Name: Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a seleccionar nanocuerpos inhibitorios dirigidos a transportadores mediante electrofisiología SSM. Este método permite el cribado de bibliotecas de nanocuerpos sin necesidad de sustratos marcados.

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Agradecemos a Cedric A. J. Hutter y Markus A. Seeger del Instituto de Microbiología Médica de la Universidad de Zurich, y a Gonzalo Cebrero de Biozentrum de la Universidad de Basilea por su colaboración en la generación de nanocuerpos sintéticos (sybodies). Agradecemos a Maria Barthmes y Andre Bazzone de NANION Technologies por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF) (PP00P3_170607 y NANION Research Grant Initiative a C.P.).

<ol><li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+an+antibody+molecule%3A+structure%2C+kinetics%2C+thermodynamics%2C+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641(2017).</li>
<li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216(2020).</li>
<li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li>
<li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF%2C+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296(2017).</li>
<li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li>
<li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
<li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li>
<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
<li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li>
<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
<li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).</li>
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<li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+nanobodies+%28VHH-based+single+variable+domains%29+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187(2015).</li>
<li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li>
<li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li>
<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

La técnica presentada aquí clasifica los nanocuerpos con propiedades inhibitorias y no inhibitorias dirigidas a los transportadores electrogénicos. La evaluación del transporte del sustrato es posible debido a la detección del movimiento de cargas a través del transportador incrustado en la membrana de los proteoliposomas. Algunos de los pasos críticos durante la configuración de un experimento son la reconstitución de proteínas activas en liposomas, la preparación de monocapas estables en chips SSM y la recuperación de ...

Los anticuerpos están compuestos por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras que son responsables de la unión del antígeno. Los camélidos tienen anticuerpos de cadena pesada que exhiben una afinidad similar por su antígeno cognado en comparación con los anticuerpos convencionales1,2. El dominio variable único (VHH) de los anticuerpos de cadena pesada solo conserva el potencial completo de unión al antígeno y se ha demostrado que es muy estable1,2. Estas moléculas aisladas de VHH o "nanocuerpos" se han implementado en estudios relacionados con la bioquímica de proteínas de membrana como herramientas para estabilizar conformaciones3,4,como inhibidores5,6,como agentes de estabilización7,y como artilugios para la determinación deestructuras 8,9,10 . Los nanocuerpos pueden generarse mediante la inmunización de camélidos para el preenriquecimiento de células B que codifican nanocuerpos específicos del objetivo y el posterior aislamiento de las células B, seguido de la clonación de la biblioteca de nanocuerpos y la selección por pantalla defagos 11,12,13. Una forma alternativa de generar nanocuerpos se basa en métodos de selección in vitro que se basan en la construcción de bibliotecas y la selección por pantalla de fagos, pantalla de ribosomas o pantalla de levadura14,15,16, 17,18,19,20. Estos métodos in vitro requieren grandes tamaños de biblioteca, pero se benefician de evitar la inmunización animal y favorecen la selección de nanocuerpos dirigidos a proteínas con una estabilidad relativamente baja.
El pequeño tamaño de los nanocuerpos, su alta estabilidad y solubilidad, su fuerte afinidad de antígenos, su baja inmunogenicidad y su producción relativamente fácil, los convierten en fuertes candidatos para el desarrollo de terapias21,22,23. En particular, los nanocuerpos que inhiben la actividad de múltiples proteínas de membrana son activos potenciales para aplicaciones clínicas5,24,25,26. En el caso de los transportadores de membrana, para evaluar si un nanocuerpo tiene actividad inhibitoria, es necesario desarrollar un ensayo que permita la detección de sustratos transportados y/o cosustratos. Tales ensayos generalmente involucran moléculas etiquetadas o el diseño de métodos de detección específicos del sustrato, que pueden carecer de una aplicación universal. Además, la identificación de nanocuerpos inhibitorios generalmente requiere la detección de un gran número de aglutinantes. Por lo tanto, un método que se pueda utilizar en un modo de alto rendimiento y que no dependa de sustratos etiquetados es esencial para esta selección.
La electrofisiología basada en SSM es una técnica extremadamente sensible y altamente resuelta en el tiempo que permite la detección del movimiento de cargas a través de membranas (por ejemplo, unión / transporte deiones) 27,28. Esta técnica se ha aplicado para caracterizar transportadores electrogénicos, que son difíciles de estudiar utilizando otras técnicas de electrofisiología debido al relativo bajo recambio de estas proteínas29,30,31,32,33,34,35. La electrofisiología SSM no requiere el uso de sustratos etiquetados, es adecuada para el cribado de alto rendimiento y se pueden utilizar proteoliposomas o vesículas de membrana que contengan el transportador de interés. Aquí, demostramos que la electrofisiología basada en SSM se puede utilizar para clasificar nanocuerpos dirigidos al transportador con propiedades inhibitorias y no inhibitorias. Como prueba de principio, describimos la reconstitución de un transportador bacteriano de colina en liposomas, seguido de pasos detallados para la inmovilización de proteoliposomas en los sensores SSM. A continuación, describimos cómo realizar mediciones electrofisiológicas basadas en SSM del transporte de colina y cómo determinar la concentración efectiva medio máxima (EC50). Luego mostramos cómo usar la electrofisiología basada en SSM para detectar múltiples nanocuerpos e identificar inhibidores del transporte de colina. Finalmente, describimos cómo determinar las concentraciones inhibitorias medias máximas (IC50)de nanocuerpos inhibitorios seleccionados.

