Name: Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento del tumor metastásico cerebral con cáncer de mama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprende a utilizar un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar el crecimiento de metástasis cerebrales de cáncer de mama. Este método permite evaluar rápidamente la eficacia de fármacos y radiación en un entorno fisiológicamente relevante.

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Queremos agradecer a Julia Farnan, Kayla Green y Tiziana DeAngelis por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por el Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) y W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).

Este protocolo fue aprobado y sigue las pautas de cuidado animal por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. En este estudio se utilizaron ratones hembra atímicos Nu/Nu (6-8 semanas de edad).
1. Inyección intracraneal de células tumorales
<ol><li>Esterilizar todo el equipo (pinzas, tijeras, tijeras de sutura, taladro manual) bajo un ciclo seco de un autoclave durante un máximo de 45 minutos en bolsas de esterilización, incluido un indicador de esterilización. Si realiza cirugías en varios animales, esterilice las herramientas entre animales con un esterilizador de cuentas calentado (hasta 3x).</li>
	<li>Anestesiar a los ratones de acuerdo con el protocolo de cuidado animal de los usuarios (por ejemplo, isoflurano (4% para la inducción, 1-2% de mantenimiento) y administrar analgesia (subcutánea, 0,1 ml de 0,1 mg / kg de buprenorfina SR-LAB) antes del inicio de la cirugía. Asegure una profundidad óptima de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.</li>
	<li>Coloque los ratones en un marco estereotáxico e inmovilice la cabeza con barras auditivas estándar (Figura 1A). Aplique ungüento oftálmico en los ojos.</li>
	<li>Esterilizar la superficie de la cabeza mediante la aplicación repetida y alterna (3x) de hisopos de yodo y etanol al 70% antes de la incisión.</li>
	<li>Use un bisturí quirúrgico para hacer una incisión de línea media de 1 cm a través de la piel en un ángulo ligeramente diagonal con respecto a la línea imaginaria que divide el cerebro de los ratones en dos mitades simétricas para exponer el cráneo. Limpie la sangre con un hisopo de algodón.</li>
	<li>Desvíe la piel lateralmente para exponer el sitio de inyección: 2 mm a la derecha, 1 mm hacia adelante con referencia a la bregma (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).</li>
	<li>Use una broca de fresa (0,73 mm) para penetrar el cráneo +2ML, +1RC en el bregma y perfore un orificio con una ligera presión y movimiento de torsión.</li>
	<li>Use una jeringa de inyección cerebral para inyectar 5 μL de una solución de 100,000 MDA-MB-231BR (GFP-Luciferasa que expresa de manera estable) / μL en 1x PBS estéril insertando inicialmente la jeringa de 3.5 mm de profundidad en el cerebro.</li>
	<li>Deje que la jeringa se asiente durante 2 min. Tire de él hacia arriba aproximadamente 1 mm, y después de 2 minutos, inyecte lentamente la primera mitad del volumen.</li>
	<li>Espere otros 2 minutos antes de inyectar el resto y luego tire lentamente de la jeringa 3 minutos después de la inyección final. NOTA: La inyección lenta es empírica al permitir que el volumen sea bien absorbido por el tejido cerebral y no cree fugas después de tirar de la jeringa, lo que puede provocar que las células cancerosas crezcan fuera del sitio previsto.</li>
	<li>Aplique cera ósea en el sitio de inyección en el cráneo y luego use suturas de polipropileno para suturar el tejido. Los ratones se recuperarán dentro de los 5 minutos posteriores a la extracción de la anestesia.</li>
	<li>Controle su comportamiento inmediatamente después de la cirugía durante aproximadamente 10 minutos, 3 h más tarde y al día siguiente para determinar si se necesita un tratamiento especial, que incluye inyección de solución salina, alimentos blandos, etc., para ayudar a una recuperación rápida.</li>
	<li>Monitoree el crecimiento del tumor a través de imágenes de bioluminiscencia en el sistema de imágenes.<ol>
<li>Para esto, primero, encienda el oxígeno y el isoflurano en el sistema de imágenes. Permita que ambos se distribuyan a la cámara separada fuera de la caja de imágenes.</li>
		<li>Luego, encienda el software, inicialice el instrumento y elija la opción adecuada para visualizar y capturar todo el cuerpo del mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque los ratones en la cámara separada con isoflurano y asegure una profundidad de anestesia óptima con un pellizco en el dedo del pie. Inyectar a los ratones por vía intraperitoneal con 200 μL de 30 mg/ml de luciferina.</li>
	<li>Transfiera el estómago de los ratones hasta la nariz de la cámara de imágenes suministrada con oxígeno e isoflurano. Bloquee la cámara y elija 2 minutos de exposición para comenzar a tomar imágenes.</li>
	<li>Utilice la herramienta ROI (región de interés) del software para cuantificar la señal bioluminiscente del tumor.</li>
	<li>Para analizar el tamaño del tumor, elija la herramienta de forma de círculo, colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor. Mida el ROI e informe las lecturas totales.</li>
