Name: Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar complejos SMAD en células endoteliales bajo distintas condiciones de tensión por cizallamiento usando ensayo de ligadura de proximidad. Este método robusto facilita el estudio de interacciones proteicas en biología vascular.

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Agradecemos a la Dra. Maria Reichenbach y al Dr. Christian Hiepen por su apoyo en el sistema de configuración de flujo y a Eleanor Fox y Yunyun Xiao por leer críticamente el manuscrito. P-L.M. fue financiado por la escuela internacional de investigación Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recibió financiación de la DFG-SFB1444. La Figura 1 se creó utilizando BioRender.

1. Cultivo celular y exposición al estrés por cizallamiento de fluidos
NOTA: Las CE de vena umbilical humana (HUVEC) se utilizaron como ejemplo para estudiar la interacción inducida por SS de los SMAD. El protocolo que se describe a continuación se puede aplicar a cada tipo de célula sensible a SS.
<ol><li>Cubra el portaobjetos de 6 canales con gelatina de piel porcina al 0,1% en PBS durante 30 min a 37 °C.</li>
	<li>HUVEC de semillas en portaobjetos pre-recubiertos de 6 canales a una densidad de 2,5 x 106 células por ml en 30 μL de medio completo M199. NOTA: Para obtener más información sobre cómo sembrar celdas en la diapositiva de flujo, consulte la referencia24.</li>
	<li>Deje que las células se adhieran durante 1 h a 37 °C en una incubadora humidificada.</li>
	<li>Añadir 60 μL de medio completo M199 precalentado a cada uno de los reservorios.</li>
	<li>Cultivo durante 2 días, con un intercambio medio suave una vez al día, a 37 °C en una incubadora humidificada.<ol>
<li>Aspire los reservorios completamente, agregue 120 μL de medio completo M199 precalentado en uno de los reservorios y aspire desde el otro lado.</li>
		<li>Añadir 60 μL de medio completo M199 precalentado a ambos reservorios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensamble e inicie la configuración de flujo como se detalla en la referencia25.<ol>
<li>Montar tubos en unidades fluídicas. Aquí, se utilizan tubos de silicona con un diámetro de 0,8 mm y 1,6 mm para aplicar esfuerzos de corte de 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2, respectivamente. NOTA: El material y la longitud del tubo deben permanecer constantes, ya que los cambios podrían influir en la tensión de corte resultante. En general, se pueden utilizar otras combinaciones de sistemas de bomba y tuberías, siempre que se conozca la tensión de cizallamiento resultante y la bomba cree un flujo laminar constante.</li>
		<li>Llene los depósitos con una cantidad adecuada de medio completo M199 precalentado (mínimo 10 ml).</li>
		<li>Conecte las unidades fluídicas con el tubo al sistema de bombeo y realice un pre-funcionamiento sin celdas para equilibrar el medio y eliminar el aire restante25.</li>
		<li>Conecte en serie los canales individuales de la diapositiva de 6 canales entre sí mediante tubos de conexión serie. El primer y el último canal de la corredera se conectarán a la tubería ensamblada en 1.6.1 (consulte la Figura 1A para un esquema). Tenga cuidado de no introducir aire en el sistema, ya que esto podría dañar gravemente las células. Puede encontrarse más información sobre la conexión serie en la referencia26.</li>
		<li>Para la exposición de las células a altos niveles de esfuerzo cortante (>20 dyn/cm2), utilice una fase de rampa, es decir, aumente la tensión de cizallamiento por pasos con las fases de adaptación. Los pasos se pueden establecer en incrementos de 5 dinas/cm2 por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fijación
<ol><li>Separe las correderas de las bombas después de la exposición al fluido SS. Use abrazaderas en el tubo al separarse, para evitar el derrame medio en la incubadora.</li>
	<li>El flujo de transferencia inmediata se desliza sobre hielo, mientras que el tubo restante se separa secuencialmente. Al retirar el tubo de los depósitos, el depósito del otro lado debe mantenerse cerrado con un dedo para evitar atrapar burbujas de aire en el canal. Esto podría interferir con los pasos de fijación.</li>
