol><li>Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% hasta el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.</li>
	<li>Aplique ungüento ocular dexpantenol en ambos ojos.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición prona en el área de operación con su hocico en la máscara de anestesia. Mantenga la concentración de isoflurano al 4% durante otro minuto, luego redúzcala y manténgala en un 2%. Fije las patas del animal con cinta adhesiva.</li>
	<li>Inserte la sonda Doppler láser en el soporte de la sonda.</li>
	<li>Retire la sutura de la herida, use fórceps para separar la piel y las glándulas submandibulares. Use retractores para tirar suavemente del músculo esternomastoideo y exponer el campo quirúrgico.</li>
	<li>Afloje la sutura ECA que aprieta el filamento y tire suavemente del filamento. Evite dañar el recubrimiento de caucho de silicona del filamento durante la extracción.</li>
	<li>Ata bien la sutura ECA.</li>
	<li>Confirmar el aumento del flujo sanguíneo cerebral en el dispositivo Doppler láser (>80% del valor inicial antes de la reperfusión).</li>
	<li>Registre los valores de Doppler láser antes y después de la eliminación del filamento.</li>
	<li>Abra la ligadura transitoria antes de la bifurcación del CCA.</li>
	<li>Retire el retractor y reubique el músculo esternomastoideo y las glándulas submandibulares antes de suturar la herida. Coloque al animal en una cámara de recuperación a 37 °C durante 1 h para recuperarse de la anestesia.</li>
	<li>Después de la recuperación, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.</li>
	<li>Cuide a los animales agregando gránulos de comida húmeda e hidrogel en pequeñas placas de Petri en el piso de la jaula hasta el día 3 después de la cirugía.</li>
	<li>Inyecte analgesia cada 12 h durante 3 días después de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).</li>
</ol>5. Operación simulada
<ol><li>Realice todos los procedimientos descritos anteriormente, incluida la ligadura de las arterias y la introducción del filamento (pasos 1-3.7).</li>
	<li>Retire el filamento inmediatamente después de su inserción. Luego, coloque al animal en la cámara de recuperación durante 1 h.</li>
	<li>Coloque al animal en el área de operación nuevamente y retire la ligadura transitoria del CCA para garantizar la restauración completa del flujo sanguíneo cerebral.</li>
	<li>Sutura la herida y coloca al animal en una cámara de recuperación a 37 °C durante 1 h para recuperarse de la anestesia. Después de la recuperación, devuelva a los ratones a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada.</li>
	<li>Cuide a los animales agregando gránulos de comida húmeda e hidrogel en pequeñas placas de Petri en el piso de la jaula hasta el día 3 después de la cirugía.</li>
	<li>Inyecte analgesia cada 12 h durante 3 días después de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina).</li>
</ol>6. Neuropuntuación
<ol><li>Realice el Neuroscore siempre a la misma hora del día y use ropa quirúrgica para mantener un "olor neutro" entre los cirujanos individuales.</li>