	<li>Permitir el crecimiento del tumor sólido durante 12-14 días (o hasta que la luciferasa alcance aproximadamente 7.0 x 106 unidades) (Figura 1B) antes de generar cortes cerebrales. NOTA: Aumentar el número de células a inyectar conducirá a un crecimiento tumoral más rápido; por lo tanto, la generación de cortes cerebrales puede ocurrir antes de 12 días. Por otro lado, un tumor más grande conducirá a más rebanadas de GFP + si se deja crecer durante 14 días. Después de 14 días, la salud de los ratones comienza a deteriorarse rápidamente; por lo tanto, el monitoreo de la salud animal debe aumentarse a una vez al día después del punto de tiempo de 10 días, y cualquier ratón que muestre signos de dolor y / o incomodidad debe usarse para generar las rebanadas.</li>
</ol>2. Generar cortes cerebrales
NOTA: Realice los pasos después del aislamiento cerebral en una campana de flujo laminar estéril. Por lo general, es posible generar 35-40 rebanadas individuales que contienen células tumorales (señal de luciferasa) a partir de un ratón inyectado con células MDA-MB-231BR (Figura 1C).
<ol><li>Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas en autoclave. Coloque la cortadora de tejido en la campana de flujo laminar estéril y limpie todas las herramientas e instrumentos con etanol al 70%.</li>
	<li>Después de 12-14 días después de la inyección intracraneal de células MDA-MB-231BR, anestesiar a los ratones de acuerdo con el protocolo de cuidado animal de los usuarios como se describe en 1.2. Asegure una profundidad óptima de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.</li>
	<li>Retiren y coloquen sus cerebros rápidamente (dentro de los 45 s) en sacarosa-ACSF helada (4 °C) compuesta por lo siguiente: 280 mM de sacarosa, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM de glucosa, 10 mM HEPES, 5 mM de Na+-ascorbato, 3 mM de tiourea, 2 mM de Na+, 29 mM de piruvato; pH=7,3.</li>
	<li>Usando un bisturí afilado y estéril o una cuchilla de afeitar, corte el exceso de partes del cerebro que no contienen ningún tumor de todos los lados, incluida la parte inferior del cerebro.</li>
	<li>Lleve la forma del cerebro a un cubo no perfecto para sentarse sobre el papel de filtro humedecido ACSF en una tapa de plato de 60 mm para facilitar el corte. NOTA: El tejido adicional del cerebro donde es poco probable que el tumor haya crecido se extirpa antes del corte para permitir la generación de rodajas en su mayoría GFP + y crear una forma del cerebro que sea estable en la superficie del instrumento y no se perturbe por las vibraciones causadas por el corte.</li>
	<li>Coloque varias hojas de círculos de papel de filtro prehúmedos (con ACSF) en la plataforma de corte y coloque el tejido bloqueado encima de esta.</li>
	<li>Ajuste el tamaño de corte en el instrumento a 2 o 2.5 unidades en la regla provista para cortar el tejido en secciones de 200-250 μm. NOTA: Las rodajas de hasta 350 μm o tan delgadas como 100 μm son viables. Para rebanadas <200 μm, use un vibratomo o un comprimido.</li>
	<li>Use un pincel (sable) para transferir rebanadas de cerebro a un plato que contenga sacarosa ACSF y separe las rodajas bajo un microscopio de luz con agujas de 27 G.</li>
	<li>Identifique las rodajas positivas de GFP bajo el microscopio fluorescente y transfiéralas a un nuevo plato de 60 mm que contenga 2-3 ml de medios de rebanada para adultos (medio neurobasal A, suplemento de B12 al 2%, suplemento de N2 al 1%, glutamina al 1%, glucosa al 0,5%, penicilina de 10 U / ml y estreptomicina de 100 μg / ml) utilizando una pipeta estéril de 1 ml rota (abertura ancha). NOTA: Se excluyen las rebanadas cerebrales que contienen células tumorales que crecen sobre la superficie del cerebro (tal vez debido a la fuga de células inyectables, etc.).</li>
	<li>Transfiera 3-5 rodajas a cada inserto de cultivo de tejido de 30 mm y 0,4 μm de tamaño de poro en placas de 6 pocillos a una distancia que no permita crecer entre sí.</li>
	<li>Retire el exceso de medio de la superficie del inserto con una pipeta P1000, agregue 1 ml de medio de corte de ratón adulto debajo de cada inserto y equilibre el medio en la incubadora antes de cortar.</li>
	<li>Incubar los tejidos a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 h antes de la toma de imágenes.</li>
</ol>3. Imágenes IVIS de rebanadas
NOTA: Realice los pasos de adición de luciferasa e inhibidor en una campana de flujo laminar estéril.
<ol><li>Pipetear 5 μL de 30 mg/ml de solución de luciferina en el medio debajo de los insertos levantando el inserto con fórceps y colocándolos de nuevo en el pozo después de la adición de luciferina a los medios en el pozo.</li>
	<li>Coloque la placa de 6 pocillos con la tapa dentro de la cámara de imágenes del instrumento debajo de la cámara estacionaria y cierre la puerta de la cámara.</li>
	<li>Abra el software e inicialice el instrumento.</li>
	<li>Elija la configuración de la cámara que permita la visualización y captura de un solo pozo por imagen. Mueva el escenario hacia arriba (FOV de 5 cm) y coloque el pozo que debe ser fotografiado directamente debajo de la cámara.</li>
	<li>Establezca el tiempo de imagen en el más apropiado dependiendo de la intensidad de la luciferasa que emitirá el tumor, que puede variar de 10 s a 5 min. Comience con el ajuste a 10 s y luego aumente si la señal es baja, pero manténgala consistente para todos los puntos de tiempo y condiciones hasta el final del experimento (Figura 1D).</li>
	<li>Use la herramienta ROI (herramienta de forma de círculo), colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor, mida el ROI e informe las lecturas totales para cuantificar la señal bioluminiscente de cada tumor en la rebanada.</li>