	<li>Manteniendo las células en hielo, aspire el medio cuidadosamente desde los reservorios, pero no desde el canal donde residen las células. Posteriormente, lavar las muestras con PBS estéril en frío (4 °C) con tres veces el volumen del canal (90 μL). Agregue PBS en un reservorio y aspire cuidadosamente desde el otro reservorio. Repita este paso en cada uno de los 6 canales por diapositiva. NOTA: Para todas las etapas de lavado e incubación, la solución respectiva se agrega en uno de los reservorios, lo que conduce a un intercambio de soluciones en el canal. Para permitir la sustitución completa de soluciones en el canal, el exceso de solución se aspira desde el otro reservorio. La solución en la parte superior de las células en el canal no se elimina. Las células no deben secarse en ningún momento. Por lo tanto, es importante lavar con cuidado sin ninguna inserción de burbujas de aire en los portaobjetos.</li>
	<li>Fije las células agregando 90 μL de solución tamponada de PFA al 4% en el mismo reservorio donde se agregó el PBS de antemano y aspire de manera similar el líquido del otro reservorio. Repita este paso en cada canal de cada diapositiva. Después de la adición de la solución de PFA, transfiera las muestras del hielo a temperatura ambiente (RT) e incube durante 20 minutos. PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y debe manipularse con cuidado. Use guantes y trabaje bajo una campana de humos.</li>
	<li>Lave las celdas 3x con PBS (RT) agregándolas en un depósito y aspirando cuidadosamente desde el otro depósito. Vacíe solo los depósitos, asegurándose de no secar el canal. Repita este paso para cada uno de los 6 canales por diapositiva.</li>
	<li>Apague la fijación de PFA agregando 90 μL de cloruro de amonio ambiental de 50 mM en PBS en uno de los reservorios. Aspirar el exceso de solución del otro reservorio. Repita el proceso para cada canal de la diapositiva. Incubar las muestras durante 10 min en RT.</li>
	<li>Lavar como se describe en el paso 2.5. NOTA: En este punto, las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante la noche, o el protocolo puede continuarse inmediatamente con el bloqueo y la incubación primaria de anticuerpos (consulte el paso 3).</li>
</ol>3. Bloqueo e incubación primaria de anticuerpos
<ol><li>Para permeabilizar las células, agregue 90 μL de Triton-X-100 al 0,3% en PBS en un reservorio vacío y aspire desde el otro reservorio para cada canal. Incubar durante 10 min en RT.</li>
	<li>Lavar como se describe en el paso 2.5.</li>
	<li>Añadir 90 μL de solución estéril de bloqueo de PLA en un reservorio de un canal y aspirar desde el otro lado. Repita este paso para cada canal. Bloque durante 1 h a 37 °C en una cámara humidificada.<ol>
<li>Para hacer una cámara humidificada, use un plato de 10 cm con tejido húmedo sellado con película de cera y coloque el plato en la incubadora. Alternativamente, se pueden utilizar otros formatos de cámara de humedad que proporcionan una atmósfera húmeda. NOTA: Alternativamente, se puede usar una solución de bloqueo de fabricación propia (por ejemplo, 3% (p/v) de BSA en PBS, filtrada estéril).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar anticuerpos primarios (1:100) en el diluyente de anticuerpos PLA. Preparar 30 μL de la solución por canal. Agregue ambos anticuerpos primarios simultáneamente y vórtice. NOTA: Alternativamente, se puede usar un diluyente de anticuerpos de fabricación propia (por ejemplo, 1% (p/v) de BSA en PBS). Los anticuerpos utilizados aquí son combinaciones de SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 y fosfo-SMAD1/5-SMAD4. La información detallada se puede encontrar en la Tabla de Materiales.</li>
	<li>Antes de la aplicación de anticuerpos primarios, aspire la solución bloqueadora de los reservorios y, también, con cuidado desde el canal. Pipetear 30 μL de la solución de anticuerpos primario inmediatamente en el canal vacío inclinando el canal mientras se agrega la solución. NOTA: Realice la eliminación de la solución de bloqueo y la adición de la solución de anticuerpos canal por canal para garantizar que las células no se sequen en el medio.</li>
	<li>Incubar muestras con los anticuerpos primarios durante la noche en cámaras humidificadas a 4 °C. NOTA: La incubación también se puede realizar durante 1 h a temperatura ambiente, si se desea continuar con los siguientes pasos en el mismo día.</li>
</ol>4. Incubación de la sonda PLA
NOTA: Para todos los pasos de la sección 4.1-7.3, los tampones de lavado A y B se almacenan a 4 °C y deben calentarse a RT antes del uso.