	<li>Deje que los ratones descansen durante 30 minutos en la habitación con una jaula "abierta" antes de la prueba.</li>
	<li>Observe cada elemento en la Tabla 1 y la Tabla 2 durante 30 s.</li>
</ol>7. Perfusión intracardíaca
<ol><li>Prepare una jeringa de 20 ml que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS)-heparina (2 U/ml) y colóquela 1 m por encima del banco para facilitar la perfusión impulsada por la gravedad. (OPCIONAL: Realizar perfusión intracardíaca con paraformaldehído (PFA) al 4% utilizando una jeringa de 20 ml que contiene 4% de PFA en PBS, pH 7.4).</li>
	<li>Inyectar intrperitonealmente 100 μL de ketamina y xilazina (120 y 16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Espere 5 minutos y confirme el cese del movimiento espontáneo del cuerpo y las vibrisas.</li>
	<li>Fije al animal en posición supina y desinfecte la superficie corporal abdominal con etanol al 70%.</li>
	<li>Haga una incisión de 3 cm de largo en el abdomen; cortar el diafragma, las costillas y el esternón para visualizar el corazón por completo.</li>
	<li>Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha e inserte la cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo.</li>
	<li>Perfusión con 20 ml de PBS-heparina.</li>
	<li>Después de la perfusión, decapita al animal y elimina el cerebro.</li>
	<li>Congele el cerebro sobre hielo seco en polvo y guárdelo a -80 °C hasta su uso posterior.</li>
</ol>8. Volumetría de infarto
<ol><li>Para la crioseccionación, use un criostato para cortar los cerebros en secciones de 20 μm de espesor cada 400 μm. Coloque las secciones en las diapositivas y guárdelas a -80 °C hasta su uso.</li>
	<li>Tinción de violeta cresil (CV)<ol>
<li>Preparar la solución de tinción agitando y calentando (60 °C) 0,5 g de acetato CV en 500 mL de H2O hasta que los cristales se disuelvan. Después de que la solución se haya enfriado, guárdela en una botella oscura. Vuelva a calentar a 60 °C y filtre antes de cada uso.</li>
		<li>Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante 30 min. Sumergirlos en etanol al 95% durante 15 min, en etanol al 70% durante 1 min, y luego en etanol al 50% durante 1 min.</li>
		<li>Sumergir los toboganes en agua destilada durante 2 min; refresque el agua destilada y coloque los toboganes en el agua durante 1 min. Después, sumerja los portaobjetos en la solución de tinción precalentada durante 10 min a 60 °C. Lave los toboganes dos veces en agua destilada durante 1 min.</li>
		<li>Sumergir los portaobjetos en etanol al 95% durante 2 min. Colóquelos en etanol al 100% durante 5 minutos; refresque el etanol 100% y coloque las diapositivas nuevamente en el etanol durante 2 min. Después, cubra las diapositivas con un medio de montaje.</li>
		<li>Análisis (Figura 4C)<ol>
<li>Escanee las diapositivas y analice el volumen del infarto indirecto mediante el método de Swanson12 para corregir el edema mediante el uso de la siguiente ecuación: (Área isquémica) = (región isquémica)-((hemisferio ipsilateral)-(hemisferio contralateral))</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

