Name: El uso de la técnica Patch-Clamp para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprende la técnica patch-clamp para medir la fuga de protones en la membrana mitocondrial interna y evaluar la capacidad termogénica. Este método permite caracterizar mecanismos moleculares del metabolismo energético celular.

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Agradezco al Dr. Yuriy Kirichok por la gran ciencia de la que formé parte en su laboratorio y a los miembros del laboratorio Kirichok por las útiles discusiones. También agradezco al Dr. Douglas C. Wallace por proporcionar ratones knockout AAC1 . Financiamiento: A.M.B fue apoyado por un Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón 19CDA34630062.

Todos los procedimientos experimentales con animales que se realizaron cumplen con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en Los Ángeles (IACUC).
NOTA: El procedimiento de aislamiento mitocondrial se basa en la centrifugación diferencial y varía ligeramente de un tejido a otro. Por ejemplo, dado que el tejido adiposo marrón es extremadamente rico en lípidos, requiere un paso adicional para separar los restos celulares y los orgánulos de la fase lipídica antes de cosechar las mitocondrias. Para evitar confusiones, los dos procedimientos de aislamiento mitocondrial (uno de la grasa marrón y el otro del corazón) se detallan a continuación.
1. Aislamiento mitocondrial de la grasa marrón interescapular de ratón (modificada de Bertholet et al. 2020)15
<ol><li>Sacrificar al ratón macho C57BL/6 utilizando asfixia por CO2 y posterior luxación cervical, según lo recomendado por el Panel de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y el Comité de la IACUC.</li>
	<li>Después de colocar el ratón con el vientre mirando hacia la mesa, rocíe alcohol para limpiar y mojar el cabello (modificado de Mann et al., 2014)16.</li>
	<li>Haga una incisión de 2 cm en la parte superior de la espalda después de agarrar la piel con pinzas.</li>
	<li>Extrae la grasa interescapular marrón del ratón que corresponde a un órgano de dos lóbulos con forma de mariposa16.</li>
	<li>Transfiera la grasa marrón a una placa de Petri de 35 mm llena de 5 ml de tampón de aislamiento en frío (Tabla 1) previamente colocada sobre hielo.</li>
	<li>Limpie la grasa marrón de la grasa blanca debajo de un binocular.</li>
	<li>Transfiera la grasa marrón a un vaso de precipitados de 10 ml con 5 ml de tampón de aislamiento en frío (Tabla 1) para cortarla en trozos delgados. Transfiera al homogeneizador de vidrio de 10 ml refrigerado por hielo (material plástico politetrafluoroetileno (PTFE) mortero).</li>
	<li>Use un agitador superior para homogeneizar el tejido precortado en hielo con seis golpes suaves a una velocidad controlada de 275 rotaciones / min.</li>
	<li>Centrifugar el homogeneizado a 8.500 x g durante 10 min a 4 °C en un tubo cónico helado de 15 ml. Deseche el sobrenadante que contiene la fase lipídica.</li>
	<li>Resuspendir el pellet en 5 mL de tampón de aislamiento helado (Tabla 1) y homogeneizar, por segunda vez, la suspensión sobre hielo con seis golpes lentos a una velocidad de 275 rotación/min.</li>
	<li>Transfiera el homogeneizado en un tubo cónico helado de 15 ml y centrífuguelo a 700 x g durante 10 min a 4 °C para granular todos los núcleos y células intactas.</li>
	<li>Recoge el sobrenadante en un tubo fresco de 15 ml y colócalo sobre hielo.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 8.500 x g durante 10 min a 4 °C para obtener un pellet que contenga mitocondrias.</li>
	<li>Resuspend pellet que contiene mitocondrias en 3,8 mL de tampón hipertónico-manitol helado (Tabla 2) e incubar la suspensión mitocondrial en hielo durante 10-15 min.</li>
</ol>2. Aislamiento mitocondrial del corazón de ratón (modificado de Garg et al. 2019)17
<ol><li>Sacrificar al ratón macho C57BL/6 utilizando asfixia por CO2 y posterior luxación cervical, según lo recomendado por el Panel de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y el Comité de la IACUC.</li>
	<li>Después de colocar el ratón sobre su espalda, rocíe alcohol para limpiar y mojar el cabello. Luego, haga una incisión de 2 cm en el tórax después de agarrar la piel con pinzas.</li>
