Name: Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Aprende a estudiar interacciones ARN-proteína mediante pinzas ópticas combinadas con microscopía confocal. Este protocolo permite monitorear fuerzas de despliegue y eventos de unión durante la traducción en tiempo real.

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Agradecemos a Anuja Kibe y al Prof. Redmond Smyth por revisar críticamente el manuscrito. Agradecemos a Tatyana Koch por la asistencia técnica experta. Agradecemos a Kristyna Pekarkova por la ayuda con la grabación de videos experimentales. El trabajo en nuestro laboratorio cuenta con el apoyo de la Asociación Helmholtz y la financiación de la subvención nr. 948636 (a NC) del Consejo Europeo de Investigación (ERC).

1. Preparación de la muestra
<ol><li>Clonar la secuencia de interés en el vector que contiene los fragmentos de ADN Lambda, que sirven como secuencias de mango (Figura 2)43,50.</li>
	<li>Primero generar una plantilla de ADN para la posterior transcripción in vitro mediante PCR (Figura 2B; reacción 1). En este paso de PCR, el promotor T7 se añade en el extremo 5' de la molécula de ADN sensorial32,33,43,50. Establezca la reacción de PCR de acuerdo con la Tabla 1. Ejecutar la PCR en alícuotas de 50 μL con ciclos apropiados en el termociclador.</li>
	<li>Preparar los mangos mediante dos reacciones de PCR separadas (Tabla 1, Figura 2B; reacción 2 y 3). Primero, generar el mango de 5' por PCR. Luego, genere el mango de 3' y etiquételo simultáneamente con digoxigenina utilizando un cebador etiquetado con digoxigenina de 5'32,33,43,50.</li>
	<li>Después de la PCR, purificar el ADN usando columnas de espín de sílice.</li>
	<li>Realizar la reacción de transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa T7 (Tabla 2)32,33,43,50. Incubar la reacción a 37 °C durante 2-4 h dependiendo de la longitud del ARN. A continuación, agregue la DNasa I a la reacción e incube a 37 ° C durante 30 minutos para digerir la plantilla de ADN. Purificar el ARN usando columnas de espín de sílice.</li>
	<li>Durante la reacción de etiquetado del mango de 5' (Tabla 3), añadir biotina-16-dUTP en el extremo 3' del mango por ADN polimerasa T438,50. Realice la reacción a temperatura ambiente durante 1-2 h. Después, purifica el ADN usando columnas de espín de sílice. NOTA: Dado que el mango de 5' debe estar etiquetado en su extremo de 3' (Figura 2B), el etiquetado no se puede realizar durante la PCR.</li>
	<li>Mezcle los componentes mencionados anteriormente: mango de 5' (3' marcado con biotina), mango de 3' (5' marcado con digoxigenina) y ARN - en una proporción molar de 1:1:1 en tampón de recocido (80% formamida, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, pH 8), para obtener el híbrido ARN/ADN deseado (Tabla 4). Calentar la mezcla de recocido hasta 85 °C durante 10 min y luego enfriar lentamente hasta 4 °C.</li>
	<li>Mezclar la muestra recocida con 1/10 de volumen de 3 M de acetato de sodio (pH 5), 3 volúmenes de etanol helado e incubar a -80 °C durante al menos 1 h o a -20 °C durante la noche.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y seque el gránulo (generalmente no visible) al vacío.</li>
	<li>Por último, resuspend, el pellet en 50 μL de agua libre de RNasa y hacer alícuotas. Conservar las alícuotas a -80 °C hasta que se utilicen. Para el almacenamiento a corto plazo, las muestras también se pueden almacenar a -20 °C.</li>
</ol>2. Configuración del instrumento
NOTA: El siguiente protocolo está optimizado para el instrumento de pinzas ópticas comerciales C-Trap de la empresa LUMICKS. Por lo tanto, los ajustes a los pasos presentados pueden ser necesarios mientras se utilizan otros instrumentos de pinzas ópticas. Si no se utiliza, el sistema de microfluídica de la máquina se mantiene en lejía (solución de hipoclorito de sodio) y debe lavarse antes de su uso.
<ol><li>Deseche la lejía y llene las jeringas con 1 ml de agua libre de RNasa.</li>
	<li>Agregue 50 μL de tiosulfato de sodio de 0,5 M a al menos 1 ml de agua libre de RNasa y lave bien el sistema (1 bar, al menos 0,5 ml) para eliminar la lejía restante en el sistema.</li>
	<li>Deseche la solución de tiosulfato de sodio de las jeringas. Reemplace las jeringas por otras frescas y lave el sistema con al menos 0,5 ml de agua libre de RNasa. NOTA: Tenga cuidado de que el sistema de microfluídica nunca se seque para evitar burbujas de aire en el sistema.</li>