El presente protocolo describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular basado en el acuerdo de consenso de un consorcio de investigación multicéntrico alemán ("ImmunoStroke") para establecer un modelo MCAo transitorio estandarizado. El modelo MCAo transitorio establecido mediante la introducción de un filamento recubierto de silicio a través del ECA hasta el origen del MCA es uno de los modelos de ictus más utilizados para lograr la reperfusión arterial tras un periodo de oclusión delimitado. Por lo tanto, es...

El accidente cerebrovascular es una de las causas más comunes de muerte y discapacidad en todo el mundo. Aunque hay principalmente dos formas distintas de accidente cerebrovascular, isquémico y hemorrágico, el 80-85% de todos los casos de accidente cerebrovascular son isquémicos1. Actualmente, solo hay dos tratamientos disponibles para pacientes con accidente cerebrovascular isquémico: tratamiento farmacológico con activador tisular recombinante del plasminógeno (rtPA) o trombectomía mecánica. Sin embargo, debido a la estrecha ventana de tiempo terapéutico y los múltiples criterios de exclusión, solo un número selecto de pacientes puede beneficiarse de estas opciones de tratamiento específicas. Durante las últimas dos décadas, la investigación preclínica y traslacional del accidente cerebrovascular se ha centrado en el estudio de los enfoques neuroprotectores. Sin embargo, todos los compuestos que llegaron a los ensayos clínicos hasta ahora no han mostrado mejoras para el paciente2.
Dado que los modelos in vitro no pueden reproducir con precisión todas las interacciones cerebrales y los mecanismos fisiopatológicos del accidente cerebrovascular, los modelos animales son cruciales para la investigación preclínica del accidente cerebrovascular. Sin embargo, imitar todos los aspectos del accidente cerebrovascular isquémico humano en un solo modelo animal no es factible, ya que el accidente cerebrovascular isquémico es una enfermedad altamente compleja y heterogénea. Por esta razón, se han desarrollado diferentes modelos de accidente cerebrovascular isquémico a lo largo del tiempo en diferentes especies. La fototrombosis de las arteriolas cerebrales o la oclusión distal permanente de la arteria cerebral media (ACM) son modelos de uso común que inducen lesiones pequeñas y localmente definidas en el neocórtex3,4. Además de esos, el modelo de accidente cerebrovascular más utilizado es probablemente el llamado "modelo de filamento", en el que se logra una oclusión transitoria de MCA. Este modelo consiste en una introducción transitoria de un filamento de sutura al origen del ACM, dando lugar a una reducción brusca del flujo sanguíneo cerebral y al posterior gran infarto de regiones cerebrales subcorticales y corticales5. Aunque la mayoría de los modelos de trazo imitan las oclusiones MCA 6,el "modelo de filamento" permite la delimitación precisa del tiempo isquémico. La reperfusión por eliminación de filamentos imita el escenario clínico humano de la restauración del flujo sanguíneo cerebral después de la lisis espontánea o terapéutica (rtPA o trombectomía mecánica). Hasta la fecha, se han descrito diferentes modificaciones de este "modelo de filamento". En el enfoque más común, descrito por primera vez por Longa et al. en 19895, se introduce un filamento recubierto de silicio a través de la arteria carótida común (CCA) al origen del MCA7. Aunque es un enfoque ampliamente utilizado, este modelo no permite la restauración completa del flujo sanguíneo durante la reperfusión, ya que el CCA se liga permanentemente después de la eliminación del filamento.
Durante la última década, un número creciente de grupos de investigación se han interesado en modelar el accidente cerebrovascular en ratones utilizando este "modelo de filamento". Sin embargo, la considerable variabilidad de este modelo y la falta de estandarización de los procedimientos son algunas de las razones de la alta variabilidad y escasa reproducibilidad de los resultados experimentales y hallazgos científicos reportados hasta el momento2,8. Una causa potencial de la actual "crisis de replicación", refiriéndose a la baja reproducibilidad entre los laboratorios de investigación, son los volúmenes de infarto de ictus no comparables entre grupos de investigación que utilizan la misma metodología experimental9. De hecho, después de realizar el primer estudio preclínico aleatorizado controlado multicéntrico10,pudimos confirmar que la falta de estandarización suficiente de este modelo experimental de accidente cerebrovascular y los parámetros de resultado posteriores fueron las principales razones del fracaso de la reproducibilidad en estudios preclínicos entre laboratorios independientes11 . Estas diferencias drásticas en los tamaños de infarto resultantes, a pesar de usar el mismo modelo de accidente cerebrovascular, representan justificadamente no solo una amenaza para la investigación confirmatoria, sino también para las colaboraciones científicas debido a la falta de modelos robustos y reproducibles.
A la luz de estos desafíos, nuestro objetivo fue desarrollar y describir en detalle el procedimiento para un modelo MCAo transitorio estandarizado utilizado para los esfuerzos de investigación colaborativa dentro del consorcio de investigación "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). Este consorcio tiene como objetivo comprender las interacciones cerebro-inmunidad subyacentes a los principios mecanicistas de la recuperación del accidente cerebrovascular. Además, se presentan métodos histológicos y funcionales relacionados para el análisis de resultados de accidente cerebrovascular. Todos los métodos se basan en procedimientos operativos estándar establecidos utilizados en todos los laboratorios de investigación del consorcio ImmunoStroke.