	<li>Diseccionar el corazón del pecho del animal y enjuagarlo para extraer toda la sangre en un vaso de precipitados de 10 ml con 5 ml de la solución de aislamiento en frío (Tabla 1).</li>
	<li>Una vez que el corazón haya sido limpiado de rastros de sangre, transfiéralo a otro vaso de precipitados de 10 ml que contenga 5 ml de tampón de aislamiento en frío (Tabla 1) para cortarlo en trozos delgados. Luego, transfiera a un homogeneizador de vidrio de 10 ml refrigerado por hielo (mortero de PTFE).</li>
	<li>Use un agitador superior para homogeneizar el tejido precortado en hielo con seis golpes suaves a una velocidad controlada de 275 rotaciones / min.</li>
	<li>Transfiera el homogeneizado a un tubo cónico helado de 15 ml y centrífuguelo a 700 x g durante 10 minutos a 4 °C a núcleos de gránulos y células intactas.</li>
	<li>Recoge el sobrenadante en un tubo fresco de 15 ml y colócalo sobre hielo.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 8.500 x g durante 10 min a 4 °C para obtener un pellet que contenga mitocondrias.</li>
	<li>Resuspend el pellet mitocondrial en 3,8 mL de tampón hipertónico-manitol helado (Tabla 2) e incubar la suspensión mitocondrial en hielo durante 10-15 min.</li>
</ol>3. Preparación de mitplastos con prensa francesa para rotura mecánica del OMM.
NOTA: El procedimiento de prensa francés permite liberar el IMM del OMM con su integridad preservada, incluyendo la matriz y la crista (Figura 2)18. Las mitocondrias se preincuban en un tampón de manitol hipertónico (Tabla 2) y se someten a una presión más baja durante el procedimiento de prensa francesa para evitar cualquier estiramiento drástico de la IMM cuando se rompe la OMM.
<ol><li>Llene la suspensión mitocondrial-hipertónica-manitol en una mini celda de presión refrigerada (diámetro del pistón 3/8") de la prensa francesa (Figura 3A).</li>
	<li>Seleccione el modo Medio de la Prensa Francesa y comprima la suspensión a través de la mini celda de presión a 110 en el dial de la Prensa Francesa para las mitocondrias de grasa marrón y a 140 para las mitocondrias del corazón (~2,000 psi).  Asegúrese de que la suspensión salga de la mini celda de presión a una velocidad de aproximadamente 1 gota / s.</li>
	<li>Recoge las gotas en un tubo cónico helado de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 10.500 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Resusped el pellet de mitplastos en 0.5-2 mL de tampón Hypertonic-KCl helado (Tabla 3) y almacene la suspensión en hielo. NOTA: Los miplastos de grasa marrón y corazón están listos para grabaciones de pinza de parche y deben permanecer utilizables durante aproximadamente 3-6 h.</li>
</ol>4. Registros electrofisiológicos de fuga de H+ a través de UCP1 y AAC 5,7,15
NOTA: Utilice la siguiente configuración electrofisiológica (Figura 3B): microscopio invertido con contraste de interferencia diferencial (DIC), objetivo de inmersión en agua 60x, mesa de aislamiento de vibraciones y una jaula de Faraday, un amplificador estándar que admite grabaciones de bajo ruido, un digitalizador estándar utilizado para la configuración electrofisiológica, pClamp 10, un micromanipulador, electrodo de referencia de baño (puente de sal de 3 M KCl-agar insertado dentro de un soporte de microelectrodo que contiene un pellet de cloruro de plata / plata moldeado en el cuerpo del titular (descrito en Liu et al. 2021)19, cámara de perfusión con un fondo de cubierta de vidrio de 0,13 mm, conectada a un sistema de perfusión alimentado por gravedad.
<ol><li>Tire de los filamentos de vidrio de borosilicato el día de la grabación utilizando un extractor de micropipetas. Coloque un programa en el extractor utilizado para generar pipetas con un alto grado de reproducibilidad20. NOTA: Este diseño de programa requiere varios intentos para obtener pipetas optimizadas para la abrazadera de parche IMM. Una pipeta estándar tiene puntas finas con una forma cónica progresiva.</li>
	<li>Inserte un filamento de vidrio dentro del extractor y tire para obtener casi dos pipetas de parche idénticas de un filamento de borosilicato.</li>