<table><tbody><tr><td>Solución de 1-octadecanetiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-difitanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbente (perlas adsorbentes de poliestireno)</td><td>BioRad</td><td>#152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 Columnas de desalinización</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Membrana de 200 nm</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecilo-&szlig;-D-maltósido (DDM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr> <tr><td>(configuración SSM) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>----- </td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1 Chips de sensor único</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Extracto de Lípidos</td><td>Polares Avanti Lípidos Polares</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>Huevo PC L-&alfa;-fosfatidilcolina </td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (ssm)

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Los anticuerpos de dominio único (nanocuerpos) se han utilizado ampliamente en estudios mecanicistas y estructurales de proteínas y representan un enorme potencial como herramientas para desarrollar terapias clínicas, muchas de las cuales dependen de la inhibición de proteínas de membrana como los transportadores. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados para determinar la inhibición de la actividad de transporte son difíciles de realizar en rutinas de alto rendimiento y dependen de la disponibilidad de sustratos etiquetados, lo que complica el cribado de grandes bibliotecas de nanocuerpos. La electrofisiología de membrana sólidamente soportada (SSM) es un método de alto rendimiento, utilizado para caracterizar transportadores electrogénicos y medir su cinética e inhibición de transporte. Aquí mostramos la implementación de la electrofisiología basada en SSM para seleccionar nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a un transportador secundario electrogénico y para calcular constantes inhibitorias de nanocuerpos. Esta técnica puede ser especialmente útil para seleccionar nanocuerpos inhibitorios dirigidos a transportadores para los que no se dispone de sustratos marcados.

La electrofisiología basada en SSM se ha utilizado ampliamente para la caracterización de transportadores electrogénicos. En el protocolo presentado aquí, mostramos cómo utilizar la electrofisiología basada en SSM para clasificar los nanocuerpos dirigidos a un transportador secundario (aquí un simportador de colina bacteriana) en función de sus propiedades inhibitorias y no inhibitorias. Una de las características más útiles de esta técnica es que permite el cribado de alto rendimiento de múltiples condiciones de búfer. ...

Los nanocuerpos son herramientas importantes en biología estructural y suponen un gran potencial para el desarrollo de terapias. Sin embargo, la selección de nanocuerpos con propiedades inhibitorias puede ser un desafío. Aquí demostramos el uso de electrofisiología basada en membranas sólidas soportadas (SSM) para la clasificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a transportadores de membrana electrogénicos.

Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

El protocolo presentado se utiliza para el cribado de alto rendimiento y la identificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a transportadores electrogénicos reconstituidos en proteoliposomas o presentes en vesículas de membrana. El diseño de ensayos de transferencia puede ser difícil en múltiples casos, especialmente si no se dispone de sustratos etiquetados. Si la misma electrofisiología permite estudiar el efecto de los nanocuerpos en el transporte de prácticamente cualquier transportador electrogénico, ya que la electrofisiología SSM no requiere sustratos etiquetados.Los nanocuerpos han sido investigados por su uso en aplicaciones médicas. Esta técnica puede ayudar a detectar inhibidores potenciales dirigidos a transportadores electrogénicos específicos de humanos o patógenos humanos. Para comenzar, tome 10 tubos limpios y transfiera 10 mililitros de la membrana sólida no activada, o SSM, tampón en cada tubo.Para preparar los tampones SSM activadores, agregue el sustrato en los tubos utilizando una serie de concentraciones alrededor de la mitad de la concentración máxima esperada. Inicie el software de SSM y deje que la máquina se inicialice automáticamente. Establezca la ruta de guardado de los datos.Confirme presionando el botón OK. Seleccione el protocolo de limpieza inicial estándar en las opciones del flujo de trabajo y haga clic en ejecutar. A continuación, monte el chip recubierto de proteoliposoma en el zócalo.Mueva el brazo para bloquear el chip. Encierre el chip montado con la tapa. Seleccione el programa CapCom en el flujo de trabajo y déjelo ejecutar para determinar la conductividad y la capacitancia.Confirme que la conductividad está por debajo de cinco nanosiemens y la capacitancia está entre 15 y 35 nanofaradios antes de usarlo para la medición. Transfiera las soluciones de activación a viales y coloque los tampones en el muestreador de sonda. Transfiera el búfer no activador a un depósito y colóquelo junto al soporte del chip en la posición del depósito a la derecha.Cree un protocolo para el flujo de trabajo mediante una secuencia de solución no activante, activadora y no activante, o una secuencia BAB, en un bucle que realice tres mediciones y se mueva al siguiente búfer de activación para los 10 búferes. Utilice el caudal predeterminado de 200 microlitros por segundo con tiempos de flujo de un segundo, un segundo y un segundo para la secuencia BAB y haga clic en reproducir para iniciar la medición. Guarde el protocolo y deje que el flujo de trabajo se ejecute haciendo clic en el botón de reproducción.Luego realice el mismo experimento utilizando liposomas libres de proteínas. Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo y utilice la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación. Trazar la corriente máxima contra la concentración de sustrato para determinar el efecto medio máximo de concentración, o EC50, del sustrato a través de la regresión no lineal.Transfiera 50 mililitros del búfer SSM no activante a un tubo limpio. Agregue la colina de sustrato a una concentración final de cinco milimolares y úsela para una medición de control positiva. Transfiera 10 mililitros del búfer SSM no activador a un tubo limpio.Agregue colina de sustrato a cinco milimolares y nanocuerpo a una concentración final de 500 nanomolares. Repita el paso para cada nanocuerpo para preparar las soluciones de activación como se ha demostrado. Inicie la máquina SSM y mida la capacitancia y la conductividad del chip recubierto de proteoliposoma, como se demostró anteriormente.Transfiera la solución activadora sin un nanocuerpo a un vial y coloque el tampón en el muestreador de la sonda. Transfiera el búfer no activante sin un nanocuerpo a un depósito y colóquelo en el muestreador de la sonda. A continuación, repita este proceso para todas las soluciones que contengan nanocuerpos con solución activante y no activante.Cree un protocolo para el flujo de trabajo mediante una secuencia BAB. Cree un bucle que realice tres mediciones de la secuencia BAB utilizando tampones sin nanocuerpos, dos mediciones de la secuencia BAB con tampones que contengan un nanocuerpo, 120 segundos de tiempo de retardo de incubación con el nanocuerpo y tres mediciones de la secuencia BAB con tampones que contengan