Name: Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Aprende a detectar agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) en lisados celulares y células vivas. Este protocolo estandarizado permite analizar proteínas asociadas a ELA como TDP25 y SOD1 mutante.

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A.K. recibió el apoyo de una Beca de Ayuda para la Investigación Científica (C) (#18K06201) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), mediante una subvención de la Fundación Nakatani para contramedidas contra nuevas infecciones por coronavirus, mediante una subvención de la Oficina de La Universidad de Hokkaido para el Desarrollo de Futuros Líderes de Investigación (L-Station), y una subvención en ayuda de la Fundación Hoansha. M. K. recibió el apoyo parcial de una Beca JSPS de Investigación Científica sobre Áreas Innovadoras "Química para Biosistemas de Hacinamiento Multimolecular" (#20H04686), y una Subvención JSPS de Ayuda para la Investigación Científica en Áreas Innovadoras "Física de la Información de asuntos vivos" (#20H05522).

1. Materiales y reactivos
<ol><li>Utilice soluciones libres de pirogénicos y medios para el cultivo celular (Tabla 1).</li>
	<li>Preparar soluciones para el experimento bioquímico utilizando agua ultrapura y utilizar como DNase / RNase libre.</li>
	<li>Seleccione un FBS adecuado para la referencia cultural de celda con un proceso de comprobación de lote. Puesto que el lote FBS seleccionado cambia regularmente, el catálogo y el número de lote para FBS no se pueden representar aquí.</li>
	<li>ADN plásmido<ol>
<li>Preparar pmeGFP-N15 para la expresión monómera eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 para la expresión GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 para la expresión SOD1-G85R-GFP; y pCAGGS8 como portador. NOTA: meGFP es una variante monómera portadora de mutación A206K de GFP mejorado (eGFP). TDP25 es un fragmento de terminal C asociado a ELA de TDP-43. SOD1-G85R es un mutante asociado a la ELA de SOD1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tensión celular<ol>
<li>Utilice células de neuroblastoma murino Neuro2a. NOTA: Las células neuro2a tienen alta eficiencia de transfección y proteínas exógenas altamente exprés. Para la expresión TDP25, se requieren cepas celulares con eficiencias de alta expresión como células Neuro2a o HEK293. En las células HeLa, TDP25 no fue capaz de expresarse eficientemente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivo celular y transfección
<ol><li>Preparar un plato de plástico de 100 mm que cultiva células Neuro2a semiconfluentemente en el medio de crecimiento normal. NOTA: Es necesario incubar a 37 °C durante aproximadamente 48-72 horas después de la siembra anterior hasta que se alcance la semiconfluencia.</li>
	<li>Retire el medio.</li>
	<li>Añadir 0,5 ml de solución trypsin-EDTA en el plato de cultivo celular e incubarlos a 37 °C durante 1 minuto.</li>
	<li>Añadir 9,5 ml de medio de crecimiento normal en el plato y suspender las células separadas.</li>
	<li>Usando Trypan blue para manchar las células muertas, cuente el número de celdas usando un contador de celdas o manualmente. A continuación, diluya las células en medio de cultivo (1,0 × 105/ml).</li>
	<li>Agregue 2 ml de suspensión celular en un plato de plástico de 35 mm para lisis celular o un plato base de vidrio para la medición de células vivas.</li>
	<li>Incubar el plato a 37 °C durante 1 día.</li>
	<li>Comience los siguientes preparativos 15 minutos antes del día de la transfección.</li>
	<li>Prepare dos tubos de 1,5 ml y agregue 100 μL de Opti-MEM I a cada tubo.</li>
	<li>En el primer tubo, mezcle 1,0 μg de ADN plásmido (Solución A). En el segundo tubo, mezclar 2,5 μL de Lipofectamina 2000 (Solución B). NOTA: Para mantener la eficiencia de transfección, mantenga la cantidad total de ADN igual. Para reducir el nivel de expresión para la medición del FCS en células vivas, la cantidad fraccionada de ADN plásmido para la expresión proteica debe disminuir (por ejemplo, 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R y 0,8 μg de mezcla de pCAGGS). Además, mantener la misma relación entre el volumen de lipofectamina 2000 y la cantidad de ADN plásmido.</li>