	<li>Ajuste el programa cuando las pipetas se vuelvan inconsistentes entre los ciclos de tracción debido al envejecimiento del filamento de la caja de calentamiento del extractor.</li>
	<li>Coloque la pipeta dentro del pulidor de pipetas y coloque la punta cerca del filamento con un aumento de 100x para pulirla al fuego.</li>
	<li>Presione el pedal varias veces para calentar el filamento sin obstruir o dañar la curva de la punta.</li>
	<li>Pulir hasta que se obtengan pipetas con una resistencia entre 25 y 35 MΩ cuando se llenan con solución de pipeta a base de TMA (TMA para hidróxido de tetrametilamonio, Tabla 4).</li>
	<li>Preincubar los cubrehojas (5 mm de diámetro, 0,1 mm de espesor) con gelatina al 0,1% para reducir la adhesión del mitoplasto y enjuagarlos con la solución de baño KCl (Tabla 5) antes de depositar la suspensión de mitoplastos.</li>
	<li>Prepare una dilución cruda mezclando ~ 35 μL de la suspensión de mitoplastos concentrados con 500 μL de la solución de baño KCl (Tabla 5) y colóquela en fundas previamente colocadas en un pozo de una placa de 4 pocillos.</li>
	<li>Incubar en hielo durante 15 a 20 min para que los mitoplastos sedimenten en la cubierta.</li>
	<li>Llene la cámara de baño completamente con ~ 50 μL de la solución de baño KCl (Tabla 5).</li>
	<li>Transfiera un coverslip con mitólogos dentro de la cámara usando pinzas de microdisección delgadas con una punta doblada.</li>
	<li>Coloque el cubrebocas en la parte inferior de la cámara. No perfunda la cámara para mantener los mitóticos estables en la cubierta.</li>
	<li>Elija un mitplasto no adhesivo individual en forma de 8 escaneando la cubierta bajo el microscopio con un objetivo de 60x.</li>
	<li>Cargue la pipeta con la solución de pipeta (~50 μL) y colóquela en el soporte de la pipeta.</li>
	<li>Lleve la pipeta a la solución de baño con un micromanipulador y acérquela justo encima del mitótico seleccionado para acercarse a la IMM. El programa amplificador da la resistencia de la pipeta una vez que está en la solución de baño. Mantenga el potencial de membrana a 0 mV y aplique pulsos de 10 mV utilizando el comando de prueba de membrana en el programa del amplificador.</li>
	<li>Aplique una ligera presión negativa para crear rápidamente un gigasellado con el IMM (Figura 2B).</li>
	<li>Levante la pipeta con el mitoplasto unido para mantenerlos alejados de la cubierta para evitar la rotura del sello debido a la deriva de la pipeta durante el experimento.</li>
	<li>Compense los transitorios de capacitancia extraviados con el comando "prueba de membrana" en el programa del amplificador antes de probar la configuración de mitoplasto completo para obtener una medición correcta de capacitancia (Cm) para la membrana del mitplasto después del robo.</li>
	<li>Aplique pulsos de voltaje de corta duración (5-15 ms) (250-600 mV) con el programa amplificador para romper el parche de membrana debajo de la pipeta de vidrio y lograr la configuración de mitoplasto completo (Figura 2C). El allanamiento exitoso se refleja en la reaparición de transitorios de capacitancia.</li>
	<li>Después del robo, ajuste los transitorios de capacitancia con la opción de prueba de membrana del programa amplificador para evaluar la capacitancia de la membrana (que refleja el tamaño del mitplasto) y su resistencia de acceso Ra (que refleja la calidad de la configuración de todo el mitoplasto). Después del robo, Ra debe estar entre 40 y 80 MΩ. Los mitoplastos (de 2-6 μm de tamaño) utilizados para experimentos de pinza de parche suelen tener capacitancias de membrana de 0.5-1.1 pF.</li>
	<li>Inmediatamente después del robo, reemplace la solución de baño KCl (Tabla 5) con la solución de baño HEPES (Tabla 6) iniciando la perfusión.</li>
	<li>Aplique un protocolo de rampa de 850 ms diseñado con el programa amplificador, de -160 mV a +100 mV con un intervalo de 5 s, mientras mantiene el mitótico a 0 mV. Este protocolo funciona para los estudios UCP1 6,7,15 y CAA5 (Figura 4 y Figura 5). NOTA: Se recomienda para las mediciones de corriente H+ dependientes de UCP1 y AAC adquirir todos los datos electrofisiológicos a 10 kHz y filtrar a 1 kHz utilizando un software adecuado que impulse el amplificador y el digitalizador.</li>
</ol>