	<li>Lleve la placa de vuelta a la campana de flujo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeramente el inserto del pozo.</li>
	<li>Aspire el medio, reemplácelo con 1 ml de medio fresco y vuelva a colocar el inserto en el pozo.</li>
	<li>Para experimentos en los que las rebanadas están siendo tratadas con varios compuestos como inhibidores, metabolitos, etc., prepare la concentración adecuada del reactivo en 1,2 ml de medios de corte cerebral en un tubo de 1,5 ml y luego transfiera 1 ml al pozo que contiene la rebanada.</li>
	<li>Repita este proceso cada 48 h durante la duración del estudio.</li>
</ol>4. Imágenes en vivo del crecimiento tumoral en cortes cerebrales ex vivo
NOTA: Suministre insertos con suficiente medio (1,5 ml) para durar la duración del experimento, ya que no es posible agregar medio adicional durante la toma de imágenes en vivo.
<ol><li>Coloque la placa de 6 pocillos en el soporte de placa del microscopio automatizado dentro de la incubadora (37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad).</li>
	<li>Abra el software, active brightfield en el primer cuadrante para ajustar la exposición necesaria para ver las rebanadas. Para encontrar la posición (coordenadas "xy") de la rebanada, navegue con "xy" en el segundo cuadrante para controlar las coordenadas "xyz" del microscopio.</li>
	<li>Seleccione la placa de 6 pocillos como el material de laboratorio utilizado para este experimento. Seleccione el editor de mapas de ROI y registre esa posición seleccionando un nuevo ROI, agregue y guarde ese ROI.</li>
	<li>Repita los mismos pasos para todas las demás regiones de interés en otros pozos. Después de haber agregado todos los ROI, guarde todos los ROI.</li>
	<li>En Protocolo, seleccione Borrar existente y seleccione Lapso de tiempo en Adquisición, seguido de seleccionar los canales de interés (en este caso, GFP).</li>
	<li>Desactive el enfoque automático en la configuración de enfoque y ajuste manualmente al enfoque adecuado para todos los sectores. Finalmente, ajuste la intensidad del campo brillante y la excitación del canal fluorescente y el tiempo de exposición al nivel apropiado.</li>
	<li>Configura el protocolo para adquirir imágenes cada 15 min durante 48 h.</li>
	<li>Guarde y ejecute el protocolo. Al final del experimento, el archivo guardado contendrá las imágenes de campo brillante y GFP capturadas para cada ROI.</li>
	<li>Para combinar las imágenes en un video, cambie el nombre de todas las imágenes de interés con el mismo nombre seguido de un número binario para organizarlas en el orden en que fueron capturadas (por ejemplo, ROI1 (1), RO1 (2) ...)</li>
	<li>Abra ImageJ e importe las imágenes haciendo clic en Archivo > Importar > secuencia de imágenes. Seleccione los nombres de archivo que aparecen en una lista y escriba el contenido del nombre de los archivos en el cuadro Contiene nombre de archivo que aparecerá para identificar los archivos seleccionados para el vídeo.</li>
	<li>Guarde las imágenes combinadas en Archivo > Guardar como > AVI.</li>
</ol>5. Ensayo MTS e inmunohistoquímica del tejido cerebral ex vivo
<ol><li>ENSAYO MTS<ol>
<li>Elimine las rodajas cortando la membrana de cultivo de tejido debajo de cada rebanada a lo largo de los bordes del tejido y transfiera el tejido, aún unido a la membrana, en una placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Añadir el reactivo MTS mezclado en una proporción de 1:5 con medios de cultivo y tritón al 0,01% (1x) para permitir la penetración de la solución en el tejido, en un volumen total de 120 μL en cada pocillo.</li>
		<li>Use paraformaldehído al 4% (PFA) como agente para hacer que las rebanadas cerebrales sean inviables y, por lo tanto, un control positivo para este experimento. Sumerja la rebanada cerebral de interés en PFA al 4% durante 1 h a RT (temperatura ambiente) o durante la noche a 4 ° C antes de continuar con el ensayo MTS.</li>
		<li>Permita que el reactivo MTS reaccione sobre las rodajas durante 4 h, retire las rodajas de los pocillos y mida la absorbancia a 490 nm para todas las condiciones, incluido un pozo vacío sin rebanada como referencia.</li>
		<li>Informe las lecturas en función del área de corte de tejido, medida con una regla de pinza digital.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación inmunohistoquímica<ol>
<li>Sumerja las rodajas cerebrales unidas a la superficie del inserto de membrana en formalina al 10% durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Realizar incrustaciones, procesar, bloquear y generar portaobjetos no manchados del tejido. Utilice el protocolo de tinción inmunohistoquímica estándar para teñir para H&E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Irradiación del tumor en rodajas cerebrales ex vivo
<ol><li>Irradiar el tumor con 6 Gy (radiografías de 310 kVp). NOTA: Las unidades ingresadas para obtener la dosis total de 6 Gy son 3522 unidades después de considerar las unidades R (medidas con el electrómetro Victoreen) y las correcciones para el dedal, la densidad del aire y cGy / R como se describió anteriormente18. El tiempo de exposición es de 130,9 s.</li>
	<li>Utilice 0,25 mm Cu + 1 mm Al filtración añadida, 50 cm SSD, 125 cGy por minuto.</li>
	<li>Realice la dosimetría mediante una cámara de ionización en el haz calibrada contra un estándar primario.</li>
	<li>Haga correcciones diarias para la humedad, la temperatura y la presión barométrica.</li>
</ol>