	<li>Mezcle suavemente la solución A y B añadiendo una en cualquiera de los tubos y, a continuación, incubarla durante 1 minuto a temperatura ambiente (Solución C).</li>
	<li>Agregue la solución C al medio de cultivo; e incubar las células durante 24 h a 37 °C.</li>
</ol>3. Lisis celular e intercambio medio
<ol><li>Compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio de rutina.</li>
	<li>Retire el medio del plato.</li>
	<li>Añadir 2 ml de PBS a 25 °C para lavar el medio. Retire el PBS.</li>
	<li>Coloque el plato en una placa de aluminio sobre el hielo triturado. NOTA: Utilizamos una placa de aluminio de 1 mm de espesor cortada en una tienda de herramientas dominical o comercialmente disponible como equipo de laboratorio.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de lisis a 4 °C. Agitar el plato suavemente para que el tampón se distribuya uniformemente en la parte inferior del plato.</li>
	<li>Raspa el plato usando un rascador de células y recupera el lysate con restos celulares sin disuelto en un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrífuga la solución a 20.400 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Recupera el sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml y mantenlo a 4 °C o sobre hielo. NOTA: No congele el lysate.</li>
	<li>Para las mediciones de células vivas, reemplace el medio antes de la medición. Compruebe el accesorio de celda utilizando un microscopio de contraste de fase. Confirme la expresión utilizando un microscopio de fluorescencia.</li>
</ol>4. Calibración de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)
<ol><li>Inicie el sistema y ejecute el software de operación. Encienda el argón+ láser (458/477/488/514 nm). Estabilice el sistema al menos durante 30 min.</li>
	<li>Configurar la trayectoria óptica: Divisor de haz principal: HFT488; Espejo dicrónico: NFT600; Filtro de barrera de fluorescencia: un filtro de paso de banda 505-540 (BP505-540); Detector: fotodiodo de avalancha (APD)).</li>
	<li>Ajuste el tamaño del agujero introduciendo el valor directamente (66 μm; 1 unidad ventilada).</li>
	<li>Añadir la solución Rhodamine 6G (Rh6G) en un pozo de la cámara de vidrio de la cubierta en el escenario.</li>
	<li>Añade el agua ultrapura de inmersión sobre el objetivo. No utilice el aceite de inmersión.</li>
	<li>Ajuste la cámara en el escenario del microscopio. Mueva el escenario a la posición adecuada.</li>
	<li>Concéntrese en la superficie superior del vidrio midiendo la luz dispersa de la superficie de vidrio. Después de bajar la lente objetivo hacia la parte inferior, gire la perilla de enfoque en el sentido de las agujas del reloj para ajustarse. NOTA: Compruebe la dirección de giro de la perilla de enfoque porque es opuesta entre las fabricadas en Japón y Alemania.</li>
	<li>Levante el punto focal 200 μm por encima de la superficie superior del vidrio para observar el interior de la solución.</li>
	<li>Haga clic en la velocidad de recuento y supervise la tasa de recuentos de fotones.</li>
	<li>Aumente gradualmente el valor de los filtros ajustables acousto-ópticos (AOTF) (por ejemplo, transmisión láser de excitación) para que el valor de la velocidad de recuento sea superior a 10 kHz.</li>
	<li>Haga clic en Ajuste de agujero y abra el asistente de ajuste de agujero. Encuentra la posición del agujero con el mayor número (un pico) de fotones en el eje x e y.</li>
	<li>Gire el anillo de corrección de la lente objetivo para que el valor de recuentos por molécula (CPM) sea el más alto. NOTA: Dado que el espesor del vidrio de la cubierta de la cámara especificada aquí es de 0,12-0,17 mm, el anillo de corrección está alrededor de su mínimo o a pocos giros de él, donde el CPM está en su máximo.</li>
	<li>Disminuya el valor AOTF gradualmente para que el valor CPM se convierta en 2-3 kHz.</li>
	<li>Adquiera la función de autocorrelación (ACF) de Rh6G para 90 s.</li>
	<li>Una vez completada la medición, haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas.</li>