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</ol>

El autor no declara intereses contrapuestos.

Este artículo de método tiene como objetivo presentar la técnica patch-clamp aplicada recientemente a las mitocondrias, un nuevo enfoque para estudiar directamente la fuga de H+ a través de la IMM responsable de la termogénesis mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica no se limita a los tejidos y también se puede utilizar para analizar la fuga de H + y otras conductancias de la...

Las mitocondrias son famosas por ser la central eléctrica de la célula. De hecho, son la principal fuente de energía química, el ATP. Lo que es menos conocido es que las mitocondrias también generan calor. De hecho, cada mitocondria genera constantemente los dos tipos de energías (ATP y calor) y un fino equilibrio entre las dos formas de energía define la homeostasis de las células metabólicas (Figura 1). Cómo las mitocondrias distribuyen la energía entre el ATP y el calor es sin duda la pregunta más fundamental en el campo de la bioenergética, aunque todavía es en gran parte desconocida. Sabemos que el aumento de la producción de calor mitocondrial (llamado termogénesis mitocondrial) y, en consecuencia, la reducción de la producción de ATP aumenta el gasto de energía y esta es una de las mejores maneras de combatir el síndrome metabólico1.
La termogénesis mitocondrial se origina a partir de la fuga de H + a través de la membrana mitocondrial interna (IMM), lo que lleva al desacoplamiento de la oxidación del sustrato y la síntesis de ATP con la consiguiente producción de calor, de ahí el nombre de "desacoplamiento mitocondrial"1 (Figura 1). Esta fuga de H + depende de transportadores mitocondriales llamados proteínas de desacoplamiento (UCP). UCP1 fue el primer UCP identificado. Solo se expresa en tejidos termogénicos, grasa marrón y grasa beige en los que las mitocondrias están especializadas para la producción de calor 2,3,4. La identidad de la UCP en tejidos no adiposos como el músculo esquelético, el corazón y el hígado, ha seguido siendo controvertida. Las mitocondrias en estos tejidos pueden tener alrededor del 25% de la energía mitocondrial total convertida en calor, lo que puede afectar significativamente la fisiología de todo el cuerpo1. Además de mantener la temperatura corporal central, la termogénesis mitocondrial también previene la obesidad inducida por la dieta al reducir las calorías. Además, reduce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por las mitocondrias para proteger a las células del daño oxidativo1. Por lo tanto, la termogénesis mitocondrial está involucrada en el envejecimiento normal, los trastornos degenerativos relacionados con la edad y otras afecciones que involucran estrés oxidativo, como la isquemia-reperfusión. Por lo tanto, la termogénesis mitocondrial es un poderoso regulador del metabolismo celular, y una comprensión mecanicista de este proceso fundamental promoverá el desarrollo de estrategias terapéuticas para combatir muchas patologías asociadas con la disfunción mitocondrial.
La respiración mitocondrial fue la primera técnica en revelar el papel crucial de la termogénesis mitocondrial en el metabolismo celular y sigue siendo la más popular en la comunidad1. Esta técnica se basa en la medición del consumo de oxígeno por la cadena de transporte de electrones mitocondrial (ETC) que aumenta cuando se activa la fuga mitocondrial de H+. Esta técnica, aunque instrumental, no puede estudiar directamente la fuga mitocondrial de H+ a través de la IMM1, lo que dificulta la identificación y caracterización precisa de las proteínas responsables de ella, particularmente en tejidos no adiposos en los que la producción de calor es secundaria en comparación con la producción de ATP. Recientemente, el desarrollo de la técnica patch-clamp aplicada a las mitocondrias, proporcionó el primer estudio directo de fuga de H + a través de toda la IMM en varios tejidos 5,6,7.
El parche-pinza mitocondrial de toda la IMM fue establecido por primera vez de forma reproducible por Kirichok et al.8. Describieron la primera medición directa de las corrientes de uniporter de calcio mitocondrial (MCU) en 2004 utilizando mitplastos de líneas celulares COS-78. Más tarde, el laboratorio de Kirichok mostró corrientes de calcio de IMM de ratón9 y tejidos de Drosophila 9. Otros laboratorios ahora usan rutinariamente esta técnica para estudiar las propiedades biofísicas de MCU 10,11,12,13,14. El análisis completo de la pinza de parche IMM de la conductancia de potasio y cloruro también es posible y se ha mencionado en varios artículos, pero aún no ha sido el tema principal de una publicación 6,7,9. La primera medición de las corrientes H + a través de la IMM se informó en 2012 de las mitocondrias de grasa marrónde ratón 6, y de las mitocondrias de grasa beige de ratón en 20177. Esta corriente se debe a la proteína desacoplamiento específica de los tejidos termogénicos, UCP1 6,7. Un trabajo reciente publicado en 2019 caracterizó la CAA como la principal proteína responsable de la fuga mitocondrial de H + en tejidos no adiposos como el corazón y el músculo esquelético5.
Este enfoque único ahora permite el análisis funcional directo de alta resolución de los canales iónicos mitocondriales y los transportadores responsables de la termogénesis mitocondrial. Para facilitar la expansión del método y complementar otros estudios como la respiración mitocondrial, a continuación se describe un protocolo detallado para medir las corrientes H + transportadas por UCP1 y AAC. Se describen tres pasos importantes: 1) aislamiento mitocondrial de la grasa marrón del ratón para analizar la corriente H + dependiente de UCP1 y aislamiento mitocondrial del corazón para analizar la corriente H + dependiente de CAA, 2) preparación de mitplastos con una prensa francesa para la ruptura mecánica de la membrana mitocondrial externa (OMM), 3) registros de pinza de parche de las corrientes H + dependientes de UCP1 y CAA en toda la IMM.