<table><tbody><tr><td>45&deg; rampa</td><td>H& S Kunststofftechnik</td><td></td><td>altura: 18 cm</td></tr><tr><td>5/0 amenaza</td><td>Pearsalls</td><td>10C103000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Jeringa</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma Ciencias de la Vida 695092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para isoflurano</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen pomada</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J ratones</td><td>Charles Abrazadera</td><td>de 000664</td><td></td>de río</tr><tr><td></td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Clip</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de clip</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Cotons</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violeta</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos</td><td>Doccol</td><td>602112PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>Pinza angular fina 45</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina</td><td>FST</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento</td><td>Orechseln</td><td>BSI-112</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento endurecedor</td><td>Drechseln & Mehr</td><td>BSI-151</td><td></td></tr><tr><td>Manta calefactora</td><td>FHC DC Temperature Controller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler</td><td>Perimed</td><td>PF 5010 LDPM, Periflux System 5000</td><td></td></tr><tr><td>Laser Doppler sonda</td><td>Perimed</td><td>91-00123</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato pH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuperación</td><td>Mediheat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit medio de montaje</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Filamentos recubiertos de silicona</td><td>Doccol</td><td>602112PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Portaobjetos Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras de muelle</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery

El accidente cerebrovascular es la tercera causa más común de mortalidad y la principal causa de discapacidad adquirida en adultos en los países desarrollados. Hasta la fecha, las opciones terapéuticas se limitan a una pequeña proporción de pacientes con accidente cerebrovascular dentro de las primeras horas después del accidente cerebrovascular. Se están investigando ampliamente nuevas estrategias terapéuticas, especialmente para prolongar la ventana de tiempo terapéutico. Estas investigaciones actuales incluyen el estudio de importantes vías fisiopatológicas después del accidente cerebrovascular, como la inflamación posterior al accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Durante la última década, ha habido una creciente preocupación por la escasa reproducibilidad de los resultados experimentales y los hallazgos científicos entre los grupos de investigación independientes. Para superar la llamada "crisis de replicación", se necesitan urgentemente modelos estandarizados detallados para todos los procedimientos. Como un esfuerzo dentro del consorcio de investigación "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/), se propone un modelo de ratón estandarizado de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAo). Este modelo permite la restauración completa del flujo sanguíneo tras la eliminación del filamento, simulando la lisis de coágulos terapéutica o espontánea que se produce en una gran proporción de accidentes cerebrovasculares humanos. El procedimiento quirúrgico de este modelo de accidente cerebrovascular de "filamento" y las herramientas para su análisis funcional se muestran en el video adjunto.

El modelo aquí descrito es una modificación del modelo de trazo de "filamento" comúnmente utilizado, que consiste en introducir un filamento recubierto de silicio a través del ECA para bloquear transitoriamente el origen del MCA(Figura 1). Después de retirar el filamento, solo el flujo sanguíneo en la ECA se detiene permanentemente, lo que permite la recanalización completa del CCA y el ICA. Esto permite una adecuada reperfusión del cerebro (Figura 2), similar a...

Diferentes modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) se utilizan en la investigación experimental del accidente cerebrovascular. Aquí, se describe un modelo experimental de accidente cerebrovascular de MCAo transitorio a través de la arteria carótida externa (ECA), que tiene como objetivo imitar el accidente cerebrovascular humano, en el que el trombo cerebrovascular se elimina debido a la lisis o terapia espontánea del coágulo.

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options ...