	<li>Seleccione un modelo para la difusión tridimensional (3D) de un componente con un estado de trillizos. NOTA: El Rh6G es monodisperse y difuso de un componente con un estado de trillizos.</li>
	<li>Ajuste la hora de inicio de la conexión moviendo la línea roja. Haga clic en Ajustar todo y compruebe la desviación de ajuste. Después de realizar el ajuste de curva, asegúrese de que el tiempo de difusión (DT) y el parámetro de estructura (SP) estén aproximadamente en el rango de 20-30 μs y 4-8, respectivamente.</li>
	<li>Recuerde el valor del parámetro estructural. Utilice el valor sp para el análisis de ajuste de curvas de todas las CA medidas el mismo día, en las mismas condiciones ópticas, y utilizando el mismo tipo de plato base de vidrio o vidrio de cubierta con cámara en el escenario del microscopio.</li>
</ol>5. Medición del FCS en el lisato celular
<ol><li>Preparar los lysates de celda (ver arriba).</li>
	<li>Coloque el lysate en la cámara de vidrio de la cubierta. Coloque una tapa para evitar el secado y la tapa del escenario para un sombreado ligero.</li>
	<li>Establezca la condición de adquisición, la potencia láser, el tiempo de medición y las repeticiones.</li>
	<li>Haga clic en Contar velocidad y ajuste el valor AOTF del láser para que el valor CPM se convierta en más de 1 kHz.</li>
	<li>Realice una medición de prueba durante 1 min. Compruebe si el ACF calculado muestra una amplitud positiva y una decaimiento suave.</li>
	<li>Realice la medición principal durante 5 min. NOTA: El tiempo total de medición se incrementa gradualmente hasta que la forma del ACF no cambia incluso si se aumenta el tiempo de medición.</li>
	<li>Haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas.</li>
	<li>Seleccione un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos. Recuerde introducir el valor del SP y cambiar su configuración a "Fijo" no "Libre" antes de hacer clic en Ajustar todo.</li>
	<li>Exporte la tabla ajustada como un archivo de texto delimitado por tabulaciones.</li>
	<li>Si es necesario, exporte el registro de tasa ACF y Count como un archivo de texto delimitado por tabulaciones.</li>
</ol>6. Medición del FCS en células vivas
<ol><li>Reemplace el medio por uno nuevo antes de la medición.</li>
	<li>Utilice una incubadora de etapa de calor. Poner el plato de cultivo celular en el escenario del microscopio.</li>
	<li>Confirme el enfoque y la posición utilizando el micrope confocal. Seleccione la celda de medición. Acerque y ajuste la posición de la celda. Adquiera imágenes de fluorescencia de una célula que expresa GFP utilizando el modo de velocidad de escaneo lento.</li>
	<li>Seleccione una posición de medición FCS utilizando Posición en la sección "FCS".</li>
	<li>Seleccione al menos un punto de medición FCS utilizando un punto de mira (Figura 1).</li>
	<li>Mida el ACF durante 1 min. NOTA: Debido a que las proteínas fluorescentes tienden a ser fotoblechadas en células vivas debido al movimiento lento en comparación con la solución, el tiempo de medición debe ser mínimo. Generalmente es difícil obtener ACF en la célula tan suavemente como las mediciones de la solución porque la medición prolongada conducirá a la fotobleaching de proteínas fluorescentes.</li>
	<li>Haga clic en Ajustar para realizar el análisis de ajuste de curvas utilizando un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos. NOTA: Para las mediciones de células vivas, un modelo para difusión 3D de dos componentes con un estado de trillizos sería mejor porque es empíricamente difícil disminuir el valor chi-cuadrado con un modelo de difusión 3D de un componente debido a la existencia de varios componentes móviles en la célula viva. Pero incluso utilizando un modelo para la difusión 3D de tres componentes, los componentes de difusión generalmente no están separados en comparación con el uso del modelo para dos componentes.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
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<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
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<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

Estos autores no tienen conflictos de intereses.

