Modelo biomimético tridimensional in vitro de neuroblastoma con andamios basados en colágeno

Nuestro protocolo ofrece un modelo de bioingeniería en 3D que afecta de cerca al tejido nativo. Esto se puede utilizar potencialmente para descubrir nuevas terapias y biomarcadores para el tratamiento y el diagnóstico del neuroblastoma. La principal ventaja es que crea condiciones experimentales fisiológicamente más relevantes para estudiar el microambiente tumoral mediante una técnica reproducible que consigue consistencia lote a lote.

Nuestro método de andamiaje se puede utilizar, en primer lugar, para identificar nuevas terapias para el neuroblastoma y, en segundo lugar, para incorporar células derivadas del paciente para una mejor predicción de la respuesta individual del paciente. Para comenzar, coloque el andamio almacenado en PBS en la campana de flujo laminar. Use pinzas estériles para levantar suavemente el andamio de la esquina y presione contra la pared lateral para eliminar el exceso de PBS.

Luego coloque el andamio con la capa brillante hacia abajo en el centro del pocillo de una placa de 24 pocillos no adherente. Etiquete la placa con detalles de la línea celular, la densidad de siembra y los puntos de tiempo. Trabaje con las celdas de una densidad de siembra a la vez y mantenga las celdas restantes a 37 grados centígrados en la incubadora, hasta que estén listas para su uso.

Para la fijación de la célula en el andamio, utilice una pipeta P20 con puntas estériles para mezclar bien la suspensión celular y agregue 20 microlitros de la suspensión celular correspondiente en el centro de cada andamio, asegurándose de que la suspensión celular permanezca en la parte superior del andamio y no en la pared lateral o la base del pozo. Deje que las celdas se adhieran durante tres a cinco horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de humedad. Al final de la incubación, use una pipeta P1000 para agregar lentamente un mililitro de medio de crecimiento precalentado a cada pocillo, evitando el desplazamiento de los andamios, e incube la placa durante la noche.

Observe los andamios, inicialmente, cada dos o tres días para ver si hay cambios de color en el medio de crecimiento a medida que las células proliferan dentro del andamio. Utilice una pistola de pipetas de 10 mililitros con modo lento para retirar y desechar un mililitro del medio gastado del pocillo. Cuando se utilice el medio acondicionado para el experimento, recoja el medio gastado de las réplicas biológicas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y desgaste los restos celulares por centrifugación.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Después de configurar la pistola de pipetas en el modo de goteo, agregue suavemente dos mililitros de medio de crecimiento precalentado a los andamios. Incubar la placa que contiene el andamio y reponer el medio fresco durante el período de crecimiento deseado, como se demuestra.

En la campana de flujo laminar, esterilice el reactivo de ensayo de viabilidad celular adecuado mediante filtración a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros en un tubo de centrífuga. Precaliente la solución estéril, el medio de crecimiento completo y el PBS estéril en el baño de agua, a 37 grados centígrados. Con pinzas estériles, transfiera los andamios que se analizarán en una placa nueva de 24 pocillos y etiquete la placa con todos los detalles relevantes.

Agregue 900 microlitros del medio de cultivo precalentado a cada pocillo. A continuación, añada 100 microlitros del reactivo de viabilidad celular estéril a cada pocillo. Para un control negativo, añadir 900 microlitros de medio y 100 microlitros del reactivo de viabilidad celular estéril en un pocillo sin andamio.

Vuelva a colocar la tapa en la placa y muévala suavemente durante aproximadamente tres minutos para distribuir el reactivo de viabilidad celular diluido por todo el pocillo. Incubar la placa a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 95% de humedad. Después de retirar la placa de la incubadora, balancee suavemente la placa durante unos segundos y genere los triplicados, como se muestra en el manuscrito del texto.

Genere los triplicados técnicos transfiriendo 100 microlitros del medio incubado y el reactivo de un pocillo de la placa de 24 pocillos a un pocillo de la placa translúcida de 96 pocillos, y realice este paso un total de tres veces para un pocillo. Cubra la placa de 96 pocillos con papel de aluminio para proteger el reactivo de viabilidad celular de la luz. Retire y deseche los 700 microlitros restantes de medio y reactivo de los andamios en la placa de 24 pocillos.

Lave cada andamio dos veces con un mililitro de PBS estéril. Utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia a 570 y 600 nanómetros, y calcule el porcentaje de reducción de los reactivos de viabilidad celular según las recomendaciones del fabricante. Analizar estadísticamente los resultados de viabilidad celular, utilizando el software adecuado.

Introduzca los valores biológicos por triplicado para producir barras de error e indicar la variabilidad del ensayo. Realizar una prueba de análisis de varianza unidireccional para examinar los cambios en la viabilidad celular durante el período de tiempo experimental utilizando un software bioestadístico adecuado. Indique diferencias significativas entre los puntos de tiempo en los gráficos, como se describe en el manuscrito del texto.

Se evaluó la viabilidad de dos líneas celulares de neuroblastoma, KellyLuc e IMR32, cultivadas en los andamios. El aumento de la densidad celular dio lugar a una mayor reducción del reactivo de viabilidad celular con el tiempo. El crecimiento celular en los andamios se midió indirectamente cuantificando el ADN extraído de los andamios, y se calcularon las células por muestra.

Las células IMR32 mostraron un aumento del crecimiento, luego las células KellyLuc, con el tiempo. La morfología del crecimiento y la distribución de las células en los andamios se evaluaron visualmente mediante tinción con hematoxilina, eosina e inmunohistoquímica. Las células KellyCis83 crecieron más rápido y se infiltraron más profundamente en ambas composiciones de andamios que la línea celular Kelly menos invasiva.

IMR32 cultivado en nano-hidroxiapatita demostró un patrón de crecimiento contrastante con racimos grandes y densamente empaquetados, durante 14 días. Los rasgos específicos de la célula se monitorizaron mediante tinción inmunohistoquímica, seguida de tinción con faloidina y DAPI, y se observó la abundancia de actina en células Kelly y KellyCis83 en andamios de colágeno-glicosaminoglicano. Para la evaluación de la actividad celular in vitro, se midieron los niveles secretados de cromogranina A, y las células cultivadas en andamios de colágeno-glicosaminoglicanos y nano-hidroxiapatita de colágeno produjeron más cromogranina A en comparación con el crecimiento en cultivo 2D convencional.

La línea celular KellyCis83 resistente a la quimioterapia secretó más cromogranina A que la línea celular Kelly. Después de la unión celular, las células se pueden tratar con diversas terapias. Esto proporcionaría resultados fisiológicamente más relevantes para la respuesta de las células a los fármacos que el cultivo 2D convencional.

Esta técnica permite a los investigadores explorar mejor cómo se comportan y reaccionan las células cancerosas a un estímulo dentro del microambiente tumoral, desde la respuesta a la terapéutica o las interacciones con otros tipos de células.