Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica

El protocolo consiste en normalizar la recolección del medio cultivado y el análisis de ploidía cromosómica basado en el cribado cromosómico no invasivo de NICS de embriones humanos preimplantacionales. La principal ventaja de NICS es la facilidad de operación en lugar de la micromanipulación de TiDieR, ahorra tiempo y reduce eficazmente la pérdida invasiva de muestras de biopsia. El método de muestreo es muy flexible.

Aquí te ofrecemos dos opciones diferentes, una para el cultivo secuencial rutinario de embriones, y otra para un paso. Estos son los principales colegas de nuestro equipo, el Dr. Yaxin Yao y el Dr. Xiaohui Zhu son los principales responsables de la preparación de la biblioteca y la secuenciación de la regeneración del NICS. El Dr. Jialin Jia y yo completamos el trabajo de embriología y la recolección de muestras.

El profesor Liu es el líder de nuestro grupo. También es la autora correspondiente de este artículo. Para empezar, prepare los reactivos y las herramientas.

Precalentar y equilibrar de 20 a 30 microlitros de medio de cultivo e hialuronidasa antes de usar. A continuación, coloque el medio de cultivo y la hialuronidasa sobre una superficie de trabajo en una campana extractora. Transfiera rápidamente los OCCC digeridos en la placa de cultivo para su manipulación de ovocitos y cúbralos con aceite mineral en cada pocillo.

Aspire suavemente y libere los ovocitos de cinco a 10 veces para eliminar las células residuales de la granulosa alrededor de los ovocitos. Repita este paso en los tres pocillos restantes para eliminar completamente las células de la granulosa. Evalúe la integridad de la extracción de células de la granulosa con un microscopio.

A continuación, realizar la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, también llamada ICSI, y transferir el embrión al medio de cultivo. Preparar de 20 a 30 microlitros de microgotas del medio de cultivo de blastocisto para cada embrión. Cubrir los embriones con aceite mineral en una placa de cultivo de tejidos el segundo día e incubar a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 5% de oxígeno.

Después de transferir el embrión del tercer día a la microgota de lavado, aspire suavemente y libere el embrión en la microgota en las tres gotas en serie utilizando las pipetas. A continuación, transfiera el embrión al medio de cultivo de blastocisto. Preparar las microgotas de lavado y las microgotas de cultivo.

En la tarde del cuarto día, transfiera el embrión a microgotas precalentadas de medio de cultivo y lave suavemente cada embrión en serie en tres microgotas con las pipetas. Transfiera cada embrión a una única microgota precalentada de medio de cultivo para la recolección de muestras. Cultivar el embrión de blastocisto antes de la criopreservación.

Para realizar la vitrificación antes de la criopreservación del embrión, prepare las microgotas de cultivo y transfiera el embrión a microgotas precalentadas de 10 a 15 microlitros de medio de cultivo. Y lavar suavemente cada embrión en serie en tres microgotas mediante pipeteo en la mañana del quinto día. Como se demostró anteriormente, transfiera cada embrión a una sola microgota única precalentada de medio de cultivo para la recolección de muestras.

Y cultivar el embrión de blastocisto a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono antes de la criopreservación. A continuación, ajuste suavemente el ICM a una distancia considerable del punto objetivo del rayo láser que se enfoca en la unión celular del trofoectodermo para generar un pequeño orificio en el trofoectodermo para liberar el líquido de la cavidad del blastocelo. Para recoger la muestra, descongele el tampón del kit a temperatura ambiente y centrifugue brevemente.

A continuación, transfiera el medio de cultivo de cada embrión cultivado a un tubo de PCR libre de ARNasa-DNasa que contenga cinco microlitros del tampón de lisis celular. Prepare los reactivos y las herramientas. Después de cuantificar el ADN genómico se diluye a una concentración de 50 picogramos por microlitro con el medio de cultivo.

Después de mezclar bien, centrifugue el tubo brevemente a 200 G durante cinco segundos. Después de centrifugar el medio de cultivo en una microcentrífuga durante 30 a 60 segundos, pipetee 10 microlitros de medio de cultivo desde la parte inferior del tubo de control positivo diluido y medio de cultivo fresco a un nuevo tubo de PCR de 0,2 mililitros. Agregue un microlitro de mezcla de enzimas MT y mezcle bien pipeteando.