En cuanto a la calibración del sistema antes de las mediciones, se deben utilizar los mismos cristalerías que la utilizada para medir la muestra (por ejemplo, la cámara de vidrio de cubierta de 8 pozos para el lisato celular y la placa base de vidrio de 35 mm para células vivas). Debido a la adsorción de Rh6G en el vidrio, su concentración efectiva a veces puede disminuir. Si es así, se debe utilizar una solución Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, solo para el ajuste del agujero. Se deben evitar tasas de recuento de ...

Se sabe que las agregaciones proteicas que involucran trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, etc.en 1, son tóxicas y perturbarían la homeostasis proteica (proteostasis) en las células y órganos, que luego podrían conducir al envejecimiento2. Se espera que el aclaramiento de la agregación de proteínas sea una estrategia terapéutica; sin embargo, todavía no se han establecido productos químicos que prevengan la formación de agregación de proteínas y degraden los agregados proteicos (por ejemplo, moléculas pequeñas o fármacos). Además, la forma en que la agregación de proteínas ejerce toxicidad sigue siendo esquiva. Por lo tanto, para promover proyectos de investigación relacionados con la agregación de proteínas, es importante introducir procedimientos de alto rendimiento para simplemente detectar la agregación de proteínas. La detección de agregación de proteínas utilizando anticuerpos que reconocen la conformación de la agregación de proteínas y el tinte fluorescente específico de la agregación se ha utilizado ampliamente3. Sin embargo, es difícil detectar la agregación, especialmente en las células vivas utilizando tales procedimientos clásicos. 
La transferencia de energía por resonancia Förster (FRET) es un procedimiento para detectar la agregación de proteínas y los cambios estructurales. Sin embargo, FRET es incapaz de analizar la dinámica proteica (por ejemplo, difusión y oligomerización de proteínas en células vivas)3. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo simple para detectar la agregación de proteínas en solución (por ejemplo, lisato celular) y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que mide la propiedad de difusión y el brillo de moléculas fluorescentes con sensibilidad de molécula única4. FCS es un método de conteo de fotones mediante el uso de un microscopio confocal de escaneo láser (LSM). Utilizando un detector de fotones altamente sensible y el cálculo de la función de autocorrelación (ACF) del tiempo de llegada del fotón, se mide el paso a través del tiempo y el brillo de las moléculas fluorescentes en el volumen de detección. La difusión se ralentiza con un aumento del peso molecular; por lo tanto, la interacción intermolecular se puede estimar utilizando FCS. Aún más potente, un aumento en el brillo de la molécula fluorescente indica la homo-oligomerización de las moléculas. Por lo tanto, fcs es una herramienta poderosa para detectar dicha agregación de proteínas.

