Activación y conjugación de polisacáridos solubles utilizando 1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato (CDAP)

Los polisacáridos son poco inmunogénicos a menos que estén vinculados a proteínas y necesitan ser activados para la derivatización o conjugación a proteínas. En este método, CDAP se utiliza como reactivo de embarque de arena. El CDAP activa los hidroxilos polisacáridos para la derivatización o para ser vinculados a proteínas para su uso en vacunas o reactivos de diagnóstico.

CDAP ha reemplazado en gran medida el bromuro de cianógeno como un reactivo de polisacárido de sand lading. CDAP es más fácil de usar, más eficiente y se puede usar a un pH más bajo que el bromuro de cianógeno. Es un reactivo de activación mucho mejor.

CDAP se puede utilizar con la mayoría de los polisacáridos, a diferencia de la aminación reductiva, que requiere hidroxilos vicinales. La química se puede utilizar para conjugar directa e indirectamente con proteínas, y se puede utilizar para hacer reactivos de diagnóstico. La reacción de activación de CDAP, como se describió originalmente, fue muy rápida y difícil de controlar.

El protocolo proporcionado aquí hace que la química sea mucho más fácil de realizar y mucho más reproducible. Antes de comenzar el experimento, ajuste el pH de la solución de polisacáridos a 9 agregando 200 microlitros de solución de stock de dimetilaminopiridina de manera gradual mientras se agita. Mantenga la reacción fría en un baño de agua helada durante todo el proceso de activación.

Proceda con la activación de ciano-dimetilaminopiridina-tetrafluoroborato o CDAP transfiriendo 100 microlitros de CDAP a la solución de polisacárido mientras se agita. Inicie el temporizador y controle el cambio de pH durante toda la activación durante 15 minutos. Mantenga la reacción en el pH objetivo agregando rápidamente incrementos de 10 microlitros de hidróxido de sodio molar 0.1.

Cuando se alcance el tiempo óptimo de activación, agregue dos mililitros de dihidrazida adípica molar de 0,5 a la vez al polisacárido activado. Verifique que el pH esté en el rango requerido para la funcionalización del hidróxido. Después de agitar continuamente la mezcla de reacción durante al menos una hora, transfiera la mezcla de reacción a cuatro grados centígrados.

Para reducir la concentración de ADH del producto, dializar la solución de polisacárido derivatizado crudo utilizando el dispositivo de diálisis. Recupere el polisacárido derivatizado de la diálisis y determine la concentración de los polisacáridos e hidrazidas para calcular la relación hidrazida a polisacárido. Prepare un miligramo por mililitro de solución de polisacárido sin modificar para ser utilizado como estándar.

Precaliente el bloque de calentamiento a 140 grados Celsius durante un mínimo de una hora para lograr una temperatura uniforme estable. Use una almohadilla protectora debajo y alrededor del bloque calefactor en caso de derrames de ácido. Agregue volúmenes variables de un miligramo por mililitro de carbohidratos estándar a los tubos de ensayo etiquetados de 13 por 100 borosilicatos en triplicatos y haga el volumen a 100 microlitros con agua para lograr las concentraciones estándar deseadas.

Del mismo modo, configure ensayos de muestra agregando un volumen que contenga cinco microgramos del polisacárido derivatizado a tres tubos de muestra. Agregue 100 microlitros de seis miligramos por mililitro de resorcinol recién preparado a cada tubo. Usando un pipeteador repetido, agregue 300 microlitros del ácido sulfúrico 75% preparado a cada tubo, vórtice los tubos vigorosamente, apuntando el tubo, luego coloque todos los tubos en un bloque de calentador a un ritmo constante en orden secuencial e inmediatamente configure el temporizador durante tres minutos.

A los tres minutos, retire los tubos en el mismo orden y colóquelos directamente en una rejilla en un baño de agua helada. Retire los tubos helados para que se equilibre a temperatura ambiente durante cinco minutos. Lea la absorbancia de todos los tubos en un espectrofotómetro UV-Vis a 430 nanómetros utilizando una cubeta de 10 milímetros de longitud de trayectoria.

Para configurar las reacciones de ensayo, clastre y organice los tubos estándar etiquetados en el bastidor de tubos en orden de concentración creciente. Usando una micropipeta calibrada, agregue 100 microlitros de los estándares a cada tubo correspondiente. Para el estándar cero, utilice 100 microlitros del búfer de muestra.

Del mismo modo, prepare y organice los tubos de muestra. Luego, utilizando una micropipeta calibrada de 1, 000 microlitros, agregue 875 microlitros de tampón de ensayo a todos los tubos de ensayo. Para comenzar la reacción del ensayo, agregue 25 microlitros de ácido trinitrobenceno sulfónico al 1% a cada tubo de ensayo en el orden predeterminado dentro de los cinco minutos.

Vórtice los tubos de ensayo durante dos segundos a alta velocidad, asegurándose de que el líquido se arremolina a una altura de media pulgada desde la abertura del tubo. Registre la hora de inicio del ensayo y establezca el temporizador en dos horas. Luego coloque el estante del tubo de ensayo en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos horas.

Cuando termine el tiempo, vórtice los tubos y proceda a la recopilación de datos. El dextrano ADH se ensayó para dextrano utilizando el ensayo de ácido sulfúrico resorcinol. Se trazó un tubo estándar típico que usaba glucosa como el estándar de azúcar.

El contenido de hidrazida en polisacáridos o dextranos derivatizados se determinó mediante el ensayo TNBS. El nivel de derivatización se calculó como hidruros por 100 kilodaltons de dextrano para facilitar la comparación entre polímeros de diferentes pesos moleculares medios. Es posible que sea necesario adaptar el protocolo descrito aquí para un polisacárido específico.

La química CDAP se puede utilizar para funcionalizar polisacáridos para su uso con una amplia variedad de reactivos de conjugación. Se puede utilizar, por ejemplo, para biotinilar polisacáridos para su uso en ELISA. Las proteínas pueden estar directamente relacionadas con los polisacáridos activados por CDAP, pero esto generalmente requiere cierta optimización para un polisacárido específico.

El rendimiento de conjugación puede ser de más del 75% El uso de la química CDAP ha permitido vacunas conjugadas de bajo costo, como las fabricadas, por ejemplo, por el Instituto Serum de la India.