Uso de placas base y un miniscopio preanclado con una lente objetiva para la investigación transitoria de calcio en ratones

Este miniscopio puede reducir el problema de contracción con cemento dental durante el procedimiento de placa base y aumentar la tasa de éxito de las grabaciones de miniscopio de señales de fluorescencia en configuración de dos longitudes. Si no se puede observar el transitorio de fluorescencia durante el recubrimiento base, verifique la expresión del indicador de calcio y la ubicación de una lente de relé en el corte cerebral. Comience con el montaje de la aguja interna de un catéter intravenoso de calibre 20 con un diámetro de un milímetro en el brazo estereotáxico.

Baje el catéter en el maíz ventral ammonis 1 en la región objetivo. Luego, baje la aguja de microinyección a una velocidad de 100 a 200 micrómetros por minuto en la cornu ammonis ventral 1, e infunda 200 nanolitros del vector viral en la región objetivo a una velocidad de 25 nanolitros por minuto. Después de permitir que el virus se difunda durante 10 minutos, retire la aguja de microinyección a una velocidad de 100 a 200 micrómetros por minuto.

Después de desinfectar la lente del relé, remoje la lente en solución salina fría sin pirógenos hasta la implantación. Usando una abrazadera micro bulldog con tubo termorretráctil, sostenga la lente del relé y colóquela en la parte superior de la región objetivo a una velocidad de 100 a 200 micrómetros por minuto. Luego, estabilice la lente con cemento dental.

Para colocar un miniscopio, fije la lente del objetivo en la parte inferior y ensamble la placa base en el miniscopio. Envuelva 10 centímetros de película de parafina alrededor del exterior de la placa base. Usando arcilla adhesiva reutilizable, sostenga el miniscopio con la sonda de brazo estereotáxica.

Alinee la lente del objetivo en la parte superior de la lente del relé con el menor espacio posible entre las lentes. Use cemento dental para asegurar la posición de la placa base, de modo que el cemento toque solo la película de parafina. Cuando el cemento dental se haya secado, retire la película de parafina, la placa base y el miniscopio, manteniendo la base de cemento dental hueca.

Selle la lente del relé con caucho de silicona moldeada y cubra el caucho de silicona con una capa delgada de cemento dental. Desenganche el ratón de los instrumentos estereotáxicos y colóquelo en una cámara de recuperación. Para el revestimiento base, corte cuidadosamente la capa delgada del techo de cemento dental con un rongeur de hueso y retire el caucho de silicona.

Limpie la superficie de la lente del relé con 75% de alcohol. Sujete el tornillo de fijación al lado de la placa base para fijarlo a la parte inferior del miniscopio. Ajuste la diapositiva de enfoque para que esté aproximadamente a 2,7 a 3 milímetros de la carcasa principal.

Cuando finalice la configuración, conecte el miniscopio a la placa de adquisición de datos y conecte el miniscopio a un puerto USB 3.0 en una computadora. Ejecutar el software de adquisición de datos desarrollado por el equipo de UCLA. Ajuste la exposición a 255, la ganancia a 64x y el LED de excitación al 5%Para conectar el miniscopio al software de adquisición de datos, haga clic en el botón de conexión y vea la transmisión en vivo del software de adquisición de datos considerando el margen de la lente del relé como un punto de referencia.

Una vez que encuentre la lente del relé, alinee la lente del objetivo del miniscopio con la lente del relé con la mano. Ajustando los diversos ángulos y distancias del miniscopio, comience a buscar las señales de fluorescencia. Sosteniendo el miniscopio en la posición óptima, mueva el brazo estereotáxico hacia el mini scopio y adhiera el miniscopio al brazo estereotáxico con arcilla adhesiva reutilizable.

Busque la mejor vista ajustando ligeramente los brazos X, Y y Z. Ajuste el ángulo entre la superficie de la lente del objetivo y la lente del relé girando la barra del oído, la barra de dientes o la arcilla adhesiva reutilizable en el eje Z. La expresión viral y la implantación de lentes son exitosas cuando al menos una célula desplaza los transitorios de fluorescencia durante el recubrimiento base.

Fije la placa base firmemente con la menor cantidad posible de cemento dental mientras controla la región de interés para asegurarse de que la posición óptima no cambie. En el estudio representativo, el procedimiento de recubrimiento base ficticio resultó ventajoso, ya que resultó en un cambio menor en la ubicación de la placa base que el procedimiento original. El desplazamiento de la placa base también fue influenciado por la altura del cemento dental.

La placa base que estaba anclada 0,5 centímetros por encima del cráneo se desplazó significativamente menos que la placa base que se fijó un centímetro por encima del cráneo. En un ejemplo de imagen exitosa durante el procedimiento de placa base, se observaron transitorios de fluorescencia junto con vasos sanguíneos en el animal anestesiado. Los transitorios de fluorescencia se observaron cinco días después del recubrimiento base, incluso cuando el ratón se comportaba libremente en su jaula doméstica con solo un ligero cambio en una posición.

Se realizaron posteriores imágenes de calcio de ratones. En algunos casos, ocurrieron problemas durante el procedimiento de base, como la ausencia de cualquier cosa excepto un fondo uniforme o visibilidad de los márgenes de glóbulos blancos. sin transitorios de fluorescencia.

Es importante fijar la placa base firmemente en la región objetivo con la menor cantidad posible de cemento dental. Con la técnica de pizarra, los investigadores pueden observar longitudinalmente la actividad neuronal a través de esto. Con la licencia adecuada, este procedimiento también puede aplicarse para observar la red neuronal en el campo de visión.