En el modelo de filamento descrito aquí, la restauración completa del flujo sanguíneo y su registro, son requisitos para garantizar una afluencia producible entre ratones, especialmente en estudios traslacionales de accidente cerebrovascular. Este modelo tiene dos ventajas principales en comparación con otros modelos de carrera descritos anteriormente. No se requiere craneotomía y se logra una reperfusión completa del vaso sanguíneo.El modelo de filamento es una intervención quirúrgica compleja que implica la manipulación del proceso de diferentes arterias. La visualización y explicación de todos estos son pasos pequeños pero importantes, podrían acelerar el período de aprendizaje de los neurocirujanos. Conecte la manta térmica para mantener la temperatura del área de operación y la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 grados centígrados.Prepare tijeras y fórceps en autoclave, solución de etanol al 70% y ungüento para ojos dexpantenol, y mantenga varias piezas de algodón y sutura de poliéster trenzado recubierto five O, listos para usar. Prepare una solución salina al 0,9% en una jeringa de un mililitro sin aguja para mantener hidratado el sitio de la incisión. Prepare un soporte para la sonda Doppler láser cortando la punta de una punta de pipeta de 10 microlitros.Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, colóquelo en una posición prona en el área de operación. Inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos. Después de desinfectar el sitio quirúrgico, corte este cuero cabelludo entre la oreja izquierda y el ojo para exponer el hueso del cráneo.A continuación, corte y retire el músculo temporal para visualizar las múltiples arterias cerebrales o MCA debajo del cráneo. Fije la parte exterior de la punta que sostiene la sonda Doppler láser o la fibra en la parte superior del MCA izquierdo con pegamento y cierre la piel para que la piel también esté pegada. Aplique de dos a tres gotas de pegamento endurecedor para acelerar el proceso.Asegúrese de que la fibra Doppler láser no esté pegada y se pueda quitar fácilmente del soporte de la punta en cualquier momento. Gire el ratón a la posición supina, luego coloque el hocico en el cono de anestesia y fije las patas con cinta adhesiva. Desinfecte la piel y el cabello que rodea el pecho y haga una incisión en la línea media de dos centímetros de largo en el cuello.Use fórceps para separar la glándula submandibular de la piel y el músculo esternomastoideo. Use retractores para exponer el campo quirúrgico y encontrar la arteria carótida común izquierda o CCA. Diseccionar el CCA libre de tejido conectivo y nervios circundantes sin dañar el nervio vago y realizar una ligadura transitoria antes de la bifurcación.Diseccionar la arteria carótida externa o ECA y atar un nudo permanente en la parte visible más distal. Coloque otra sutura debajo del ECA y cerca de la bifurcación, luego prepare un nudo suelto para usarlo más tarde. Diseccionar la arteria carótida interna o ICA y colocar un clip microvascular sobre ella unos cinco milímetros sobre la bifurcación.Asegúrese de no dañar el nervio vago. Luego corte un pequeño orificio en el ECA entre las ligaduras apretadas y sueltas, asegurándose de no cortar todo el ECA. Introduce el filamento y avanza hacia el CCA.Apriete la ligadura suelta en el ECA alrededor del lumen para asegurar momentáneamente el filamento en esa posición. Quitar el clip microvascular y prevenir el sangrado. Después de retirar el clip microvascular, inserte el filamento a través del ICA hasta que se alcance el origen del MCA.Fije el filamento en esta posición apretando aún más el nudo alrededor del ECA. Registre los valores doppler del láser antes y después de la inserción del filamento. Retire el retractor y reubique el músculo esternomastoideo en la glándula submandibular antes de suturar la herida.Retire la sonda Doppler láser y coloque al animal en una cámara de recuperación a 37 grados centígrados durante una hora. Coloque al ratón en posición prona en el área de operación con su hocico en la máscara de anestesia, luego fije las patas del animal con cinta adhesiva. Inserte la sonda Doppler láser en el soporte de la sonda.Retire la sutura de la herida y use fórceps para separar la piel, la glándula submandibular y el músculo esternomastoideo. Use retractores para exponer el campo quirúrgico. Afloje la sutura ECA que aprieta el filamento y tire suavemente del filamento.Evite dañar el recubrimiento de caucho de silicona del filamento durante la extracción. Registre los valores doppler del láser antes y después de la extracción del filamento. Ate firmemente la sutura ECA y confirme el aumento del flujo sanguíneo cerebral en el dispositivo Doppler láser.Abra la ligadura transitoria antes de la bifurcación del CCA para restaurar el flujo sanguíneo completo. Retire el retractor y reubique el músculo esternomastoideo en la glándula submandibular antes de suturar la herida. Luego, coloque al animal en una cámara de recuperación a 37 grados centígrados durante una hora para recuperarse de la anestesia.Después de la recuperación, los ratones regresan a sus jaulas en una habitación con temperatura controlada y cuidan a los animales agregando gránulos de comida húmeda e hidrogel en pequeñas placas de Petri en el piso de la jaula e inyectan analgesia cada 12 horas hasta el tercer día después de la cirugía. Una vez que se restaura el flujo sanguíneo en el CCA después de eliminar el filamento, se produce una reperfusión completa del cerebro, que es similar a la situación observada después de una trombectomía mecánica exitosa en pacientes humanos. Los animales con accidente cerebrovascular presentaron un cambio significativo en la puntuación neuro compuesta y focal, pero no en la puntuación neuro general en comparación con los animales simulados.El volumen de infarto recuperado también se realizó mediante tinción de violeta cresol de secciones cerebrales seriadas coronales 24 horas después de la inducción del accidente cerebrovascular. El área de la lesión incluye la corteza somatosensorial y motora, así como las estructuras subcorticales, como el cuerpo estriado. La media del volumen de infarto fue de 61 a 62 milímetros cuadrados, lo que representa el 48% del hemisferio cerebral afectado.Es importante realizar una disección adecuada del CCA, ECA y RCA sin causar daño al tejido adyacente, especialmente al nervio vago, para tener una buena visualización de todas las estructuras, y poder insertar el filamento y ocluir el origen MCA.