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<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastasis+cell+lines+panel%3A+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos financieros que declarar.

Este estudio establece un nuevo método de cultivo cerebral ex vivo para tumores cerebrales de xenoinjerto explantados. Demostramos que las células BCBM MDA-MB-231BR inyectadas intracranealmente en el cerebro de ratones pueden sobrevivir y crecer en rodajas cerebrales ex vivo . El estudio también probó células de glioblastoma U87MG (GBM) inyectadas intracranealmente y también encontró que estas células cancerosas sobreviven y crecen en cortes cerebrales (datos no mostrados). Creemos que este modelo se pu...

Las metástasis cerebrales del cáncer de mama (BCBM) se desarrollan cuando las células se diseminan del tumor primario de mama al cerebro. El cáncer de mama es la segunda causa más frecuente de metástasis cerebral después del cáncer de pulmón, con metástasis que ocurren en el 10-16% de las pacientes1. Desafortunadamente, las metástasis cerebrales siguen siendo incurables, ya que >80% de los pacientes mueren dentro de un año después de su diagnóstico de metástasis cerebral, y su calidad de vida se ve afectada debido a disfunciones neurológicas2. Existe una necesidad urgente de identificar opciones de tratamiento más efectivas. Los modelos de cultivo monocapa bidimensionales o tridimensionales son los métodos más utilizados en la prueba de agentes terapéuticos en el laboratorio. Sin embargo, no imitan el complejo microambiente BCBM, un importante impulsor del fenotipo y el crecimiento del tumor. Aunque estos modelos son útiles, no capturan las complejas interacciones tumor-estroma, los requerimientos metabólicos únicos y la heterogeneidad de los tumores3. Para recapitular más fielmente las interacciones tumor-estroma y la heterogeneidad del microambiente, nuestro grupo y otros han comenzado a generar cultivos organotípicos de metástasis cerebrales "slice" con células tumorales derivadas del paciente (primarias o metastásicas) o líneas celulares cancerosas 4,5,6. En comparación con los sistemas in vitro clásicos, este modelo ex vivo a corto plazo puede proporcionar condiciones más relevantes para el cribado de nuevas terapias antes de la evaluación preclínica en cohortes de animales grandes.
Los modelos ex vivo se han construido y utilizado con éxito principalmente para la identificación de tratamientos exitosos de varios tipos de cáncer. Requieren pocos días de evaluación y, además, se pueden adaptar a la detección de medicamentos específicos del paciente. Por ejemplo, los tejidos ex vivo de cáncer de vejiga y próstata humano han mostrado una respuesta antitumoral dependiente de la dosis de docetaxel y gemcitabina7. Se desarrollaron tejidos similares de carcinoma colorrectal ex vivo para detectar los fármacos quimioterapéuticos Oxaliplatino, Cetuximab y Pembrolizumab8. Esta aplicación ha sido ampliamente utilizada en cáncer de páncreas, considerando la interacción esencial entre el ambiente estromal y las características genotípicas y fenotípicas del adenocarcinoma ductal pancreático 9,10. Además, se han desarrollado modelos organotípicos para exámenes similares en tumores de cabeza, cuello, gástricos y de mama11,12.
Aquí, se está generando un modelo de corte cerebral ex vivo de células tumorales metastásicas cerebrales de cáncer de mama xenoinjertadas en su microambiente. A los ratones se les inyectó intracranealmente cáncer de mama cerebro metastásico cerebral trófico MDA-MB-231BR células13 en el lóbulo parietal de la corteza cerebral, un sitio común de metástasis TNBC 14,15 y se les permitió desarrollar tumores. Se generaron cortes cerebrales a partir de estos animales xenoinjertados y se mantuvieron ex vivo como cultivos organotípicos como se describe16,17. Este nuevo modelo ex vivo permite el análisis del crecimiento de las células BCBM dentro del parénquima cerebral y se puede utilizar para probar agentes terapéuticos y efectos de radiación en las células tumorales dentro del microambiente cerebral.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL, punta deslizante</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 agujas G1/2 BD</td><td></td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos</td> Microscopio automatizado <td>Genessee</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>y software LUMAVIEW</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27 (GEM21)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados 50</td><td>mL Fisher</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>Pincel de marta roma, tamaño #5/0</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>Cera ósea</td><td>ModoMed</td><td>DYNJBW25</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de inyección cerebral</td><td>Hamilton Company</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td>Caspasa 3 escidida</td><td>Señalización de células</td> de anticuerpos <td>14220S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Sal de Potasio</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de doble filo</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro , círculos cuantitativos, 4,25 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>Pincel de marta fina #2/0</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Gamma-H2AX</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFAP</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina (200 mM)</td><td>Corning cellgrow</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>H& E y KI-67</td><td>Jefferson Core Facility Juego de taladros manuales de tinción de</td><td></td><td></td>patología</tr><tr><td>con brocas helicoidales Micro Mini</td><td></td><td></td> Amazon YCQ2851920086082DJ <td></td></tr><tr><td>HEPES, ácido libre</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>Solo para ratones Marco estereotáxico</td><td>Aparato de Harvard (Holliston, MA, EE. UU.).</td><td>72-6049, 72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas grandes</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>Células MDA-MB-231BR</td><td>Amablemente proporcionado por la Dra. Patricia Steeg</td><td>Ref 14</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de imagen para ratones</td><td>Perkin Elmer</td><td>Sistema IVIS 200</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen para ratones</td><td>Caliper Life Sciences (Waltham, MA, EE. UU.).</td><td>Living Image Software Lector</td><td></td></tr> de <tr><td>microplacas</td><td>Tecan Spark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de montaje</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>MTS reactivo</td><td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td> <td>(Cat:G3582)</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Ratones atímicos Nu/Nu</td><td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Paraformaldehído</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de polipropileno</td><td>Suministro Medex</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>Palos de hisopo de yodo povidona</td><td>Suministro DME EE. UU.</td><td>Cat: 689286X</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí #11 (paquete de 100)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Espátula/sonda</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>SS Hojas de afeitar sin recubrimiento de doble filo (American safety razor co (95-0043))VWR</td><td></td> <td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Amresco</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí quirúrgico</td><td>Exelint International</td><td>D29702</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Chopper</td><td>Brinkman</td> <td>(tipo McIlwain)</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo de tejidos</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50 o PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>máquina de rayos X Precision</td><td>250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento del tumor metastásico cerebral con cáncer de mama

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

La metástasis cerebral es una consecuencia grave del cáncer de mama para las mujeres, ya que estos tumores son difíciles de tratar y se asocian con malos resultados clínicos. Los modelos preclínicos de ratón de crecimiento metastásico cerebral (BCBM) del cáncer de mama son útiles pero son costosos, y es difícil rastrear las células vivas y la invasión de células tumorales dentro del parénquima cerebral. Aquí se presenta un protocolo para cultivos de cortes cerebrales ex vivo de ratones xenoinjertados que contienen sublíneas clonales de búsqueda de cerebro de cáncer de mama inyectado intraranalmente. Las células marcadas con la luciferasa MDA-MB-231BR se inyectaron intracranealmente en los cerebros de ratones hembra Nu/Nu, y después de la formación del tumor, los cerebros se aislaron, cortaron y cultivaron ex vivo. Las rebanadas tumorales fueron fotografiadas para identificar células tumorales que expresan luciferasa y monitorear su proliferación e invasión en el parénquima cerebral durante un máximo de 10 días. Además, el protocolo describe el uso de la microscopía de lapso de tiempo para obtener imágenes del crecimiento y el comportamiento invasivo de las células tumorales después del tratamiento con radiación ionizante o quimioterapia. La respuesta de las células tumorales a los tratamientos se puede visualizar mediante microscopía de imágenes en vivo, midiendo la intensidad de la bioluminiscencia y realizando histología en la rebanada cerebral que contiene células BCBM. Por lo tanto, este modelo de corte ex vivo puede ser una plataforma útil para la prueba rápida de nuevos agentes terapéuticos solos o en combinación con radiación para identificar medicamentos personalizados para atacar el crecimiento metastásico cerebral de cáncer de mama de un paciente individual dentro del microambiente cerebral.

