Preparación de muestras para el análisis bioinformático de la metilación del ADN: estrategia de asociación para la obesidad y estudios de rasgos relacionados

Las tecnologías ómicas a gran escala se utilizan cada vez más en estudios centrados en la obesidad. La epigenética puede ser un vínculo entre la exposición y los resultados de salud. Este tipo de estudio genera una enorme cantidad de datos.

Teniendo en cuenta esto, es importante estandarizar los protocolos para que los datos sean técnicamente comparables. En este estudio, vamos a proponer una tubería para obtener y analizar los datos de metilación del ADN. El mismo protocolo se puede aplicar tanto para las versiones 400K como para las epic.

Día uno: Tratamiento con bisulfito. Comience por desnaturalizar el ADN genómico, luego agregue los reactivos de conversión. Es necesario seguir las recomendaciones del kit.

Y tratar el ADN desnaturalizante con bisfosfato. A continuación, incubar las muestras en un termociclador. Realice los pasos de lavado utilizando el tampón de lavado.

Día dos: Amplificación después del ensayo de metilación, protocolo manual. Precalienta el horno de hibridación a 37 grados centígrados y deja que la temperatura se equilibre. Disperse 20 microlitros de MA1 en los pozos de la placa.

Transfiera cuatro microlitros del ADN a los pozos correspondientes en la placa. Disperse cuatro microlitros de solución de hidróxido de sodio en los pocillos de la placa. Selle la placa con un sello de plástico.

Vórtice la placa para mezclar los reactivos con muestras. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Disperse 68 microlitros de RPM en cada pozo, y luego 75 microlitros de MSM sin eliminar la solución previa.

Use un sello nuevo para cubrir la placa. Vórtice la placa durante un minuto. Incubar en el horno de hibridación durante 20 a 24 horas a 37 grados centígrados.

Día tres: Hibridación tras el ensayo de metilación, protocolo manual. Precaliente el bloque insertando la placa a 37 grados centígrados. Retire con cuidado la placa del horno de hibridación.

Centrifugar por pulso la placa. Retire el sello de la placa. Agregue 50 microlitros de FMS a cada recipiente de muestra.

Vórtice la placa durante un minuto. Centrifugar la placa necesita. Luego coloque la placa sellada en el bloque de calentamiento a 37 grados Celsius durante una hora.

Agregue 100 microlitros de PM1 a cada pozo que contenga muestras. Selle la placa de nuevo. Vórtice la placa durante un minuto.

Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego pulse en la centrífuga durante un minuto, luego agregue 300 microlitros de 100% 2-propanol a cada pozo con muestra. Selle la placa de nuevo.

Mezcle todo el contenido invirtiendo la placa al menos 10 veces. Incubar a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, y luego centrifugar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Retire el sello de la placa.

Invierta rápidamente la placa en un lugar apropiado, descartando el sobrenadante. Toque firmemente varias veces hasta que haya notado que todos los pozos están libres de líquido. A temperatura ambiente, deje la placa boca abajo y descubierta durante una hora.

Después de secar todo el líquido, es necesario ver paletas azules en el fondo de los pozos. Luego agregue 46 microlitros de RA1 a cada pozo. Aplique el sello térmico a la placa.

Sostenga con fuerza para realizar el sellado de manera uniforme. Coloque el plato en el horno de hibridación a 48 grados centígrados durante una hora, luego vórtice durante un minuto. Pulse en la centrífuga y caliente la placa a 95 grados centígrados durante una hora.

Prepare las cámaras BeadChip Hyb juntas. En este siguiente paso, disperse 400 microlitros de PB2 en los reservorios en las cámaras Hyb. Después de llenar los depósitos de hyb Chamber con PB2, coloque la tapa inmediatamente.

Cargue cuidadosamente cada muestra de la placa en la entrada de muestra del microarray. Cargue los insertos de la cámara Hyb que contienen los microarrays en la cámara Hyb. Cierre la cámara Hyb transversalmente para evitar posibles desplazamientos de la cámara Hyb.

Día cuatro: Tinción después del ensayo de metilación, protocolo manual. Después de la incubación nocturna, retire todos los microarrays de los insertos. Y lave los microarrays lenta y ligeramente, un total de 10 veces, hacia arriba y hacia abajo.