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Investigación

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Neurociencia

Oclusión filamentosa de la arteria cerebral media es un modelo común para el estudio de ACV isquémico en los ratones.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Se demuestra en el video de un método para producir una oclusión de arteria cerebral media en ratones adultos con un monofilamento intraluminal. También mostrará cómo evaluar la extensión del infarto cerebral por el cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) tinción.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

El intraluminal de arteria cerebral media oclusión (MCAO) es el modelo más empleado entre los modelos experimentales de ictus isquémico. Aquí vamos a demostrar todo el modelo en detalle con la guía de la flujometría láser Doppler, y sus resultados representativos.

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.

Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

Este video describe el procedimiento para desarrollar un accidente cerebrovascular transitorio en un modelo murino utilizando la oclusión de la arteria cerebral media basada en filamentos recubiertos de silicona. El modelo desarrollado imita el accidente cerebrovascular humano, lo que ayuda a investigar nuevas estrategias terapéuticas para tratar el accidente cerebrovascular.

Modelo de accidente cerebrovascular transitorio basado en la inserción de filamentos: un procedimiento quirúrgico para realizar la oclusión de la arteria cerebral media en el cerebro murino

Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Obstrucción de filamento intraluminal de la arteria cerebral media es el modelo más frecuentemente utilizado en vivo del movimiento experimental en roedores. Una alternativa quirúrgica para permitir la reparación de la arteria carótida común se realiza aquí, lo que permite la reperfusión de la arteria carótida común y una reperfusión completa para el territorio de la arteria cerebral media.

Oclusión de la arteria Cerebral Media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones

Este protocolo demuestra un modelo único de brazada de ratón con un infarto de tamaño medio y una excelente tasa de supervivencia. Este modelo permite a los investigadores preclínicos de accidentes cerebrovasculares extender la duración de la isquemia, utilizar ratones de edad avanzada y evaluar los resultados funcionales a largo plazo.

Un modelo de oclusión transcraneal modificado de la arteria cerebral media para estudiar los resultados del accidente cerebrovascular en ratones ancianos

Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.

Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

En este trabajo, presentamos un protocolo para establecer un modelo de oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) mediante electrocoagulación transcraneal en ratones C57BL/6J y evaluamos el comportamiento neurológico y las características histopatológicas posteriores.

Inducción de ictus isquémico agudo en ratones mediante la técnica de oclusión de la arteria media distal

El protocolo actual describe un modelo de rata de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media que preserva la estructura anatómica de los vasos cerebrales sin causar daño.

Un modelo en ratas de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media sin dañar la estructura anatómica de los vasos cerebrales

Aprende a modelar el accidente cerebrovascular en ratones mediante oclusión transitoria de la arteria cerebral media con técnica de filamento. Este protocolo estandarizado permite la restauración completa del flujo sanguíneo cerebral.

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa (Video) | JoVE Journal

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

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