	<li>Coloque 2 gotas de aceite de inmersión (índice de refracción de 1.33) o aproximadamente 70 μL de agua sobre el objetivo.</li>
	<li>Coloque la celda de flujo dentro del marco de sujeción en su posición.</li>
	<li>Coloque 2 gotas de aceite de inmersión (índice de refracción de 1.51) sobre la celda de flujo.</li>
	<li>Encienda el dispositivo láser en la máquina de pinzas. Una vez que se esté ejecutando, encienda el láser de captura en la interfaz del software al 100%.</li>
	<li>Utilizando cámaras de diagnóstico (Z-finder), ajuste el eje Z al centro de la cámara entre la segunda y la tercera reflexión (interfaces) donde los anillos de refracción son los más grandes, girando el micro tornillo. NOTA: Cada vez que el objetivo se acerca a la cámara de medición y el plano focal del objetivo cruza la interfaz entre dos fases, se puede reconocer una reflexión en el modo Z-finder. Hay 4 interfaces posibles: (i) agua / aceite de inmersión y vidrio inferior (ii) vidrio inferior y tampón dentro de la cámara (iii) tampón dentro de la cámara y vidrio superior (iv) vidrio superior y aceite de inmersión para condensador.</li>
	<li>Ajuste la posición del condensador (ajuste el láser de captura a aproximadamente el 50%) para que el condensador toque el aceite de inmersión en la parte superior de la cámara de medición.</li>
	<li>Ajuste el enfoque moviéndose lentamente hacia abajo / hacia arriba con el condensador, de modo que se muestren aproximadamente 10 bandas de luz en el modo lunar (cámaras de diagnóstico).</li>
</ol>3. Medición de la muestra
<ol><li>Incubar perlas recubiertas de anti-digoxigenina (AD) con los constructos de la muestra (3 μL de suspensión de perlas AD al 0,1% (p/v) + 4 μL de muestra) y con 1 μL de inhibidores de la RNasa y 8 μL del tampón del ensayo (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM TDT) en RT durante 10-20 min. Después de la incubación, diluya la muestra en 500 μL de tampón de ensayo. NOTA: Se recomienda agregar eliminadores de oxígeno, particularmente durante las mediciones de fluorescencia al tampón para prevenir el daño oxidativo. Aquí se utilizó un sistema eliminador de oxígeno que contenía glucosa (8,3 mg/mL), glucosa oxidasa (40 U/mL) y catalasa (185 U/mL).</li>
	<li>Mezcle 0,8 μL de perlas recubiertas de estreptavidina (SA) al 1% (p/v) con 1 ml de tampón de ensayo.</li>
	<li>Deseche el agua de las jeringas y llene las jeringas con las respectivas suspensiones/soluciones. Lave durante al menos 2 minutos a aproximadamente 1 barra y luego comience a atrapar cuentas. NOTA: Dependiendo de la configuración experimental, se pueden utilizar diferentes arreglos de canales (Figura 3). Por lo general, un canal de flujo está lleno de perlas de anti-digoxigenina que transportan la molécula de ARN. Un segundo canal está lleno de las cuentas recubiertas de estreptavidina. El canal de búfer se utiliza para formar las ataduras. Se puede emplear un cuarto canal para cargar la proteína de unión al ARN (Figura 3C), o alternativamente se puede agregar RBP directamente en el canal tampón (Figura 3B).</li>
	<li>Para capturar las cuentas, mueva las trampas ópticas separadas entre sí. Primero muévase al canal AD y atrape una cuenta AD en la trampa 1. A continuación, mueva el escenario al canal SA y atrape una sola cuenta SA mediante la trampa 2. NOTA: Intente permanecer en la interfaz del búfer y los canales de cuentas para evitar perder la cuenta ya capturada, o para evitar atrapar varias cuentas por la misma trampa.</li>
	<li>Una vez que se capturen las cuentas del tamaño correcto, muévase al canal de amortiguación y detenga el flujo laminar. A continuación, realice la calibración de fuerza para verificar la rigidez de la trampa. Los valores de rigidez respectivos no deben diferir en el eje x/y en más del 10-15%. NOTA: Ajuste la potencia del láser o la división del láser entre las trampas de acuerdo con el tamaño de la perla. La calibración de la fuerza no tiene que hacerse para cada par de cuentas, siempre y cuando las plantillas de cuentas coincidan (puntuación de similitud &gt; 0,9). Sin embargo, debe realizarse regularmente, o al menos cada vez que se cambian las condiciones del ensayo.</li>