<table><tbody><tr><td>0.25% (p/v) Tripsina-1 mmol/L EDTA&middot; Solución de 4Na con rojo de fenol (tripsina-EDTA)</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Platos de plástico de 100 mm</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Plato base de vidrio de 35 mm</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td>Para la medición de células vivas</td></tr><tr><td>Platos de plástico de 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aluminio</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td><td>Carl Zeiss</td><td>Objetivo</td>Raspador de <td></td></tr><tr><td>células</td><td>Sumitomo Baquelita Co., Ltd.</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Membrana filtrante de acetato de celulosa (0,22 mm)</td><td>Advantech Toyo</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de cubierta de vidrio 8 pocillos</td><td>IWAKI</td><td>5232-008</td><td>Para la medición de soluciones</td></tr> Medio de águila <tr><td>modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Medio basal</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>biosera</td><td></td><td>Verificación de lote requerida</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Sistema FCS</td></tr><tr><td>Neuroblastoma murino Células Neuro2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>RIKEN</td><td>RDB08938</td><td>ADN plasmídico para el portador de transfección</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina (&times; 100 )</td> <td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>pmeGFP-C1-TDP25</td><td></td><td></td><td>ADN plasmídico para TDP25 marcado con eGFP monomérico</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>ADN plasmídico para la expresión de monómeros eGFP</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>ADN plásmido para el mutante G85R ligado a ALS de SOD1 marcado con cóctel de</td></tr><tr><td>inhibidores de proteasa</td> eGFP monomérico <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer (AD), la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Huntington (EH), etc. Para detectar y analizar oligomeros o agregados de proteínas solubles o difusas, se ha utilizado espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que puede detectar la velocidad de difusión y el brillo de una sola partícula con una sola sensibilidad a moléculas. Sin embargo, el procedimiento adecuado y el know-how para la detección de agregación de proteínas no han sido ampliamente compartidos. Aquí, mostramos un procedimiento estándar de medición del FCS para las propiedades de difusión de proteínas propensas a la agregación en lysato celular y células vivas: fragmento carboxil-terminal de 25 kDa asociado al ELA de ADN TAR/proteína de unión al ARN 43 kDa (TDP25) y desmutasa de superóxido 1 (SOD1). Los resultados representativos muestran que una parte de los agregados de proteína fluorescente verde (GFP) etiquetados TDP25 se incluyó ligeramente en la fracción soluble de neuroblastoma murino Neuro2a lisato celular. Además, el SOD1 etiquetado con GFP que lleva mutación asociada a la ELA muestra una difusión más lenta en las células vivas. En consecuencia, aquí introducimos el procedimiento para detectar la agregación de proteínas a través de su propiedad de difusión utilizando FCS.

Realizamos la medición fcs de GFP-TDP25 en lisato celular y SOD1-G85R-GFP en células vivas. En ambos casos, se pudo adquirir una amplitud positiva y AIF suaves. Hemos demostrado que una porción de GFP-TDP25 expresada en células Neuro2a fue recuperada en la fracción soluble bajo la condición indicada6. En la fracción soluble del lisato celular, se detectaron moléculas de fluorescencia extremadamente brillantes en el registro de tasa de recuento de fotones utilizando FCS(Figura ...

Aquí introducimos un procedimiento para medir oligomeros proteicos y agregación en lysato celular y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia.

Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