<ol><li>Diluya las sondas pla (+)-ratón y (-)-conejo a 1:5 en solución de diluyente de anticuerpos PLA (o BSA al 1%). Preparar 30 μL por canal.</li>
	<li>Lave las muestras 2x durante 5 min utilizando 90 μL del tampón de lavado A en RT agregándolo en uno de los depósitos y aspirando cuidadosamente desde el otro depósito. Repita este paso para cada uno de los 6 canales por diapositiva.</li>
	<li>Aspire el tampón de lavado A con cuidado y agregue 30 μL de solución de sonda de PLA (preparada en la etapa 4.1), similar a la adición de anticuerpos primarios en la etapa 3.5.</li>
	<li>Incubar muestras durante 1 h a 37 °C en una cámara humidificada.</li>
</ol>5. Ligadura
<ol><li>Lave las muestras 2x durante 5 min utilizando 90 μL del tampón de lavado A en RT, como se describe en 4.2.</li>
	<li>Prepare una dilución 1:5 del tampón de ligadura en agua desionizada. Use este tampón para diluir la enzima ligasa a 1:40 (en hielo). Utilice 30 μL por canal.</li>
	<li>Aspire completamente el tampón de lavado A y agregue la solución de ligadura como se describe en 3.5.</li>
	<li>Incubar muestras durante 30 min a 37 °C en una cámara humidificada.</li>
</ol>6. Amplificación
<ol><li>Lavar las muestras 2x durante 2 min utilizando 90 μL de tampón de lavado A en RT, como se describe en 4.2.</li>
	<li>Prepare el tampón de amplificación diluyéndolo 1:5 en agua desionizada y úselo para diluir la enzima polimerasa a 1:80 (en hielo). Proteger de la luz. Preparar 30 μL por canal.</li>
	<li>Aspire completamente el tampón de lavado A e inmediatamente agregue la solución de amplificación preparada en el canal vacío, como se describe en 3.5. Incubar muestras durante 100 min a 37 °C en una cámara humidificada.</li>
</ol>7. Montaje
<ol><li>Lave las muestras 2x durante 10 min utilizando 90 μL de Wash Buffer B en RT como se describe en 4.2. Añadir DAPI (1:500) a partir de 1 mg/ml de solución madre (en agua desionizada) en el primer lavado para teñir los núcleos. No seque el canal.</li>
	<li>Diluya el tampón de lavado B en agua desionizada (1:10) y lave 1x con 90 μL de solución B tampón 0.1x como se describe en 4.2.</li>
	<li>Aspire completamente el tampón de lavado B e inmediatamente agregue 2-3 gotas del medio de montaje líquido en un depósito. Distribúyalo en el canal inclinando la diapositiva. Guarde las muestras a 4 °C en un ambiente humidificado hasta la obtención de imágenes.</li>
</ol>8. Adquisición de imágenes
<ol><li>Adquirir imágenes usando un microscopio de fluorescencia. Asegúrese de que los filtros respectivos que se ajustan a las sondas pla fluorescentes estén disponibles. NOTA: Es beneficioso hacer uso de un microscopio confocal, si es posible, ya que las manchas plasmáticas obtenidas están más definidas. Esto también admite un mayor procesamiento de imágenes y análisis de datos.</li>
</ol>9. Análisis y cuantificación de imágenes utilizando ImageJ/FIJI
<ol><li>Procese las imágenes exportadas (.tiff) con un programa de procesamiento de imágenes, como ImageJ27. NOTA: Todos los scripts utilizados dentro de este estudio y que son necesarios para el conteo automático de eventos celulares, nucleares y todos los eventos PLA (por celda) se pueden encontrar en un repositorio de GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Realizar análisis estadísticos utilizando cualquier programa o herramienta adecuada.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