	<li>Comience a pescar una correa moviendo las cuentas cerca una de la otra, esperando unos segundos, y luego volviéndolas a separar, repita hasta que se forme una correa. Una formación de atadura resulta en un aumento de la fuerza medida al alejar las dos cuentas una de la otra. NOTA: Para evitar la formación de múltiples ataduras, las cuentas no deben moverse demasiado cerca. Al atrapar una correa entre las dos cuentas, la calidad de la correa se puede verificar encontrando la meseta de estiramiento excesivo. La meseta debe estar entre 50 y 60 pN para una sola correa.</li>
	<li>Al obtener una correa, inicie la medición. Dependiendo del fenómeno estudiado, se deben elegir diferentes configuraciones de medición (Figura 1B-D). NOTA: Por lo general, al comienzo del experimento, se realiza un experimento de rampa de fuerza para verificar la calidad de la correa y sondear el comportamiento. Después, también se pueden comenzar los experimentos de fuerza constante o posición constante para estudiar más a fondo las transiciones de estado. Una vez que se ha realizado un número suficiente de mediciones en una muestra de ARN para determinar su comportamiento, se pueden agregar factores marcados al sistema para realizar mediciones confocales.</li>
	<li>Para realizar mediciones de fluorescencia, encienda los láseres confocales y la unidad de contador de fotones en el instrumento de pinzas ópticas.</li>
	<li>Encienda el láser de excitación de la longitud de onda deseada en la interfaz del software y ajuste la potencia del láser al 5% o más, dependiendo del fluoróforo. NOTA: Si bien no se mide, reduzca la configuración de potencia del láser de excitación al 0% para evitar el fotodaño excesivo a la muestra.</li>
	<li>Comience a crear imágenes de la muestra mediante las funciones de imagen del software. NOTA: Para obtener imágenes bien enfocadas, el plano focal del microscopio confocal y las trampas ópticas deben estar alineados. Para este propósito, se puede emplear la autofluorescencia de las perlas de poliestireno en el canal láser azul. El plano focal de las trampas ópticas se mueve hacia arriba o hacia abajo en el eje z hasta que la imagen de las cuentas alcanza su diámetro más alto. En esta posición, se puede medir la señal de fluorescencia de la molécula atada entre las perlas.</li>
	<li>Para utilizar la función kymograph, especifique la posición x-y del eje kymograph para que permita la detección de la correa entre las cuentas.</li>
	<li>A lo largo de la medición, la composición del tampón se puede cambiar fácilmente moviendo las perlas a diferentes canales o cambiando el búfer suministrado en el sistema de microfluídica.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Preprocesamiento de datos sin procesar<ol>
<li>Mediante el uso de un script simple, reduzca la muestra de los datos sin procesar lo suficiente como para (i) permitir un procesamiento de datos posterior más rápido, pero (ii) aún contener toda la información crítica (Figura 4A). Por lo general, 100-5000 Hz es adecuado para este propósito. NOTA: La frecuencia de recopilación de datos en los experimentos con pinzas ópticas es a menudo más alta de lo necesario para el análisis: en los experimentos presentados, la frecuencia de recopilación de datos se establece en 78 125 Hz de forma predeterminada. Dado que el espacio de almacenamiento es limitado, es conveniente y ahorra tiempo reducir la frecuencia de muestreo de los datos. Aquí, los datos brutos se redujeron en un factor de 30.</li>
		<li>A continuación, emplee un filtro de señal para reducir el ruido de medición de alta frecuencia de la señal (Figura 4A). Ajuste el grado de filtro y los parámetros de frecuencia de corte en consecuencia para optimizar la salida de datos de diferentes experimentos (Figura 5). NOTA: Entre los filtros de señal, el filtro Butterworth51 es uno de los más utilizados. En los datos complementarios se proporciona un script python escrito a medida que permite el procesamiento previo de datos sin procesar. Los parámetros de reducción de muestreo y filtrado de señales (frecuencia de corte, grado de filtro) deben optimizarse para diferentes experimentos.</li>
	</ol></li>
	<li>Para el análisis de datos de rampa de fuerza, siga estos pasos.<ol>
<li>Marque los pasos manualmente buscando los puntos correspondientes en el gráfico de trayectoria de fuerza o utilizando scripts escritos a medida. Los pasos de despliegue se caracterizan por una caída repentina de la fuerza combinada con un aumento de la distancia en la curva fuerza-distancia (FD).</li>