Las células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa se inyectaron intracranealmente en el hemisferio derecho de ratones Nu/Nu de 4-6 semanas de edad como se explicó anteriormente (Figura 1A) y se les permitió crecer durante 12-14 días, tiempo durante el cual el crecimiento del tumor fue monitoreado por imágenes de bioluminiscencia (Figura 1B). Inyectamos 100,000 células cancerosas intracranealmente según lo informado por otros grupos19, pero es posib...

Presentamos un protocolo para medir la respuesta a la droga y la radiación en tiempo real de las células metastásicas cerebrales del cáncer de mama en un modelo organotípico de corte cerebral. Los métodos proporcionan un ensayo cuantitativo para investigar los efectos terapéuticos de varios tratamientos en las metástasis cerebrales del cáncer de mama de manera ex vivo dentro de la interfaz del microambiente cerebral.

Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento del tumor metastásico cerebral con cáncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Este protocolo permite la formación de células tumorales metastásicas cerebrales y la generación de cortes cerebrales ex vivo que permiten realizar pruebas rápidas de la eficacia del fármaco y la radiación en un tumor preformado. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de probar rápidamente múltiples medicamentos o tratamientos en un entorno fisiológicamente relevante que mantiene las interacciones cerebro-tumor-huésped. Este método puede ayudar a comprender cómo las células metastásicas cerebrales crecen, sobreviven e invaden el parénquima cerebral y comprender el papel del microambiente tumoral cerebral en el crecimiento y la propagación del cáncer.Demostrando el procedimiento estarán Lorela Ciraku y Emily Esquea, ambas candidatas a doctorado de mi laboratorio. Para empezar, coloque los ratones anestesiados en un marco estereotáxico e inmovilice la cabeza con barras auditivas estándar. Esterilizar la superficie de la cabeza tres veces mediante la aplicación alterna repetida de hisopos de yodo y etanol al 70% antes de la incisión.Usando un bisturí quirúrgico, haga una incisión de línea media de un centímetro en un ángulo diagonal con respecto al eje imaginario que divide el cerebro de los ratones en dos mitades simétricas para exponer el cráneo. Después de limpiar cualquier sangre con un hisopo de algodón, desvíe la piel lateralmente para exponer el sitio de inyección. Use una broca de rebaba de 0,73 milímetros para penetrar en el cráneo y perfore un orificio con una ligera presión y movimiento de torsión.Para inyectar cinco microlitros de células que expresan de manera estable la luciferasa GFP, inserte una jeringa de alta precisión a 3,5 milímetros de profundidad en el cerebro. Deje que se asiente durante dos minutos y luego tire de la jeringa hacia arriba aproximadamente un milímetro. Después de dos minutos, inyecte lentamente el primer volumen medio y espere otros dos minutos antes de inyectar el resto del volumen.Después de tres minutos, tire lentamente de la jeringa. Aplique cera ósea en el sitio de inyección en el cráneo y suture el tejido con suturas de polipropileno. Monitoree el comportamiento del ratón inmediatamente después de la cirugía periódicamente para determinar si se necesita un tratamiento especial, incluida la inyección de solución salina y alimentos blandos, para ayudar a una recuperación rápida.Para monitorear el crecimiento del tumor a través de imágenes de bioluminiscencia, primero encienda el oxígeno y el isoflurano en el sistema de imágenes y permita que ambos se distribuyan a la cámara separada fuera de la caja de imágenes. Luego, después de encender el software e inicializar el instrumento, elija la opción adecuada para visualizar y capturar todo el cuerpo del mouse. A continuación, transfiera los ratones a la cámara fuera de la caja de imágenes suministrada con oxígeno e isoflurano.Una vez que los ratones estén bajo el efecto anestésico, inyecte a los ratones por vía intraperitoneal con 200 microlitros de 30 miligramos por mililitro de luciferina. Coloque a los ratones en la cámara de imágenes con el estómago hacia abajo hasta el labio nasal de las cámaras de imágenes. Bloquee la cámara, elija dos minutos de exposición para iniciar la toma de imágenes y luego complete la imagen.Después de colocar la cortadora de tejido en una campana de flujo laminar estéril, limpie todas las herramientas e instrumentos con etanol al 70%. Después de sacrificar al ratón, retire y coloque el cerebro rápidamente en una solución helada de sacarosa-ACSF. Usando una espátula, transfiera el cerebro en un papel de filtro humedecido por ACSF en una tapa de plato de 60 milímetros.Usando una cuchilla de afeitar afilada y estéril, corte las partes sobrantes del cerebro que no contienen ningún tumor, incluida la parte inferior del cerebro, para llevar la forma del cerebro a un cubo no perfecto. Después de colocar varias hojas de papel de filtro humedecido con ACSF en la plataforma de corte, coloque el pañuelo bloqueado sobre el papel de filtro. Para cortar el tejido en secciones de 200 a 250 micrómetros de grosor, establezca el tamaño de