Luego centrifugue inmediatamente durante dos o tres segundos. Coloque el tubo de PCR en una estación de preparación de muestras mixtas precalentadas y ejecute el programa de lisis. Una vez que el tampón de pre-biblioteca se haya descongelado y mezclado, centrifugue inmediatamente durante dos o tres segundos a 200 G. Prepare una mezcla maestra para la reacción de pre-biblioteca agregando dos microlitros de mezcla de enzimas de pre-biblioteca a 60 microlitros de tampón de pre-biblioteca.

Mezcle bien la reacción y centrifugue brevemente. Agregue 60 microlitros de mezcla de reacción previa a la biblioteca en la muestra de medio pretratada. Después de mezclarlo bien mediante pipeteo, centrifugue inmediatamente durante dos o tres segundos a 200 G. Coloque el tubo de PCR en la estación de preparación de muestras precalentada.

Ejecute el programa de pre-biblioteca y manténgalo a cuatro grados centígrados. Prepare una mezcla maestra para la reacción de biblioteca agregando 1,6 microlitros de mezcla de enzimas de biblioteca a 60 microlitros de tampón de biblioteca. Mezcle bien la reacción y centrifugue como se demostró anteriormente.

Agregue 60 microlitros de la mezcla de reacción de la biblioteca y dos microlitros del cebador de código de barras a cada producto de la prebiblioteca. Luego mezcle bien la reacción y centrifugue como se demuestra. Después de la centrifugación, coloque el tubo de PCR en el termociclador.

Ejecute el programa de preparación de la biblioteca y luego manténgalo a cuatro grados centígrados. Prepare los reactivos y las herramientas. Agregue las mega cuentas preparadas 1X a la muestra de la biblioteca.

Cuantifique las bibliotecas purificadas como se describe en el manuscrito de texto y utilice 10 nanogramos de cada muestra de biblioteca para la agrupación. Consulte la guía del usuario de secuenciación y realice el análisis de datos una vez completada la secuenciación. Introduzca el nombre y la contraseña del usuario en la página de inicio de sesión para el análisis de datos en ChromGo.

Una vez que haya iniciado sesión, haga clic en Crear envío en la pestaña NICS. A continuación, elija NGS para la plataforma, Illumina para Corporation y NICSInst para el reactivo. Introduzca la información del proyecto en el cuadro situado debajo de ID de proyecto.Establezca las preferencias de análisis y cargue los archivos.

Una vez que todos los archivos de secuenciación se hayan cargado correctamente, haga clic en Enviar para iniciar el análisis. Los proyectos enviados se enumeran en la pestaña Ver envíos. Haga clic en el botón Mostrar en el campo Informe para ver la tabla de resumen del análisis NICS.

Haga clic en el botón Exportar informe para guardar los informes. Se obtuvieron seis blastocistos de los pacientes y se realizó la NICS en los seis embriones desde el día cuatro hasta el día cinco. Las anomalías cromosómicas causadas por la translocación equilibrada de los padres se detectaron en cinco de los cromosomas mediante el ensayo NICS y, por lo tanto, no se utilizaron para la transferencia.

Los resultados de la NICS de los dos embriones mostraron que el mismo cariotipo 45 XN y la deleción del cromosoma 18 eran deleciones del cromosoma 18. El brazo corto del cariotipo 46 XN de la deleción de la región del cromosoma uno fue solo el brazo corto de la deleción de la región del cromosoma. Los resultados de la NICS mostraron cariotipo 46 XN con el brazo largo de deleción de la región del cromosoma 18 y el brazo corto de duplicación de la región del cromosoma uno.

Aunque los cariotipos eran duplicaciones del cromosoma cinco y mostraban ocho diferencias en mosaico, el ensayo NICS pudo detectar aneuploidías en los 24 cromosomas. Este proceso proporciona un nuevo método para transferir blastocistos de cariotipo normal único. Al intentar este procedimiento, es importante recordar eliminar completamente las células cumulares para evitar la contaminación de origen materno y recolectar el medio de cultivo y la etapa de blastocisto expuesta cuando el contenido de ADN sea suficiente para la amplificación.

Mediante el uso de la tecnología NICS, el presente estudio simplificó los pasos de preparación de la WGA y la biblioteca WGS en aproximadamente tres horas y optó por el resultado de CCS de forma no invasiva en aproximadamente nueve horas. Después de su desarrollo, la técnica proporcionó al clínico en ART una forma novedosa de combinar la evaluación morfológica con la NICS para transferir embriones de aploidía con buena morfología al útero que podrían mejorar las tasas de embarazo en curso y las tasas de nacidos vivos.