		<li>Una vez que se marcan los eventos de despliegue, ajuste las diferentes regiones de la curva FD utilizando los modelos apropiados (Figura 4D). NOTA: Para la región antes del primer paso de despliegue, la correa puede considerarse "de doble cadena" y se ajusta comúnmente utilizando un modelo extensible de cadena similar a un gusano (WLC)47,52,53. Las partes después del primer evento de despliegue se consideran una combinación de nucleótidos de doble cadena (mangos) y nucleótidos de cadena simple (molécula de ARN desplegada). Por lo tanto, el ajuste de datos es más complejo: generalmente se emplea una combinación de 2 modelos WLC o WLC y modelos de cadena de unión libre (FJC)36,39,52. El modelo WLC extensible tiene dos parámetros de ajuste principales: la longitud del contorno (LC) y la longitud de persistencia (LP). La longitud del contorno corresponde a la longitud de la molécula completamente estirada y la longitud de persistencia define las propiedades de flexión de la molécula de interés. El modelo se puede describir con la siguiente ecuación (1). WLC se puede utilizar para modelar el comportamiento de las regiones plegadas y desplegadas, aunque para cada una de ellas se debe emplear un modelo separado con diferentes parámetros. (1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg"> donde x es extensión, LC es longitud de contorno, F es fuerza, LP es longitud de persistencia, kB es constante de Boltzmann, T es temperatura termodinámica y S es módulo de estiramiento. El segundo modelo llamado cadena de articulación libre (FJC) se usa comúnmente para describir el comportamiento de las regiones desplegadas de una sola cadena. Utiliza parámetros similares a los de los polímeros, pero trata cada unidad de la "cadena" como una varilla rígida, aquí correspondiente a los nucleótidos de la región monocatenaria desplegada. La siguiente ecuación (2) describe este modelo: (2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg"> NOTA: Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un algoritmo que permite el procesamiento por lotes de los datos brutos de rampa de fuerza llamado "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54". El algoritmo reduce y filtra los datos, luego identifica los posibles pasos de despliegue y finalmente realiza el ajuste de datos. El POTATO está construido en una interfaz gráfica de usuario (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO) fácil de usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Procese los datos de fuerza constante de la siguiente manera: NOTA: Las siguientes instrucciones se pueden aplicar analógicamente en datos de posición constante.<ol>
<li>Para los datos de fuerza constante, grafique la distancia a lo largo del tiempo (Figura 5). Un histograma que muestre la frecuencia (recuentos) de diferentes conformaciones sobre el cambio relativo de posición es una forma útil de caracterizar varios estados dominantes y menores (Figura 7).</li>
		<li>Ajuste el histograma utilizando (múltiples) funciones gaussianas para estimar el porcentaje total de conformadores individuales a una fuerza dada (Figura 7C). Los ajustes gaussianos, la posición media y la desviación estándar describen la relación relacionada con la fuerza entre las diferentes poblaciones. NOTA: En los datos complementarios se proporciona un script python escrito a medida que permite el preprocesamiento y el ajuste gaussiano bimodal básico de datos de fuerza constante. Los parámetros (frecuencia de corte, grado de filtro, medias esperadas, valores de desviación estándar y amplitudes) deben optimizarse para diferentes experimentos.</li>
		<li>A continuación, emplee el modelo de Markov oculto para analizar más a fondo los estados, que pueden descubrir intermedios plegables adicionales (conformadores)55. Para obtener más información sobre el modelo de Markov de fuerza constante y oculto, se puede consultar 55,56,57,58.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, demostramos el uso de pinzas ópticas acopladas a fluorescencia para estudiar las interacciones y el comportamiento dinámico de las moléculas de ARN con varios ligandos. A continuación, se discuten los pasos críticos y las limitaciones de la presente técnica.
Pasos críticos en el protocolo Como para muchos otros métodos, la calidad de la muestra es fundamental para obtener datos confiables. Por lo tanto, para obtener muestras de la más alta calidad posible, vale la pen...

