Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

Este protocolo permite a los científicos comparar cuantitativamente el número de complejos de factores de transcripción en diferentes condiciones de estrés cortante, y será beneficioso para la investigación en biología vascular. La principal ventaja de este protocolo es el uso de canales de flujo microfluídico que permiten la investigación de varios pares de anticuerpos, incluidos los controles respectivos simultáneamente. Para comenzar, cubra la diapositiva de seis canales agregando gelatina de piel porcina al 0.1% preparada en PBS en los canales durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

Vacíe los canales de la solución de gelatina y sepe Huvecs en los portaobjetos de seis canales precodificados a una densidad de 2,5 veces 10 a la sexta celda por mililitro en 30 microlitros de medio completo M199. Deje que las células se adhieran durante una hora a 37 grados centígrados en la incubadora humidificada. Agregue 60 microlitros de medio completo M199 preadvertido a cada uno de los reservorios.

Cultive las células a 37 grados centígrados durante dos días en una incubadora humidificada con reemplazo medio después de 24 horas. Monte el tubo de silicio en las unidades fluídicas, llene los depósitos con un mínimo de 10 mililitros de medio completo M199 preadvertido. Conecte las unidades fluídicas con tubos al sistema de bombeo y realice la pre-ejecución sin celdas para equilibrar el medio y eliminar el aire restante.

Conecte los canales individuales en la diapositiva de seis canales utilizando el tubo de conexión serie. Conecte el primer y último canal de la corredera a los tubos montados en la unidad de fluidos. Para la exposición de las células a altos niveles de estrés puro, aumente el estrés puro paso a paso con fases de adaptación, estableciendo los pasos en incrementos de cinco dinas por centímetro cuadrado por 30 minutos.

Use los grupos en el tubo para separar los portaobjetos de las bombas después de la exposición al esfuerzo de cizallamiento del fluido, evitando derrames medios en la incubadora y transfiera los portaobjetos de flujo en hielo. Mientras separa el tubo de los depósitos, use el dedo para cerrar el otro lado del depósito para evitar atrapar las burbujas de aire en el canal. Manteniendo el deslizamiento de flujo sobre hielo, aspire el medio cuidadosamente desde los reservorios, pero no desde el canal donde residen las células.

Lave las muestras con 90 microlitros de PBS estéril en frío agregando PBS a un reservorio y aspire cuidadosamente desde el otro reservorio, luego repita para todos los canales. Fije las células agregando 90 microlitros de solución tamponada de 4% de PFA al mismo reservorio donde se agregó el PBS y aspire el líquido del otro reservorio como se demostró. Después de fijar las células en los seis canales, transfiera las muestras del hielo a temperatura ambiente e incube durante 20 minutos.

Lave las células tres veces con PBS agregando PBS a un reservorio y arrancándolo cuidadosamente desde el otro reservorio en todos los canales, teniendo cuidado de no secar los canales. Apague el PFA de acceso agregando 90 microlitros de cloruro de amonio ambiental de 15 milimolares preparado en PBS a uno de los reservorios. Aspirar desde el otro reservorio e incubar las células durante 10 minutos.

Permeabilizar las células añadiendo 90 microlitros de 0,3%Tritón X 100 preparados en PBS en el depósito vacío. Aspire desde el otro reservorio para cada canal e incube durante 10 minutos, luego lave tres veces con PBS como se demostró anteriormente. A 90 microlitros de solución estéril de bloqueo de PLA a un reservorio.

Aspirar desde el otro lado para cada canal e incubar durante una hora a 37 grados centígrados en una cámara humidificada. Agregue anticuerpos primarios en el diluyente de anticuerpos PLA y el vórtice. Aspire cuidadosamente la solución de bloqueo de los reservorios y canales.

Agregue 30 microlitros de la solución de anticuerpos primarios inmediatamente en el canal vacío inclinando la diapositiva mientras agrega la solución. Repita para todos los canales e incube a cuatro grados centígrados en la cámara humidificada durante la noche o a 37 grados centígrados durante una hora. Diluya menos conejo y más ratón las sondas PLA de uno a cinco en el diluyente de anticuerpos PLA.

Lave todos los canales dos veces agregando 90 microlitros de tampón de lavado A y aspirando como se ha demostrado. Después de aspirar el tampón de lavado, agregue 30 microlitros de solución de sonda de PLA e incube en la cámara humidificada. Diluir el tampón de ligadura de uno a cinco en agua ionizada D y diluir la enzima lygus de uno a 40 en el tampón de ligadura diluido.

Después de lavar y aspirar completamente el tampón de lavado A, agregue 30 microlitros de solución de ligadura a los canales vacíos mientras inclina el portaobjetos, e incube en la cámara humidificada. Diluya el tampón de amplificación de uno a cinco en agua desionizada, luego diluya la enzima polimerasa de uno a 80 en el tampón de amplificación diluido en hielo. Después de lavar y aspirar completamente el tampón de lavado A, agregue 30 microlitros de solución de amplificación a los canales vacíos mientras inclina el portaobjetos, e incube en la cámara humidificada.

Diluya el DAPI de uno a 500 en el tampón de lavado B y lave todos los canales una vez agregando 90 microlitros de DAPI que contengan el tampón de lavado B, y aspirando como se ha demostrado para vaporizar los núcleos. A continuación, lave todos los canales una vez con el búfer de lavado B sin DAPI. Diluya el tampón de lavado B de uno a 10 en agua desionizada y lave todos los canales una vez con 90 microlitros de tampón de lavado diluido B.Después de aspirar el tampón de lavado B, agregue inmediatamente de dos a tres gotas del medio de montaje líquido a un depósito e incline la corredera para distribuir el medio de montaje en todos los canales.

Guarde las muestras a cuatro grados centígrados en un ambiente humidificado hasta la toma de imágenes. Los huvecs estaban expuestos a un estrés alto y bajo. El bajo estrés cortante aumentó las interacciones de la proteína SMAD en el citosol y los núcleos.

Los controles de anticuerpos individuales mostraron no a muy pocas señales, lo que demuestra el éxito del experimento. El aumento de la concentración de anticuerpos resultó en un mayor número de eventos de PLA por célula, pero la diferencia en las señales de PLA entre las células expuestas al estrés alto y bajo se redujo. Los tampones de fabricación propia para el bloqueo y la dilución de anticuerpos se pueden utilizar como una alternativa para los tampones comerciales.

La cuantificación de los eventos de PLA para soluciones comerciales y de fabricación propia de diluyentes y bloqueantes mostró el mismo patrón de señales de PLA en las áreas citosólica y nuclear. Sin embargo, el número total de eventos de PLA por célula fue mayor con las soluciones comerciales. Se utilizó una combinación de anticuerpos SMAD Dos/Tres, SMAD Cuatro donde el anticuerpo SMAD Cuatro no era adecuado para experimentos de inmunofluorescencia.

No hubo diferencias en los eventos de PLA en la condición experimental versus de control, lo que indica la importancia de seleccionar la combinación correcta de anticuerpos para detectar los eventos de PLA. El protocolo descrito se puede adaptar para detectar las interacciones de los complejos de factores de transcripción diferentes de los SMAD y, por lo tanto, ayudar a comprender la regulación génica en condiciones de protección del atero y el atero.