El protocolo basado en PLA descrito aquí ofrece una forma eficiente de determinar la proximidad de dos proteínas (por ejemplo, su interacción directa) en CE expuestas a tensión cortante con resolución cuantitativa y espacial. Mediante el uso de portaobjetos de flujo con múltiples canales paralelos, se pueden examinar varias interacciones de proteínas diferentes al mismo tiempo en células en condiciones mecánicas idénticas. Por el contrario, los sistemas de cámara de flujo personalizados a menudo hacen uso de un solo cana...

Las proteínas de la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta (TGFβ) son citoquinas pleiotrópicas con una variedad de miembros, incluyendo TGFβs, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y activinas1,2. La unión al ligando induce la formación de oligómeros receptores que conducen a la fosforilación y, por lo tanto, a la activación del SMAD regulador citosólico (R-SMAD). Dependiendo de la subfamilia de ligandos, se activan diferentes R-SMADs1,2. Mientras que TGFβs y Activinas inducen principalmente la fosforilación de SMAD2/3, los BMP inducen la fosforilación de SMAD1/5/8. Sin embargo, se acumulan evidencias de que los BMP y TGFβs/Activinas también activan los R-SMAD de la otra subfamilia respectiva, en un proceso denominado como 'señalización lateral'3,4,5,6,7,8 y que existen complejos SMAD mixtos formados por ambos, SMAD1/5 y SMAD2/3, miembros3,9 . Dos R-SMAD activados posteriormente forman complejos triméricos con el mediador común SMAD4. Estos complejos de factores de transcripción son capaces de translocarse al núcleo y regular la transcripción de genes diana. Los SMADs pueden interactuar con una variedad de diferentes co-activadores transcripcionales y co-represores, lo que lleva a la diversificación de las posibilidades de regular los genes diana10. La desregulación de la señalización SMAD tiene graves implicaciones en una variedad de enfermedades. En línea con esto, la señalización desequilibrada de TGFβ/BMP puede conducir a patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria o aterosclerosis3,11,12,13,14.
Las células endoteliales (CE) forman la capa más interna de los vasos sanguíneos y, por lo tanto, están expuestas al estrés cortante (SS), una fuerza de fricción ejercida por el flujo viscoso de la sangre. Curiosamente, las CE que residen en las partes de la vasculatura, que están expuestas a altos niveles de SS laminar uniforme, se mantienen en un estado homeostático y quiescente. Por el contrario, las CE que experimentan SS bajas y no uniformes, por ejemplo, en bifurcaciones o en la menor curvatura del arco aórtico, son proliferativas y activan vías inflamatorias15. A su vez, los sitios de CE disfuncionales son propensos a desarrollar aterosclerosis. Curiosamente, las CE en estas áreas de ateróprona muestran niveles aberrantemente altos de SMAD2/3 y SMAD1/516 activados,17,18. En este contexto, se encontró que la señalización mejorada de TGFβ/BMP era un evento temprano en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas19 y se encontró que la interferencia con la señalización de BMP reduce notablemente la inflamación vascular, la formación de ateroma y la calcificación asociada20.
El Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA) es una técnica bioquímica para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína21,22. Se basa en la especificidad de anticuerpos de diferentes especies que pueden unirse a proteínas diana de interés, lo que permite una detección altamente específica de interacciones de proteínas endógenas a nivel de una sola célula. Aquí, los anticuerpos primarios tienen que unirse a su epítopo objetivo a una distancia de menos de 40 nm para permitir la detección23. Por lo tanto, el PLA es muy beneficioso sobre los enfoques tradicionales de coinmunoprecipitación, donde se necesitan varios millones de células para detectar interacciones endógenas de proteínas. En el PLA, los anticuerpos secundarios específicos de la especie, unidos covalentemente a fragmentos de ADN (denominados sondas Plus y Minus), se unen a los anticuerpos primarios y si las proteínas de interés interactúan, las sondas Plus y Minus se acercan mucho. El ADN se liga en el siguiente paso y la amplificación del círculo rodante del ADN circular es posible. Durante la amplificación, los oligonucleótidos complementarios marcados fluorescentemente se unen al ADN sintetizado, lo que permite que estas interacciones proteicas se visualicen mediante microscopía de fluorescencia convencional.
El protocolo descrito aquí permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de transcripción SMAD activos en condiciones de SS ateroprotectoras y ateroprofónicas in vitro utilizando PLA. SS se genera a través de un sistema de bomba neumática programable que es capaz de generar flujo unidireccional laminar de niveles definidos y permite aumentos escalonados de los caudales. Este método permite la detección de interacciones entre SMAD1/5 o SMAD2/3 con SMAD4, así como complejos mixtos-R-SMAD. Se puede ampliar fácilmente para analizar las interacciones de los SMAD con los co-reguladores transcripcionales o con complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD. La Figura 1 muestra los principales pasos del protocolo que se presentan a continuación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del protocolo descrito. (A) Las células sembradas en portaobjetos de 6 canales se exponen a la tensión de cizallamiento con un sistema de bomba neumática. (B) Las células fijas se utilizan para experimentos de PLA o para condiciones de control. (C) Las imágenes de los experimentos de PLA se adquieren con un microscopio de fluorescencia y se analizan utilizando el software de análisis ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Diapositiva VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>Corredera de 6 canales</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Carl Roth</td><td>K298.1</td><td>Enfriamiento</td></tr> de <tr><td>la albúmina sérica bovina</td><td>Carl Roth</td><td>8076.4</td><td>Bloqueo</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>Tinción ADN/Núcleos</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In Reactivos de detección in situ Green</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92014</td><td>Kit de PLA que contiene ligasa, tampón de ligadura, polimerasa y tampón de amplificación (con oligonucleótidos marcados en verde)</td></tr><tr><td>Sonda de PLA in situ Duolink Anti-Mouse MINUS</td><td>Sonda Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92004</td><td>MINUS</td></tr><tr><td>Sonda PLA in situ Duolink Sonda Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92002</td><td>PLUS</td></tr><tr><td>Tampones de lavado in situ Duolink, fluorescencia</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO82049</td><td>tampones de lavado PLA A y B</td></tr><tr><td>Suplemento de crecimiento de células endoteliales</td><td>Suplemento de Corning</td><td></td><td>para medio (ECGS)</td></tr><tr><td>Ternero fetal Suplemento de suero</td><td></td><td></td><td>para medio</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>FIJI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído 4% tamponada</td><td>KLINIPATH/VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Medio</td><td></td><td></td> completo <td>M199 medio basal +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +&nbsp; 25 &micro; g/mL de hep +&nbsp; &nbsp; 50 y micro; g/mL ECGS</td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina, Tipo A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Uso 0.1% en PBS para el recubrimiento de canales de flujo</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>GarphPad</td><td></td><td>Programa estadístico utilizado para los