La transferencia de información genética del ADN a las proteínas a través de los ARNm es un proceso bioquímico complejo, que se regula con precisión en todos los niveles a través de interacciones macromoleculares dentro de las células. Para la regulación traslacional, las interacciones ARN-proteína confieren un papel crítico para reaccionar rápidamente a diversos estímulos y señales1,2. Algunas interacciones ARN-proteína afectan la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, alteran el tiempo que un ARN está activo traslacionalmente. Otras interacciones ARN-proteína se asocian con mecanismos de recodificación como la lectura stop-codón, la derivación o el frameshifting ribosómico programado (PRF)3,4,5,6,7. Recientemente, se ha demostrado que una serie de proteínas de unión al ARN (RBPs) interactúan con elementos estimulantes de ARNm y la maquinaria de traducción para dictar cuándo y cuánta recodificación ocurrirá en la célula7,8,9,10,11. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las proteínas de unión al ARN en la traducción y cómo modulan la estructura y la estabilidad del ARN, es fundamental estudiar en detalle los principios de interacción y las propiedades mecánicas de estos complejos ARN-proteína.
Décadas de trabajo han sentado las bases para estudiar el proceso de traducción de múltiples pasos y múltiples componentes, que se basa en la intrincada comunicación entre los componentes de ARN y proteína de la maquinaria de traducción para lograr velocidad y precisión12,13,14. Un siguiente paso crucial en la comprensión de eventos regulatorios complejos es determinar las fuerzas, escalas de tiempo y determinantes estructurales durante la traducción con alta precisión12,15,16,17. El estudio de la dinámica conformacional del ARN y especialmente cómo actúan los factores auxiliares de acción transactuante sobre la estructura del ARN durante la traducción se han iluminado aún más con la aparición de herramientas de una sola molécula, incluidas las pinzas ópticas o las guías de onda de modo cero16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Las pinzas ópticas (OT) representan una técnica de molécula única de alta precisión, que se ha aplicado para estudiar muchos tipos de procesos dinámicos dependientes del ARN, incluida la transcripción y la traducción26,27,28,29,30,31,32. El uso de pinzas ópticas ha permitido sondear las interacciones moleculares, las estructuras de ácidos nucleicos y las propiedades termodinámicas, cinéticas y energéticas de estos procesos en detalle16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . El ensayo de pinzas ópticas se basa en el atrapamiento de objetos microscópicos con un rayo láser enfocado. En un experimento típico de OT, la molécula de interés está atada entre dos perlas transparentes (generalmente poliestireno) (Figura 1A)27. Estas cuentas son atrapadas por trampas ópticas, que se comportan como resortes. Por lo tanto, la fuerza aplicada sobre la molécula se puede calcular en función del desplazamiento de la perla desde el centro del rayo láser enfocado (centro de trampa). Recientemente, las pinzas ópticas se han combinado con microscopía confocal (Figura 1B), lo que permite mediciones de fluorescencia o transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET)40,41,42. Esto abre un nuevo campo de posibles experimentos que permiten la medición simultánea y, por lo tanto, la correlación precisa de la espectroscopia de fuerza y los datos de fluorescencia.
Aquí, demostramos experimentos utilizando las pinzas ópticas combinadas con microscopía confocal para estudiar las interacciones proteína-ARN que regulan el desplazamiento de marco traslacional. Entre el objetivo y el condensador, una celda de flujo con cinco canales permite la aplicación continua de muestras con flujo laminar. A través de los canales microfluídicos, se pueden inyectar varios componentes directamente, lo que disminuye el tiempo de práctica y permite un consumo de muestras muy pequeño durante todo el experimento.
Primero, se propone una guía básica para ayudar al diseño de experimentos de OT y se discuten las ventajas y las trampas de varias configuraciones. A continuación, se describe la preparación de muestras y flujos de trabajo experimentales, y se proporciona un protocolo para el análisis de datos. Para poner un ejemplo, esbozamos los resultados obtenidos de los experimentos de estiramiento de ARN para estudiar el elemento arn de desplazamiento de marco SARS-CoV-2 (Figura 2A) con el factor de transacción la isoforma corta de la proteína antiviral del dedo de zinc (ZAP), que altera la traducción del ARN viral a partir de un marco de lectura alternativo43. Además, está demostrado que los ribosomas marcados con fluorescencia se pueden emplear en este ensayo confocal OT, lo que sería útil para controlar la procesividad y la velocidad de la maquinaria de traducción. El método presentado aquí se puede utilizar para probar rápidamente el efecto de diferentes tampones, ligandos u otros componentes celulares para estudiar varios aspectos de la traducción. Finalmente, se discuten las trampas experimentales comunes y cómo solucionarlas. A continuación, se describen algunos puntos cruciales en el diseño experimental.