el nanocuerpo. Guarde el flujo de trabajo y deje que se ejecute haciendo clic en el botón de reproducción.A continuación, cree un nuevo protocolo para el flujo de trabajo utilizando una secuencia BAB y un bucle de cinco mediciones para eliminar el nano cuerpo unido reversiblemente. Guarde el flujo de trabajo y deje que se ejecute haciendo clic en el botón de reproducción. Compare la última corriente máxima de las mediciones con la medición inicial de solo sustrato.Si la corriente máxima alcanza el valor inicial, el nanocuerpo se ha lavado con éxito y se han restablecido las condiciones iniciales. De lo contrario, repita el flujo de trabajo o cambie a un nuevo chip. Repita este proceso utilizando chips individuales para cada pantalla de nanocuerpos, o repita con múltiples nanocuerpos usando el mismo chip.Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo. Luego, el software selecciona automáticamente la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación. Normalice la corriente máxima y la presencia del nanocuerpo en función de la medición de solo sustrato.Traza las corrientes máximas en el histograma y compara las corrientes máximas de las mediciones solo de sustrato con las corrientes máximas medidas en presencia de nanocuerpos para identificar nanocuerpos inhibitorios. Transfiera 50 mililitros del tampón SSM no activante a un tubo limpio y agregue la colina de sustrato a una concentración final de cinco milimolares, y use esto como solución activadora para el control positivo. Agregue cinco mililitros de la solución no activante a ocho tubos limpios, luego agregue colina de sustrato y nanocuerpos inhibitorios a los tubos a concentraciones en el rango esperado de IC50.Agregue 10 mililitros de la solución no activante a los ocho tubos y agregue nanocuerpos inhibitorios a cada tubo correspondiente al tampón de no activación. Inicie la configuración de SSM y mida la capacitancia y la conductividad del chip recubierto de proteoliposoma. Transfiera la solución activadora sin nanocuerpo a un vial y colóquela en el muestreador de la sonda.A continuación, transfiera el búfer no activante sin nanocuerpo a un depósito y colóquelo en la posición del depósito junto al soporte del chip a la derecha. Transfiera las soluciones activantes y no activantes que contienen nanocuerpos a viales y coloque los tampones en el muestreador de la sonda. Cree un protocolo para el flujo de trabajo mediante una secuencia BAB.Incluye un bucle para medir cada concentración dos veces, incubar durante 120 segundos y medir tres veces más. Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo y seleccione la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación. Trazar las corrientes máximas contra la concentración de nanocuerpos para determinar el IC50 a través de la regresión no lineal.Para determinar la concentración de sustrato que se utilizará durante un cribado de nanocuerpos, se midió el transporte electrogénico bajo diferentes concentraciones de sustrato para determinar EC50. Se seleccionó una concentración de sustrato correspondiente a las condiciones de saturación, cinco milimolares, y se mantuvo constante en todos los tampones de activación. El efecto de los nanocuerpos inhibitorios sobre el transporte electrogénico se visualizó a partir de la disminución de las amplitudes de las corrientes máximas.Después de ejecutar el protocolo de lavado para permitir la desvinculación de nanocuerpos, se observó una recuperación del 80 al 95% de la amplitud de corriente máxima inicial. Al cambiar de condiciones de no activación a activación, los nanocuerpos presentes en estos tampones no introdujeron corrientes de artefacto significativas. Después de seleccionar nanocuerpos con propiedades inhibitorias, se determinaron los valores de IC50 para nanocuerpos individuales.Es crucial dar suficiente tiempo para la calibración de los proteoliposomas en el chip con el búfer que contiene el nanocuerpo. Dado que la unión es reversible, el nanocuerpo debe estar presente tanto en los búferes activadores como en los no activadores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM) (Video) | JoVE Journal

Selección de nanocuerpos inhibitorios dirigidos al transportador mediante electrofisiología basada en membrana sólida soportada (SSM)

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