gráficos y cálculos estadísticos</td></tr><tr><td>Heparina sal sódica de mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>suplemento para</td></tr> <tr><td>HUVECs</td><td></td><td></td> <td>medios (Hep)</td></tr><tr><td>ibidi Medio de montaje</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>Medio de montaje líquido</td></tr><tr><td>ibidi Sistema de bomba ibidi</td><td></td><td>10902</td><td>bomba neumática</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>suplemento para medio (L-Glu)</td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>Medio</td> base</tr><tr><td>ratón anti-SMAD1 Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab53745</td><td>Adecuado para PLA</td></tr> ratón <tr><td>anti-SMAD2/3 Anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>No apto para PLA en combinación con CST 9515</td></tr><tr><td>ratón anti-SMAD4 Anticuerpo</td><td>Sanata Cruz Biotechnology</td><td>sc-7966</td><td>Adecuado para</td></tr><tr><td>PLA Penicilina 10.000U/ml /Estreptomicina 10mg/ml</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>suplemento para medio (P/ S)</td></tr><tr><td>Set de perfusión BLANCO</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>Tubos utilizados para 1 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Juego de perfusión AMARILLO y VERDE</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>Tubos utilizados para 30 dyn/cm2</td></tr><tr><td>conejo antifosfo SMAD1/5 Anticuerpo</td><td>Tecnologías de señalización celular 9516</td><td></td><td>Adecuado para</td></tr><tr><td>PLA conejo anti-SMAD2/3 XP</td><td>Tecnologías de señalización celular</td> de anticuerpos <td>8685</td><td>Adecuado para PLA</td></tr><tr><td>conejo anti-SMAD4</td><td>Tecnologías de señalización celular de</td> anticuerpos <td>9515</td><td>No apto para PLA en combinación con BD</td></tr><tr><td>610843 Conector serie para &micro;-Slides Tubos de</td> conexión serie <td>ibidi</td><td>10830</td><td>Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Carl Roth</td><td>6683.1</td><td>Permeabilización</td></tr></tbody></table>

visualización y cuantificación de la señalización tgfβ/bmp/smad bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

La señalización del factor de crecimiento transformador β (TGFβ)/proteína morfogenética ósea (BMP) está estrechamente regulada y equilibrada durante el desarrollo y la homeostasis del sistema de vasculatura Por lo tanto, la desregulación en esta vía de señalización da como resultado patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria y aterosclerosis. Las células endoteliales (CE), como la capa más interna de los vasos sanguíneos, están constantemente expuestas al estrés por cizallamiento de líquidos (SS). Se ha demostrado que los patrones anormales de SS de líquido mejoran la señalización TGFβ / BMP, que, junto con otros estímulos, inducen aterogénesis. En relación con esto, se encontró que la ateroprofona, SS laminar baja, mejora la señalización TGFβ / BMP, mientras que la SS ateroprotectora y laminar alta disminuye esta señalización. Para analizar de manera eficiente la activación de estas vías, diseñamos un flujo de trabajo para investigar la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS laminar baja y SS laminar alta utilizando un sistema de bomba neumática disponible comercialmente y un ensayo de ligadura de proximidad (PLA).
La señalización activa de TGFβ/BMP requiere la formación de complejos SMAD triméricos que consisten en dos SMAD reguladores (R-SMAD); SMAD2/3 y SMAD1/5/8 para la señalización TGFβ y BMP, respectivamente) con un mediador común SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA dirigido a diferentes subunidades del complejo SMAD trimérico, es decir, R-SMAD /co-SMAD o R-SMAD/R-SMAD, la formación de complejos activos de factor de transcripción SMAD se puede medir cuantitativa y espacialmente utilizando microscopía de fluorescencia.
El uso de diapositivas de flujo con 6 pequeños canales paralelos, que se pueden conectar en serie, permite la investigación de la formación del complejo del factor de transcripción y la inclusión de los controles necesarios. 
El flujo de trabajo explicado aquí se puede adaptar fácilmente para estudios dirigidos a la proximidad de los SMAD a otros factores de transcripción o a complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD, en diferentes condiciones de SS fluidos. El flujo de trabajo presentado aquí muestra una forma rápida y efectiva de estudiar la señalización fluida inducida por SS TGFβ / BMP en ECs, tanto cuantitativa como espacialmente.