Diseño de construcción En principio, hay dos enfoques comunes para crear una construcción de ARN compatible con OT. El primer enfoque emplea una molécula larga de ARN que se hibrida con mangos de ADN complementarios, lo que produce una construcción que consiste en dos regiones híbridas de ARN / ADN que flanquean una secuencia de ARN de cadena simple en el medio (Figura 2B). Este enfoque se emplea en la mayoría de los experimentos de ARN OT33,44,45.
El segundo enfoque aprovecha los mangos dsDNA con voladizos cortos (alrededor de 20 nt)15,17. Estos voladizos se hibridan con la molécula de ARN. Aunque es más complicado en el diseño, el uso de mangos dsDNA supera algunas de las limitaciones del sistema híbrido ADN/ARN. En principio, incluso se pueden implementar mangos muy largos (>10kb), lo que es más conveniente para mediciones confocales. Además, la molécula de ARN se puede ligar a los mangos de ADN para aumentar la estabilidad de la correa.
Estrategia de etiquetado final La construcción debe estar atada a cuentas a través de una fuerte interacción molecular. Si bien existen enfoques disponibles para la unión covalente de mangos a perlas46, las interacciones fuertes pero no covalentes como la estreptavidina-biotina y el anticuerpo digoxigenina se utilizan comúnmente en experimentos de OT15,33,35,45. En el protocolo descrito, el constructo está marcado con biotina o digoxigenina, y las perlas están recubiertas con estreptavidina o anticuerpos contra digoxigenina, respectivamente (Figura 1A). Este enfoque sería adecuado para aplicar fuerzas de hasta aproximadamente 60 pN (por correa)47. Además, el uso de diferentes estrategias de etiquetado de 5' y 3' permite determinar la orientación de la correa formada entre las cuentas17.
Etiquetado de proteínas para mediciones de fluorescencia Para las imágenes confocales, hay varios enfoques comúnmente utilizados para el etiquetado de fluorescencia. Por ejemplo, los fluoróforos pueden unirse covalentemente a residuos de aminoácidos que se encuentran de forma nativa en las proteínas o se introducen por mutagénesis dirigida al sitio a través de un grupo orgánico reactivo. Los colorantes reactivos al tiol o amina se pueden utilizar para el etiquetado de residuos de cisteína y lisina, respectivamente. Existen varios métodos de protección reversibles para aumentar la especificidad del etiquetado48,49, sin embargo, las proteínas nativas normalmente se etiquetarían en múltiples residuos. Aunque el pequeño tamaño del fluoróforo puede conferir una ventaja, el etiquetado no específico puede interferir con la actividad de la proteína y, por lo tanto, la intensidad de la señal puede variar49. Además, dependiendo de la eficiencia del etiquetado, la intensidad de la señal puede diferir entre diferentes experimentos. Por lo tanto, se debe realizar una verificación de actividad antes del experimento.
En caso de que la proteína de interés contenga una etiqueta N- o C-terminal, como una etiqueta His o una etiqueta estreptocócica, el etiquetado específico de estas etiquetas representa otro enfoque popular. Además, el etiquetado dirigido a etiquetas reduce la posibilidad de que el fluoróforo interfiera con la actividad de las proteínas y puede mejorar la solubilidad49. Sin embargo, el etiquetado específico de la etiqueta generalmente produce proteínas marcadas con monofluoróforos, que podrían ser difíciles de detectar. Otra forma de etiquetado específico se puede lograr mediante el empleo de anticuerpos.
Configuración de microfluidos La combinación de OT con un sistema de microfluídica permite una transición rápida entre diferentes condiciones experimentales. Además, los sistemas actuales aprovechan el mantenimiento del flujo laminar dentro de la celda de flujo, lo que impide la mezcla de líquidos de otros canales en la dirección perpendicular en relación con la dirección del flujo. Por lo tanto, el flujo laminar es particularmente ventajoso para el diseño experimental. Actualmente, las celdas de flujo con hasta 5 canales se emplean comúnmente (Figura 3).