<table><tbody><tr><td>Gelatina al 0,1%</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión en agua 60X, apertura numérica 1.20</td><td>Amplificador Olympus</td><td></td> UPLSAPO60XW <td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B Digitalizador</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>Prensa francesa casera</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glen Mills</td><td>5500-000011</td><td></td></tr><tr><td>IKA Eurostar PWR CV S1 agitador</td><td></td><td></td><td></td>aéreo</tr><tr><td>de laboratorio Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX71 o IX73</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>(Narishige)</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanupulador MPC-385</td><td>Sutter Instrumentos</td><td>FG-MPC325</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de microelectrodos para puente de agar</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3F4515</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td> <td>(Sutter Instruments)</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Mini Célula para Prensa Francesa</td><td>Glen Mills</td><td>5500-FA-004</td><td></td></tr><tr><td>MEZCLADOR IKA 6-2000RPM</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-50705-50</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo Aumento de 100X</td><td>Lente Nikon</td><td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 10</td><td>Dispositivos</td><td></td><td></td>moleculares</tr><tr><td>Cámara de perfusión</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-24E</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem homogeneizador 10 ml</td><td>Wheaton</td><td>358039</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada SORVALL X4R PRO-MD</td><td>Thermo Scientific</td><td>75 009 521</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio redondos pequeños: 5 mm de diámetro, 0,1 mm de espesor</td><td>Warner Instruments</td><td>640700</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento de vibraciones</td><td>Newport</td><td>VIS3036-SG2-325A</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucónico</td><td>ácido Sigma Aldrich</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TMA</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>331635</td><td></td></tr><tr><td>TrisBase</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TrisCl</td><td>&nbsp; Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de la técnica patch-clamp para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