Anteriormente hemos utilizado PLA para detectar interacciones de diferentes proteínas SMAD3 y analizado cambios inducidos por estrés cortante en la fosforilación de SMAD28.
Aquí, ambos métodos se combinaron con el protocolo descrito anteriormente. Los HUVEC fueron sometidos a un esfuerzo cortante de 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2 y analizados para detectar interacciones de factores de transcripción SMAD. Mostramos que, en compara...

Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.

Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

Este protocolo permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de factores de transcripción en diferentes condiciones de estrés cortante, y será beneficioso para la investigación en biología vascular. La principal ventaja de este protocolo es el uso de canales de flujo microfluídico que permiten la investigación de varios pares de anticuerpos, incluidos los controles respectivos simultáneamente. Para comenzar, cubra la diapositiva de seis canales agregando gelatina de piel porcina al 0.1% preparada en PBS en los canales durante 30 minutos a 37 grados centígrados.Vacíe los canales de la solución de gelatina y sepe Huvecs en los portaobjetos de seis canales precodificados a una densidad de 2,5 veces 10 a la sexta celda por mililitro en 30 microlitros de medio completo M199. Deje que las células se adhieran durante una hora a 37 grados centígrados en la incubadora humidificada. Agregue 60 microlitros de medio completo M199 preadvertido a cada uno de los reservorios.Cultive las células a 37 grados centígrados durante dos días en una incubadora humidificada con reemplazo medio después de 24 horas. Monte el tubo de silicio en las unidades fluídicas, llene los depósitos con un mínimo de 10 mililitros de medio completo M199 preadvertido. Conecte las unidades fluídicas con tubos al sistema de bombeo y realice la pre-ejecución sin celdas para equilibrar el medio y eliminar el aire restante.Conecte los canales individuales en la diapositiva de seis canales utilizando el tubo de conexión serie. Conecte el primer y último canal de la corredera a los tubos montados en la unidad de fluidos. Para la exposición de las células a altos niveles de estrés puro, aumente el estrés puro paso a paso con fases de adaptación, estableciendo los pasos en incrementos de cinco dinas por centímetro cuadrado por 30 minutos.Use los grupos en el tubo para separar los portaobjetos de las bombas después de la exposición al esfuerzo de cizallamiento del fluido, evitando derrames medios en la incubadora y transfiera los portaobjetos de flujo en hielo. Mientras separa el tubo de los depósitos, use el dedo para cerrar el otro lado del depósito para evitar atrapar las burbujas de aire en el canal. Manteniendo el deslizamiento de flujo sobre hielo, aspire el medio cuidadosamente desde los reservorios, pero no desde el canal donde residen las células.Lave las muestras con 90 microlitros de PBS estéril en frío agregando PBS a un reservorio y aspire cuidadosamente desde el otro reservorio, luego repita para todos los canales. Fije las células agregando 90 microlitros de solución tamponada de 4% de PFA al mismo reservorio donde se agregó el PBS y aspire el líquido del otro reservorio como se demostró. Después de fijar las células en los seis canales, transfiera las muestras del hielo a temperatura ambiente e incube durante 20 minutos.Lave las células tres veces con PBS agregando PBS a un reservorio y arrancándolo cuidadosamente desde el otro reservorio en todos los canales, teniendo cuidado de no secar los canales. Apague el PFA de acceso agregando 90 microlitros de cloruro de amonio ambiental de 15 milimolares preparado en PBS a uno de los reservorios. Aspirar desde el otro reservorio e incubar las células durante 10 minutos.Permeabilizar las células añadiendo 90 microlitros de 0,3%Tritón X 100 preparados en PBS en el depósito vacío. Aspire desde el otro reservorio para cada canal e incube durante 10 minutos, luego lave tres veces con PBS como se demostró anteriormente. A 90 microlitros de solución estéril de bloqueo de PLA a un reservorio.Aspirar desde el otro lado para cada canal e incubar durante una hora a 37 grados centígrados en