<table><tbody><tr><td><Cepas > bacterias fuertes</E</td>. coli > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fuerte Colección</td> de <td>laboratorio</td> N<td>/A</td><td>Clonación de los vectores</td></tr><tr><td><fuerte>químicos y enzimas</fuerte>Cloruro</td> de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>Biotina-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>Biotinilación</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Sistema de limpieza de oxígeno</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>ADNasa I del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td> transcripción <td>in vitro</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814320001</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>Sistema de limpieza de oxígeno</td></tr><tr><td>Glucosa-oxidasa</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Sistema de limpieza de oxígeno</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN78.3</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa</td><td>NEB</td><td>M0530L Ensamblaje</td> de <td>Gibson, clonación</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Merck</td><td>529552-1KG</td><td>Tampones</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL ADN POLIMERASA</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Pirofosfatasa, termoestable, inorgánica</td><td>NEB</td><td>M0296L</td> Inhibidor de ARNasa <td>de transcripción in vitro</td></tr><tr><td></td><td>Tampones 1000379515 Molox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>life technologies</td><td>R0481</td> transcripción <td>in vitro</td></tr><tr><td>Tiosulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>Desactivación de lejía</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>Mediciones confocales</td></tr><tr><td>ADN polimerasa T4</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>Biotinilación</td></tr><tr><td>T5 exonucleasa</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Ensamblaje de Gibson, clonación</td></tr> de <tr><td>ARN polimerasa T7</td><td>Producción propia N</td><td>/A</td><td>transcripción in vitro</td></tr><tr><td>ADN polimerasa</td><td>Taq NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq ligasa</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Ensamblaje de Gibson, clonación</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>Tampones</td></tr><tr><td><fuertes>Kits</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de etiquetado de proteínas monolíticas RED-NHS de 2ª generación (reactiva a la amina)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-L011</td><td>Se utiliza para el etiquetado de ribosomas</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>Ribosomas utilizados para el etiquetado</td></tr><tr><td><Oligonucleótidos fuertes> </5 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fuerte Mango T7 adelante</td><td>Microsynth</td><td>pedido</td> <td>personalizado5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', utilizado para generar una plantilla de transcripción in vitro de OT en PCR 1</td></tr><tr><td>3' manejar</td><td>Microsynth</td> inverso orden <td>personalizado</td><td>5' -&nbsp; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', utilizado para generar la plantilla de transcripción in vitro de OT en PCR 1</td></tr><tr><td>5' mango adelante</td><td>Microsynth</td><td>pedido personalizado</td><td>5' - TCCTTTGTGGACGCCGC - 3' , utilizado para generar 5' mango en PCR 2</td></tr><tr><td>5' mango inverso</td><td>Microsynth</td><td>pedido personalizado</td><td>5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', utilizado para generar 5' mango en PCR 2</td></tr><tr><td>3' mango adelante</td><td>Microsynth</td><td>pedido personalizado</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', utilizado para generar 3' mango en PCR 3</td></tr><tr><td>3' mango reverso 5' marcado con digoxigenina</td><td>Microsynth</td><td>pedido personalizado</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', utilizado para generar 3' mango en PCR 3</td></tr><tr><td>DNA vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMZ_OT</td><td>producido internamente</td><td>N/A</td><td>descripción adicional en "Los estudios estructurales de la proteína Cardiovirus 2A revelan la base molecular para el reconocimiento de ARN y el control traduccional" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A</td><td></td></tr><tr><td>POTATO</td> https://github.com/lpekarek/POTATO.git <td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNAstructure</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spyder</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Otro</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Partículas de poliestireno recubiertas de estreptavidina, 1,5-1,9 y micro; m, 5 ml, 1.0% p/v</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de poliestireno recubiertas de digoxigenina, 2.0-2.4 y micro; m, 2 ml, 0,1 % p/v</td><td>Jeringas Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>Devices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Pinzas ópticas acopladas a microscopía confocal</td></tr></tbody></table>