La termogénesis mitocondrial (también conocida como desacoplamiento mitocondrial) es uno de los objetivos más prometedores para aumentar el gasto de energía para combatir el síndrome metabólico. Los tejidos termogénicos como las grasas marrones y beige desarrollan mitocondrias altamente especializadas para la producción de calor. Las mitocondrias de otros tejidos, que producen principalmente ATP, también convierten hasta el 25% de la producción total de energía mitocondrial en calor y, por lo tanto, pueden tener un impacto considerable en la fisiología de todo el cuerpo. La termogénesis mitocondrial no solo es esencial para mantener la temperatura corporal, sino que también previene la obesidad inducida por la dieta y reduce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) para proteger las células del daño oxidativo. Dado que la termogénesis mitocondrial es un regulador clave del metabolismo celular, una comprensión mecanicista de este proceso fundamental ayudará en el desarrollo de estrategias terapéuticas para combatir muchas patologías asociadas con la disfunción mitocondrial. Es importante destacar que los mecanismos moleculares precisos que controlan la activación aguda de la termogénesis en las mitocondrias están mal definidos. Esta falta de información se debe en gran medida a la escasez de métodos para la medición directa de proteínas de desacoplamiento. El reciente desarrollo de la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias permitió, por primera vez, el estudio directo del fenómeno en el origen de la termogénesis mitocondrial, fuga de H+ a través de la IMM, y la primera caracterización biofísica de los transportadores mitocondriales responsables de la misma, la proteína desacoplamiento 1 (UCP1), específica de las grasas marrones y beige, y el transportador ADP/ATP (AAC) para todos los demás tejidos. Este enfoque único proporcionará nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la fuga de H + y la termogénesis mitocondrial y cómo se pueden dirigir para combatir el síndrome metabólico. Este artículo describe la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias para estudiar su capacidad termogénica midiendo directamente las corrientes H+ a través del IMM.

El desarrollo de la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias proporcionó el primer estudio directo de la fuga de H+ a través del IMM y los transportadores mitocondriales, UCP1 y AAC, que son los responsables de ello. El análisis electrofisiológico de las fugas de H+ dependientes de UCP1 y CAA puede proporcionar una primera mirada de la capacidad termogénica de las mitocondrias. La sección de resultados describe los procedimientos estándar para medir la fuga de H + a través de U...

Este artículo de método detalla los principales pasos para medir la fuga de H + a través de la membrana mitocondrial interna con la técnica patch-clamp, un nuevo enfoque para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias.