El mejor principio de la espectroscopia de correlación de fluorescencia, FCS, se inventó inicialmente en la década de 1970. En la década de 1990, se establecieron mejoras importantes y muchas para el FCS mediante la combinación con una microscopía de aparatos confocales. Desde entonces, fcs se ha utilizado para muchas aplicaciones químicas y de curación de virus, tales como interacciones moleculares y análisis de agregación de proteínas.La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos. El brillo de la fluorescencia son partículas individuales en acción de tamaños moleculares explicados por las propiedades de difusión. Es muy importante en la medición de las agregaciones de proteínas porque puede determinar los ciclos de vida proyectados de las moléculas, pero también distinguir la polimerización homo o hetero.Aquí, presentamos un procedimiento para medir la difusión de esclerosis lateral amiotrófica asociada con proteína de forma agregada utilizando FCS en liatos celulares y células vivas. Prepare un plato de plástico de 100 milímetros creciendo la célula Neuro2a sentado cómodamente en el medio de crecimiento normal. Confirme la confluencia de la celda.Retire el medio. Agregue 3,5 mililitros de solución Trypsin-EDTA en el tercer plato del cartucho e incubarlos a 37 grados centígrados durante un minuto. Añadir 9.5 mililitros medio de crecimiento normal en el plato y suspenderlos.La suspensión celular se mezcla con tripa azul para manchar las células muertas. Agregue la suspensión a la diapositiva de recuento de celdas. Cuente el número de celdas que utilizan el contador de celdas o manualmente.Compruebe el número de celda en vivo y su viabilidad. Diluir la célula en el medio contado a 1,0 por 10 a la potencia de 5 por mililitro. Agregue dos mililitros de suspensión celular en el plato de plástico de 35 milímetros para lisis celular o espacio de crecimiento para la medición de células vivas.Incubar el plato a 37 grados centígrados por un día. Al día siguiente, prepare la mezcla de ADN plásmido y los reactivos de transfección. Agregue la mezcla de transfección al medio contada por células e incubar las células durante 24 horas.Un día después. Compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio de rutina. Se pueden ver los cuerpos de ingredientes TDP25 muy brillantes en las células.La lisis celular debe realizarse en el banco bioquímico. Retire el medio del plato. Añadir dos mililitros de PBS a 25 grados centígrados para lavar como medio.Retire el PBS. Coloque el plato en una placa de aluminio en la parte superior del hielo triturado. Inmediatamente, agregue el amortiguador de lisis de 200 microlitros en el plato.Raspa el plato usando un rascador de celdas. Recupere el lysate con restos celulares no resueltos en un nuevo tubo de 1,5 milímetros. Centrífuga el lysate a cuatro grados centígrados.Para las mediciones de células vivas, reemplace el medio por uno nuevo antes de la medición. Compruebe el accesorio de celda utilizando un microscopio de contraste de fase. Además, compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio de fluorescencia.Utilice un sistema FCS combinado con microscopio confocal. Encienda el láser de 488 nanómetros. Estabilizar el sistema, al menos, durante 30 minutos.Configure la ruta óptica. Utilice un láser de 488 nanómetros para la luz instantánea. Utilice un divisor de haz adecuado y medidores dichroic.Y también, fusibles de fluorescencia. Por lo general, usaremos cámaras de vidrio de cubierta para calibración y mediciones de soluciones. Cuidado, toma la cámara de reloj de cubierta.Coloque la superficie de vidrio en el papel de cribado de la lente. Vierta la calibración FCS. Añadir la solución Rhodamine 6G en, así.Añade el agua ultrapura al objetivo. No utilice el aceite. Ajuste la cámara en el escenario del microscopio.Mueva el escenario a la posición adecuada. Cree el ajuste del agujero y abra el asistente de ajuste del agujero. Monitoree la tasa de recuento de fotones como movimiento grueso del agujero para la dirección X.La posición más brillante estaba determinada con razón. A continuación, supervise la tasa de recuento de fotones como movimiento fino. La posición más brillante se determinó con éxito Esta es la posición del agujero para la dirección X.De la misma manera, busque la posición más brillante del agujero para la dirección y. La posición más brillante para la dirección y también se determinó con éxito. Agravar la posición x e y del agujero.Es mejor ajustar la posición del agujero antes de la medición de cada día. Cuando se cambia la ruta de acceso en vivo, la posición del agujero debe ajustarse de nuevo. Cree una tasa de recuento y supervise la velocidad de recuento de teléfono.Cambie al modo de supervisión CPM. Cuente el anillo de corrección del objeto que ejecutó para que el valor CPM sea el más alto. Cierre la ventana de velocidad de recuento.Comience con la medición de la solución Rhodamine 6G. Una vez completada la medición, haga