pinzas ópticas para estudiar las interacciones arn-proteína en la regulación de la traducción

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

El ARN adopta diversos pliegues estructurales, que son esenciales para sus funciones y, por lo tanto, pueden afectar diversos procesos en la célula. Además, la estructura y función de un ARN puede ser modulada por diversos factores de acción trans, como proteínas, metabolitos u otros ARN. Las moléculas de ARN que cambian el marco, por ejemplo, son ARN reguladores ubicados en regiones codificantes, que dirigen la traducción de ribosomas en un marco de lectura abierto alternativo y, por lo tanto, actúan como interruptores genéticos. También pueden adoptar diferentes pliegues después de unirse a proteínas u otros factores trans. Para diseccionar el papel de las proteínas de unión al ARN en la traducción y cómo modulan la estructura y la estabilidad del ARN, es crucial estudiar la interacción y las características mecánicas de estos complejos ARN-proteína simultáneamente. Este trabajo ilustra cómo emplear pinzas ópticas acopladas a fluorescencia de una sola molécula para explorar el panorama conformacional y termodinámico de los complejos ARN-proteína a una alta resolución. A modo de ejemplo, se elabora la interacción del elemento de desplazamiento de marco ribosómico programado por sarS-CoV-2 con la isoforma corta del factor de acción trans de la proteína antiviral zinc-dedo. Además, los ribosomas marcados con fluorescencia se monitorizaron utilizando la unidad confocal, lo que en última instancia permitiría el estudio del alargamiento de la traducción. El ensayo OT acoplado a fluorescencia se puede aplicar ampliamente para explorar diversos complejos de ARN-proteína o factores de acción trans que regulan la traducción y podría facilitar los estudios de regulación génica basada en ARN.

En esta sección, se presta especial atención a las mediciones de las interacciones ARN-proteína/ligando por las pinzas ópticas de fluorescencia. Para una descripción de los experimentos generales de pinzas ópticas de ARN y los resultados representativos correspondientes, ver32. Para una discusión más detallada de las interacciones ARN/ADN-proteína, véase también1,2,26,59,60.</...

Este protocolo presenta un flujo de trabajo experimental completo para estudiar las interacciones ARN-proteína utilizando pinzas ópticas. Se describen varias configuraciones experimentales posibles, incluida la combinación de pinzas ópticas con microscopía confocal.

Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

El objetivo general del siguiente artículo del método es demostrar un protocolo útil para estudiar las interacciones del ARN con proteínas u otros factores utilizando pinzas ópticas junto con microscopía confocal. Durante la última década, se han desarrollado varias técnicas sofisticadas para investigar las propiedades de macromoléculas individuales. Una de estas técnicas son las pinzas ópticas de una sola molécula.Con las nuevas pinzas ópticas asistidas por fluorescencia, no solo se pueden monitorear en detalle las fuerzas requeridas para el despliegue de las moléculas de ARN, así como los eventos de unión durante la traducción. Aquí nos centramos en las mediciones en las que las moléculas de ARN se estiran con y sin factores transaccionales que regulan la traducción. También ilustramos cómo se puede aplicar la técnica para monitorear la traducción utilizando ribosomas etiquetados.El protocolo será demostrado por dos estudiantes graduados de mi grupo, Lukas Pekarek y Stefan Park. En este video, lo guiaremos a través de la configuración y ejecución de un experimento de pinzas ópticas. También describimos el flujo de trabajo de análisis de datos simple.La ventaja de esta técnica es

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Las pinzas ópticas se han utilizado para estudiar el plegamiento del ARN estirando moléculas individuales desde sus extremos 5' y 3'. Aquí se describen los procedimientos comunes para sintetizar moléculas de ARN para pinzas, la calibración del instrumento y los métodos para manipular moléculas individuales.

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.

La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

El ensayo de la regla de ADN dual se desarrolla para determinar la posición del ARNm durante la translocación ribosoma, que se basa en las fuerzas de disociación de los dúplex de ARN-ADN formados. Con la resolución de un solo nucleótido y la capacidad de llegar a ambos extremos del ARNm, puede proporcionar información mecanicista para la translocación ribosoma y sondear otros desplazamientos de ácido nucleico.

Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar...

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

Aquí, presentamos un método in vitro optimizado para descubrir, cuantificar y validar interactores de proteínas de secuencias específicas de ARN, utilizando extracto de proteína total de células humanas, perlas de estreptavidina recubiertas con ARN biotinilado y análisis de espectrometría de masas.

Un análisis extraíble cuantitativo optimizado de proteínas de unión al ARN utilizando ARN biotinilado corto

Aprende a estudiar interacciones ARN-proteína mediante pinzas ópticas combinadas con microscopía confocal. Este protocolo permite monitorear fuerzas de despliegue y eventos de unión durante la traducción en tiempo real.

Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

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