El uso de la técnica Patch-Clamp para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Este protocolo describe cómo se puede utilizar la técnica de pinza de parche para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias midiendo directamente la fuga de protones mitocondriales a través de la membrana mitocondrial interna. La medición directa de la corriente de protones a través de la membrana mitocondrial interna ayuda a identificar y caracterizar con precisión los mecanismos moleculares responsables de la termogénesis mitocondrial. Esta técnica permite no solo medir la corriente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, sino también estudiar otras conductancias importantes para la función mitocondrial, como el calcio o metabolitos como los nucleótidos de adenina.Coloque el ratón sacrificado sobre su espalda y rocíe alcohol para limpiar y mojar el cabello. Luego, haga una incisión de dos centímetros en el tórax. Después de agarrar la piel con pinzas, diseccionar el corazón del pecho del animal y enjuagarlo para eliminar toda la sangre en un vaso de precipitados de 10 mililitros con cinco mililitros de solución de aislamiento en frío.Una vez que el corazón haya sido limpiado de rastros de sangre, transfiéralo a otro vaso de precipitados de 10 mililitros que contenga cinco mililitros de tampón de aislamiento frío y córtelo en trozos delgados. Luego, transfiéralo a un homogeneizador de vidrio de 10 mililitros refrigerado por hielo. Use un agitador superior para homogeneizar el tejido precortado en hielo con seis golpes suaves a una velocidad controlada de 275 rotaciones por minuto.Transfiera el homogeneizado a un tubo cónico helado de 15 mililitros y centrífuguelo a 700 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular los núcleos y las células intactas. Recoge el sobrenadante en un tubo fresco de 15 mililitros y colócalo sobre hielo. Centrifugar el sobrenadante a 8, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados para obtener un gránulo que contenga las mitocondrias.Resuspend el pellet mitocondrial en 3,8 mililitros de tampón de manitol hipertónico helado e incubar la suspensión mitocondrial en hielo durante 10 a 15 minutos. Llene la suspensión de manitol hipertónico mitocondrial en una celda de minipresión refrigerada de la prensa francesa. Luego, coloque la celda en la prensa francesa.Luego, seleccione el modo bajo de la prensa francesa y comprima la suspensión a través de la celda de minipresión a 110 en el dial para las mitocondrias de grasa marrón, y a 140 para las mitocondrias del corazón, asegurando que la suspensión salga de la celda de minipresión a una velocidad de aproximadamente una gota por segundo. Recoge las gotas en un tubo cónico helado de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión a 10, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Resuspender el pellet de mitoplastos en 0.5 a 2 mililitros de tampón de cloruro de potasio hipertónico helado y almacenar la suspensión en hielo. Tire de los filamentos de vidrio de borosilicato el día de la grabación utilizando un extractor de micropipetas, estableciendo un programa en el extractor utilizado para generar pipetas con un alto grado de reproducibilidad. Inserte un filamento de vidrio dentro del extractor y tire para obtener casi dos pipetas de parche idénticas de un filamento de borosilicato.Ajuste el programa cuando las pipetas se vuelvan inconsistentes entre los ciclos de tracción debido al envejecimiento del filamento de la caja de calentamiento del extractor. Coloque la pipeta dentro del pulidor de pipetas y coloque la punta cerca del filamento con un aumento de 100X para pulirla al fuego. Presione el pedal varias veces para calentar el filamento sin obstruir o dañar la curva de la punta.Se pulen hasta que las pipetas tengan una resistencia entre 25 y 35 megaohmios cuando se llenan con solución de pipeta a base de TMA. La cubierta preincubada se desliza con gelatina al 0,1% para reducir la adhesión del mitplasto y enjuagarlas con la solución de baño de cloruro de potasio antes de depositar la suspensión de mitplastos. Prepare una dilución cruda mezclando aproximadamente 35 microlitros de la suspensión de mitoplastos concentrados con 500 microlitros de la solución de baño de cloruro de potasio y colóquela en las hojas de cubierta previamente colocadas en un pozo de una placa de cuatro pocillos.Incubar en hielo durante 15 a 20 minutos para que los mitoplastos sedimenten por el resbalón de la cubierta. Llene la cámara de baño completamente con aproximadamente 50 microlitros de la solución de baño de cloruro de potasio y transfiera un resbalón de cubierta con mitóticos dentro de la cámara utilizando pinzas de microdisección delgadas con una punta doblada. Coloque el resbalón de la cubierta en la parte inferior de la cámara sin perfundir la cámara para mantener los mitóticos estables en el resbalón de la cubierta.Elija un mitplasto no adhesivo individual escaneando el deslizamiento de la cubierta bajo el microscopio con un objetivo 60X. Cargue la pipeta con la solución de pipeta y colóquela en el soporte de pipeta. Lleve la pipeta a la solución de baño con un micromanipulador y muévala justo encima del mitoplastia seleccionado para acercarse a la IMM.Mantenga el potencial de membrana a cero milivoltios y aplique pulsos de 10 milivoltios utilizando el comando de prueba de membrana en el programa del amplificador. Aplique una ligera presión negativa para crear rápidamente un gigaseal con el IMM. Levante la pipeta con el mitplasto unido para mantenerlos alejados del deslizamiento de la cubierta para evitar la rotura del sello debido a la deriva de la pipeta durante el experimento.Compense los transitorios de capacitancia perdida con el comando de prueba de membrana en el programa del amplificador antes de probar la configuración de mitoplasto completo para obtener una medición de capacitancia correcta para la membrana del mitoplasto después del robo. Aplique pulsos de voltaje de corta duración con el programa amplificador para romper el parche de membrana debajo de la pipeta de vidrio y lograr la configuración de mitoplasto completo. Después del robo, ajuste los transitorios de capacitancia con la opción de prueba de membrana del programa del amplificador para evaluar la capacitancia de la membrana y su resistencia de acceso.Inmediatamente después del robo, reemplace la solución de baño de cloruro de potasio con una solución de baño HEPES a través de perfusión. Aplique un protocolo de rampa de 850 milisegundos con el programa amplificador. La aplicación del protocolo de rampa de voltaje induce una corriente de protones de gran amplitud a través del IMM de grasa marrón sin la adición de ácidos grasos exógenos, los activadores requeridos de los UCP.Después de la perfusión por guanosina difosfato inhibidor de UCP1 o ciclodextrina de metil beta 10 milimolar para la extracción de ácidos grasos de membrana endógena, la corriente residual se utiliza para determinar la amplitud de las corrientes de UCP1, que desaparece por completo en la IMM de ratones deficientes en UCP1. A diferencia de la grasa marrón, la IMM de los tejidos no adiposos, como el músculo esquelético y el corazón, no desarrolla una corriente de protones medible inmediatamente después del robo. Para inducir una corriente de protones medible a través de CAA, es esencial aplicar la solución de baño HEPES que contiene de uno a dos micromolares de ácidos grasos exógenos.Para confirmar que la corriente de protones medida es transportada por AAC, es importante aplicar inhibidores específicos, carboxiatractyloside, que inhiben casi por completo la corriente de protones mostrada en el IMM de ratones deficientes en AAC1. Una inhibición constante pero nunca completa de la fuga de protones se logra solo cuando ADP está presente en ambos lados de la membrana para generar un intercambio activo de nucleótidos a través de AAC. La calidad de la preparación del mitplasto influirá en la tasa de éxito en el logro de la configuración de mitoplasto completo.Es fundamental optimizarlo. Una vez que el mecanismo molecular de la termogénesis mitocondrial se disecciona con la técnica de pinza de parche, la medición del consumo de oxígeno mitocondrial demostrará la importancia de la corriente de protones y la termogénesis en las mitocondrias intactas. Esta técnica abre el camino para que los investigadores exploren todo tipo de conductancias, iones y metabolitos importantes para el funcionamiento de las mitocondrias.