una cámara humidificada. Agregue anticuerpos primarios en el diluyente de anticuerpos PLA y el vórtice. Aspire cuidadosamente la solución de bloqueo de los reservorios y canales.Agregue 30 microlitros de la solución de anticuerpos primarios inmediatamente en el canal vacío inclinando la diapositiva mientras agrega la solución. Repita para todos los canales e incube a cuatro grados centígrados en la cámara humidificada durante la noche o a 37 grados centígrados durante una hora. Diluya menos conejo y más ratón las sondas PLA de uno a cinco en el diluyente de anticuerpos PLA.Lave todos los canales dos veces agregando 90 microlitros de tampón de lavado A y aspirando como se ha demostrado. Después de aspirar el tampón de lavado, agregue 30 microlitros de solución de sonda de PLA e incube en la cámara humidificada. Diluir el tampón de ligadura de uno a cinco en agua ionizada D y diluir la enzima lygus de uno a 40 en el tampón de ligadura diluido.Después de lavar y aspirar completamente el tampón de lavado A, agregue 30 microlitros de solución de ligadura a los canales vacíos mientras inclina el portaobjetos, e incube en la cámara humidificada. Diluya el tampón de amplificación de uno a cinco en agua desionizada, luego diluya la enzima polimerasa de uno a 80 en el tampón de amplificación diluido en hielo. Después de lavar y aspirar completamente el tampón de lavado A, agregue 30 microlitros de solución de amplificación a los canales vacíos mientras inclina el portaobjetos, e incube en la cámara humidificada.Diluya el DAPI de uno a 500 en el tampón de lavado B y lave todos los canales una vez agregando 90 microlitros de DAPI que contengan el tampón de lavado B, y aspirando como se ha demostrado para vaporizar los núcleos. A continuación, lave todos los canales una vez con el búfer de lavado B sin DAPI. Diluya el tampón de lavado B de uno a 10 en agua desionizada y lave todos los canales una vez con 90 microlitros de tampón de lavado diluido B.Después de aspirar el tampón de lavado B, agregue inmediatamente de dos a tres gotas del medio de montaje líquido a un depósito e incline la corredera para distribuir el medio de montaje en todos los canales.Guarde las muestras a cuatro grados centígrados en un ambiente humidificado hasta la toma de imágenes. Los huvecs estaban expuestos a un estrés alto y bajo. El bajo estrés cortante aumentó las interacciones de la proteína SMAD en el citosol y los núcleos.Los controles de anticuerpos individuales mostraron no a muy pocas señales, lo que demuestra el éxito del experimento. El aumento de la concentración de anticuerpos resultó en un mayor número de eventos de PLA por célula, pero la diferencia en las señales de PLA entre las células expuestas al estrés alto y bajo se redujo. Los tampones de fabricación propia para el bloqueo y la dilución de anticuerpos se pueden utilizar como una alternativa para los tampones comerciales.La cuantificación de los eventos de PLA para soluciones comerciales y de fabricación propia de diluyentes y bloqueantes mostró el mismo patrón de señales de PLA en las áreas citosólica y nuclear. Sin embargo, el número total de eventos de PLA por célula fue mayor con las soluciones comerciales. Se utilizó una combinación de anticuerpos SMAD Dos/Tres, SMAD Cuatro donde el anticuerpo SMAD Cuatro no era adecuado para experimentos de inmunofluorescencia.No hubo diferencias en los eventos de PLA en la condición experimental versus de control, lo que indica la importancia de seleccionar la combinación correcta de anticuerpos para detectar los eventos de PLA. El protocolo descrito se puede adaptar para detectar las interacciones de los complejos de factores de transcripción diferentes de los SMAD y, por lo tanto, ayudar a comprender la regulación génica en condiciones de protección del atero y el atero.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

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Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG) prefabricados en una microplaca de imágenes

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Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal

Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

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