corte en 2 o 2.5 unidades en la regla del proveedor y comience a cortar.Use un pincel para transferir rodajas de cerebro a un plato que contenga sacarosa-ACSF y separe las rodajas bajo un microscopio de luz con agujas de calibre 27. Identifique las rodajas GFP positivas bajo el microscopio fluorescente. Luego, utilizando una pipeta rota estéril de un mililitro con una abertura ancha, transfiera las rebanadas identificadas a un nuevo plato de 60 milímetros que contenga de dos a tres mililitros de medios de rebanadas para adultos.Luego, transfiera de tres a cinco rebanadas en cada inserto de cultivo de tejido en cada pocillo de una placa de seis pocillos a una distancia segura. Después de retirar el exceso de medio de la superficie del inserto, agregue un mililitro de medio de corte de ratón adulto equilibrado debajo de cada inserto. Incubar los tejidos a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad durante 24 horas antes de la toma de imágenes.Pipetee cinco microlitros de 30 miligramos por mililitro de solución de luciferina en el medio debajo de los insertos dentro de una campana estéril. Coloque la placa de seis pocillos con la tapa dentro de la cámara de imágenes del instrumento debajo de la cámara estacionaria y cierre la puerta de la cámara. Abra el software e inicialice el instrumento.Después de elegir la configuración de la cámara que permite la visualización y captura de solo un pozo por imagen, coloque el pozo para obtener la imagen directamente debajo de la cámara. Use la herramienta de ROI, colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor, mida el ROI e informe las lecturas totales para cuantificar la señal bioluminiscente de cada tumor en la rebanada. Después de llevar la placa de vuelta a la campana de flujo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeramente el inserto del pozo.Después de aspirar el medio, reemplace el medio con un mililitro de medio fresco y coloque el recuadro de nuevo en el pozo. Para los experimentos en los que las rebanadas se tratan con varios compuestos, como inhibidores y metabolitos, prepare la concentración de reactivo adecuada en 1,2 mililitros de medios de rebanadas cerebrales en un tubo de 1,5 mililitros, y luego transfiera un mililitro de reactivo al pozo que contiene la rebanada. Las células de luciferasa BR-GFP MDA-MB-231 se inyectaron en ratones desnudos, se permitió que los tumores crecieran, los cerebros con tumores se diseccionaron, se cortaron, se cultivaron ex vivo y el crecimiento del tumor se monitoreó mediante imágenes de bioluminiscencia.La tinción de H&E y la fluorescencia GFP positiva confirmaron la presencia de un tumor en la rebanada del cerebro. El aumento de la tinción de Ki-67 confirmó la presencia de células cancerosas altamente proliferativas. Los tumores en rebanadas cerebrales que no fueron expuestas a la irradiación continuaron creciendo ex vivo, mientras que los tumores expuestos a la irradiación mostraron un crecimiento estancado.Las rebanadas cerebrales que contenían tumores también se monitorearon a través de imágenes en vivo para visualizar el crecimiento del tumor después del tratamiento de irradiación. De acuerdo con las imágenes bioluminiscentes, las células cancerosas de control crecieron rápidamente a medida que aumentaba la intensidad de la GFP y las células comenzaron a invadir el parénquima cerebral. Por el contrario, las células cancerosas en las rebanadas cerebrales tratadas con irradiación fueron citostáticas y se mantuvo la intensidad de la GFP.Se detectaron grandes células cancerosas multinucleadas y un aumento en la tinción del marcador de daño del ADN en las células cancerosas tratadas con IR. Además, se detectó un aumento de los astrocitos reactivos. La apoptosis inducida por el tratamiento IR no se detectó en las rebanadas cerebrales de ratón libres de tumor.Las rebanadas cerebrales que contenían tumores se trataron con diferentes concentraciones de paclitaxel, un fármaco quimioterapéutico. El tratamiento disminuyó significativamente el tamaño del tumor después del día 10 de tratamiento. Se detectó un aumento de la apoptosis en las células tumorales tratadas con paclitaxel.El tratamiento con inhibidores no alteró la viabilidad del tejido cerebral. No se midió ningún aumento en la apoptosis por tinción de caspasa-3 escindida en una rebanada de cerebro de ratón libre de tumores tratada con paclitaxel. Cuando el tratamiento con los fármacos de interés ha finalizado, se pueden analizar las rebanadas para la expresión proteica mediante inmunocitoquímica, estudios ómicos, o lograr una suspensión unicelular adecuada para la citometría de flujo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Fuente: Ciraku, L., et. al. Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento de tumores metastásicos cerebrales de cáncer de mama. J. vis. exp. (2021). Este video muestra la imagen de células tumorales que expresan luciferasa en un corte de cerebro de ratón organotípico. Se añade luciferina al medio y la placa se coloca dentro de la cámara del sistema de imágenes in vivo. Se ajustan los parámetros para la captura de imágenes y se definen la forma y el tamaño del tumor.