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Investigación

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Biología

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Un método para aislar vesículas submitochondrial enriquecidas en F1FO complejos ATP sintasa de cerebro de rata se describe. Estas vesículas permiten el estudio de la actividad de ATPasa F1FO complejo y su modulación mediante la técnica de la grabación de patch clamp.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasa preparación de vesículas y técnica para realizar Patch clamp grabaciones de membranas de la vesícula submitocondriales

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Este método explota la contribución del poro de transición de permeabilidad mitocondrial a la fuga de protones de baja conductancia para determinar el umbral de voltaje para la apertura de poros en ratones con síndrome de X frágil neonatal con mayor contenido de coenzima Q mitocondrial de cardiomiocitos en comparación con el control de tipo salvaje.

Evaluación de la probabilidad abierta del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el contexto del exceso de coenzima Q

Los ratones y las ratas se implantan quirúrgicamente con transpondedores de temperatura remotos y luego se habitúan al entorno y procedimiento de prueba. Los cambios en la temperatura muscular se miden en respuesta a estímulos farmacológicos o contextuales en la jaula del hogar o durante la actividad física prescrita (es decir, caminar en la cinta a una velocidad constante).

Medición de la termogénesis del músculo esquelético en ratones y ratas

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la importancia fisiológica del impacto de la actividad del tejido adiposo marrón (BAT) en el metabolismo humano. Esto se logra combinando la carga de carbohidratos y la calorimetría indirecta con mediciones de cambios supraclaviculares en la temperatura. Este nuevo enfoque puede ayudar a desarrollar un objetivo farmacológico para la termogénesis BAT en humanos.

Uso de una combinación de calorimetría indirecta, termografía infrarroja y niveles de glucosa en sangre para medir la termogénesis del tejido adiposo marrón en humanos

Este protocolo detalla un método para medir directamente la actividad de los canales iónicos en vesículas intracelulares utilizando un sistema manual de pinza de parche endolisosomal. Ilustramos el método que consiste en agrandar los endolisosomas y aislar manualmente estas vesículas. Este enfoque garantiza que los investigadores puedan replicar y aplicar con precisión el procedimiento.

Técnicas de patch-clamp para el análisis de vesículas endolisosomales únicas

Pruebas de sensibilidad visual de las lagartijas con un paradigma de condicionamiento operante que utiliza la reproducción de vídeo de puntos aleatorios kinematograms e invertebrados generadas por ordenador.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Aprende la técnica patch-clamp para medir la fuga de protones en la membrana mitocondrial interna y evaluar la capacidad termogénica. Este método permite caracterizar mecanismos moleculares del metabolismo energético celular.

El uso de la técnica Patch-Clamp para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias

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