Mueva los microarrays al contenedor PB1 número dos y repita 10 veces, hacia arriba y hacia abajo. Coloque los marcos de la cámara de flujo en la posición correcta y luego cada microarray. Use un espaciador transparente en la parte superior de cada uno.

La barra de alineación debe colocarse en el accesorio de alineación. Se debe colocar una placa posterior de vidrio en la parte superior del espaciador. A continuación, conecte las abrazaderas metálicas a las cámaras de flujo.

Use tijeras para recortar los extremos de los espaciadores de la cámara de flujo. Coloque la cámara de flujo con el microarray en el bastidor de la cámara. Pipeta 150 microlitros de RA1.

Incubar durante 30 minutos y repetir cinco veces. Pipetear 450 microlitros de XC1, e incubar durante 10 minutos. Pipete 450 microlitros de XC2 e incube durante 10 minutos.

Pipeta 200 microlitros de TEM. Incubar durante 15 minutos. Pipeta 450 microlitros de 95%formamida.

Incubar durante un minuto, repitiendo dos veces. Incubar durante cinco minutos. Pipeta 450 microlitros de XC3.

Incubar durante un minuto y repetir. En este paso se dispensarán los siguientes reactivos, 250 microlitros de STM, 450 microlitros de XC3, y 250 microlitros de ATM. Realice el siguiente esquema de repetición.

Después de todas las repeticiones e incubaciones, coloque los microarrays en una rejilla de pie y sumérjalos en el recipiente de lavado. Moviéndose lenta y ligeramente con movimientos hacia arriba y hacia abajo, 10 veces. Seque los microarrays con el desecador al vacío durante 50 a 55 minutos.

Una vez que los microarrays estén secos, proceda a obtener una imagen del microarray con el escaneo. En esta imagen, podemos ver todos los protocolos utilizados, desde la elección de los participantes hasta el procesamiento de los archivos IDAT obtenidos el último día del experimento de metilación. Los archivos se transfirieron a la computadora donde se realizó el análisis bioinformático.

Los análisis se procesaron utilizando R Studio y el paquete Bioconductor ChAMP. Asegúrese de tener al menos ocho gigabytes de RAM en su computadora. Otros análisis bioinformáticos, como el enriquecimiento de genes, se realizaron para presentar mejor los datos al lector.

En esta tabla, podemos observar los dos grupos utilizados en este estudio, obesos y no obesos. Hubo una diferencia entre los grupos para las variables, índice de masa corporal, circunferencia abdominal, masa grasa en kilogramos y masa grasa en porcentaje. Observando el esquema presentado en esta figura, pudimos entender que el protocolo propuesto era adecuado para nuestros datos.

Y después del análisis bioinformático, se presentaron un total de 409, 887 sondas después de que se realizó el filtro. La gráfica de densidad reveló que todas las muestras tenían densidades similares de distribución beta. No se excluyeron muestras sobre la base de estos análisis.

El análisis de descomposición de valores singulares de los datos normalizados reveló que el IMC, el doble C y el FM influyeron significativamente en la variabilidad de los datos de metilación del ADN. La estimación del tipo de célula reveló que tanto las células asesinas naturales, las células NK y B, eran más altas en las mujeres obesas. Los niveles de metilación del ADN entre mujeres obesas y no obesas fueron diferentes antes y después de la corrección del tipo de célula.

Antes de la corrección, se observaron 43.463 posiciones de metilación diferentes. Y después de eso, 3, 329 CPG se mantuvieron significativamente. Un total de 162 GPC fueron hipometiladas, y 576 fueron hipermetiladas en obesos en comparación con los no obesos.

Los datos están disponibles en la base de datos GEO bajo el código de registro GSE166611. Presentamos los sitios de GPC que se asociaron con las características específicas de los participantes que se observaron en SVD. Para la masa grasa, se encontraron 13, 222 sitios de CPG.

Hubo 6, 159 GPC relacionadas con la masa grasa en la región promotora. 470 hipometilados y 94 hipermetilados. Los genes respectivos de los sitios asociados se enriquecieron y ahora se muestran.

Observamos que el protocolo propuesto es capaz de identificar dentro de sus patrones de metilaciones, y es correcto relacionarse dentro de sus metilaciones. Nuestro resultado confirma que un estilo de vida obesogénico puede promover cambios epigenéticos en el ADN humano.