Imágenes de bioluminiscencia para evaluar el crecimiento tumoral en un corte de cerebro de ratón organotípico

Un cáncer de cerebro modelo murino de metástasis de mama se establece con ultrasonido intracardiaco inyección guiada por imágenes de células MDA-MB231/Br-GFP. Desarrollo de las metástasis intracraneales multifocales ha sido supervisado longitudinalmente utilizando alta resolución 9.4 T MRI.

Guiada por imagen de ultrasonido de inyección intracardiaca de desarrollar un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales Seguido por Longitudinal MRI

Muchos tipos de tumores cerebrales humanos se localizan en regiones específicas dentro del cerebro y son difíciles de cultivar en cultivo. Este protocolo aborda el papel del microambiente tumoral e investiga nuevos tratamientos farmacológicos mediante el análisis de células tumorales cerebrales primarias fluorescentes que crecen en un corte de cerebro de ratón organotípico.

Un tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura del sistema para estudiar microambiente tumoral y dirigida Medicamentos Terapias

metástasis cerebral se ha convertido en una necesidad médica insatisfecha urgente, ya que su incidencia ha aumentado mientras que las opciones terapéuticas se han mantenido paliativos. La creación de modelos animales experimentales de metástasis en el cerebro a través de la inyección arterial intracarotídea de las células cancerosas facilita estudios sobre el mecanismo de la biología de la enfermedad y la evaluación de nuevos regímenes de intervención.

Intracarotídea inyección de las células del cáncer para Producción de ratón Modelos de metástasis cerebral

El modelado intracraneal de metástasis cerebral se complica por la incapacidad para controlar el tamaño del tumor y la respuesta al tratamiento con métodos precisos y oportunos. La metodología presentada combina la inyección de tumores intracraneales con el análisis de imágenes por resonancia magnética, que cuando se combina, cultiva inyecciones precisas y consistentes, monitorización animal mejorada y mediciones precisas del volumen tumoral.

Modelado de metástasis cerebrales a través de inyección intracraneal e imágenes de resonancia magnética

Aquí, presentamos un protocolo para preparar y cultivar un microambiente tumor metastásico de barrera hematoencefálica y luego cuantificar su estado mediante imágenes confocales e inteligencia artificial (aprendizaje automático).

Cuantificación del microambiente del tumor metastásico cerebral mediante un modelo 3D de chip organ-on-A, aprendizaje automático y tomografía confocal

Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

La metástasis cerebral es una causa de morbilidad y mortalidad graves en pacientes con cáncer. La mayoría de los modelos de ratón con metástasis cerebral se complican con metástasis sistémicas que confunden el análisis de la mortalidad y los resultados de la intervención terapéutica. Aquí se presenta un protocolo para la inyección carótida interna de células cancerosas que produce tumores intracraneales consistentes con tumores sistémicos mínimos.

Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Los embriones de pollo se utilizan para estudiar tumores cerebrales de glioblastoma humano (GBM) in ovo y en cocultivos de cortes cerebrales ex vivo . El comportamiento de las células GBM se puede registrar mediante microscopía de lapso de tiempo en cocultivos ex vivo , y ambas preparaciones se pueden analizar en el punto final experimental mediante un análisis confocal 3D detallado.

Uso del cerebro del embrión de pollo como modelo para análisis in vivo y ex vivo del comportamiento de las células de glioblastoma humano

La técnica de inyección intracraneal estereotáctica permite la implantación precisa y localizada de células tumorales en la corteza del ratón, convirtiéndose en un modelo potente para estudiar la colonización metastásica del cerebro.

Modelado de la metástasis cerebral: análisis estandarizado de la colonización metastásica y los patrones histológicos de crecimiento mediante inyección intracortical estereotáctica

Aprende a utilizar un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar el crecimiento de metástasis cerebrales de cáncer de mama. Este método permite evaluar rápidamente la eficacia de fármacos y radiación en un entorno fisiológicamente relevante.

Un modelo de corte de cerebro ex vivo para estudiar y atacar el crecimiento del tumor metastásico cerebral con cáncer de mama

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