clic en el ajuste para realizar el análisis de ajuste de curva. Seleccione un modelo para el ajuste de la función de correlación anterior.Para Rhodamine 6G, seleccione el modelo para difusión de 1 componente y 3 dimensiones con un estado de trillizos. Ajuste la hora de inicio de la conexión moviendo la línea roja. Haga clic en Ajustar todo para iniciar el cálculo del empalme.Compruebe la desviación de ajuste. Asegúrese de que los lados estén registrados y sean negativos, alrededor de cero. Compruebe los valores ajustados.Asegúrese de que el tiempo de difusión esté aproximadamente en el rango de 20-30 microsegundos. Además, el parámetro estructural es de cuatro a ocho. Abra el panel de ajuste y seleccione un modelo para la medición.Introduzca el mismo valor de parámetro estructural en el modelo para la muestra en el panel de ajuste. Asegúrese de que el tipo debe establecerse como Fijo. Medición GFP-TDP25 en lysate celular.Coloque el lysate en la cámara de vidrio de cubierta. Coloque la tapa para evitar el secado del lisato. Coloque la tapa del escenario para un sombreado ligero.En el panel de adquisición, establezca la potencia láser, el tiempo de medición y sus repeticiones. Comience la adquisición. Se observó un pico.Se volvió a observar un pico. El pico indica moléculas brillantes pasadas a través del cuerpo de detección. Los picos indican oligomeros solubles o agregados.Cree un ajuste para realizar el análisis de ajuste de curvas. Seleccione el modelo para difusión de 2 componentes y 3 dimensiones con estado de trillizos. Ajuste la hora de inicio de la conexión.Haga clic en ajustar todo. Compruebe los valores ajustados. SOD1-G85R etiquetado con medición GFP en una celda viva.A diferencia de la medición de la solución, recomiendo usar la incubadora de etapa de calor. Poner el plato de culto celular en el escenario del microscopio. Confirme el enfoque y la posición utilizando el ocular.Seleccione una celda de medición. Acerque y ajuste la posición de la celda mediante un modo de escaneo rápido. Adquiera la instantánea de las celdas utilizando el modo de velocidad de escaneo lenta.Seleccione una posición de medición fcs utilizando la herramienta Posición. El punto de mira indica la posición de medición. Inicie la medición.La ligera disminución del registro de tasa de recuento de fotones sugiere la fotobleaching de GFP. Realice el ajuste de curva. Se muestran los resultados representativos de GFP-TDP25 en el lysate celular.El gráfico superior un registro de la tasa de recuento de fotones. Donde hay flechas es un pico, lo que sugiere oligómeros solubles y agregados. El gráfico central representa la función de correlación anterior.La línea gris muestra la función de correlación baja y antigua. La línea magenta muestra la función ajustada. Las líneas punteadas indican los tiempos de inicio y finalización para el montaje.La tabla inferior muestra el valor ajustado. A continuación, se muestran los resultados representativos de SOD1-G85R-GFP en una celda en vivo. El gráfico superior representa un registro de nuestra tasa de recuento de fotones.Se observó la disminución gradual de la tasa de recuento de fotones registrados, lo que sugiere fotobleaching de crecimiento de GFP para diferentes mediciones. Esto se debe a la velocidad de difusión lenta en las células vivas. El gráfico central representa la antigua función de correlación de SOD1.La línea gris muestra la función de correlación baja y antigua. La línea magenta muestra la función ajustada. Las líneas punteadas indican los tiempos de inicio y finalización con el empalme.La tabla inferior muestra los valores ajustados. Aquí te mostramos este procedimiento para medir la difusión de cada célula asociada TDP-25 en el lysato celular y todo mutante de SOD1 en células vivas usando FCS. Los oligomeros solubles y la agregación en el lisato celular a menudo se pueden observar como picos o ráfagas.Por otro lado, en las células vivas, tales picos rara vez se observan, excepto por estructuras vivas posiblemente obvias. Una especie lentamente difusible de SOD1 mutante añade brillo medio para partículas individuales como la homopolímerización SOD1 en su interior para nosotros. El procedimiento que se muestra aquí es simple y vale la pena.El FCS no contiene radiación; estado directamente inactivo. Es sólo tu,y nuestra.empatía de imaginación.

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Investigación

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