Reconstruir el retinoblastoma humano in vitro
11 de octubre de 2022
Describimos un método para generar retinoblastoma humano (RB) mediante la introducción de mutaciones bialélicas RB1 en células madre embrionarias humanas (hESC). Las líneas celulares RB también podrían cultivarse con éxito utilizando el RB aislado en una placa.
El retinoblastoma humano es el tipo más común de cáncer intraocular en la infancia. Las muestras clínicas son difíciles de obtener y los modelos de ratones no pueden formar el retinoblastoma. Por lo tanto, la generación in vitro de retinoblastoma es esencial para observar la génesis, proliferación y crecimiento del retinoblastoma, y para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.
La eficacia de este protocolo puede alcanzar alrededor del 100%, aunque la duración de la generación del retinoblastoma es variable desde el día 45 hasta el día 120. Para el mantenimiento del retinoblastoma uno o RB una knockout de células madre embrionarias humanas, el cultivo del gen editado H nueve células en una placa de seis pocillos recubierta con factor de crecimiento redujo la matriz de la membrana basal y cambió el medio todos los días. Para pasar las células, incubarlas en tampón EDTA durante 3,5 minutos a 37 grados centígrados o cinco minutos a temperatura ambiente.
Cultive las células hasta que alcancen el 80% de confluencia. Luego, para iniciar la diferenciación de las células de la retina, retire el medio y enjuague las células con un mililitro de DPBS. A continuación, eleve las colonias celulares agregando un mililitro de tampón Dispase e incubando a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Observe las colonias celulares bajo un microscopio. Una vez que los bordes de las colonias comiencen a extenderse, aspire el tampón Dispase y enjuague suavemente las células una vez con un mililitro de DPBS. Luego agregue un mililitro de uno mediano en el pozo y con una punta de pipeta estándar de 10 microlitros, corte las colonias en pedazos.
Use un raspador de células para raspar las células restantes en el medio. Cosechar las células por centrifugación en un tubo de 15 mililitros. Después de la centrifugación, deje alrededor de 50 microlitros del sobrenadante para dispersar las células en el medio.
Luego agregue 250 microlitros de factor de crecimiento reducido en la matriz de la membrana basal y mezcle con una agitación suave. Después de mezclar, coloque el tubo de 15 mililitros con las células suspendidas en una incubadora de 37 grados centígrados. Después de una incubación de 20 minutos, las células y la matriz de membrana basal reducida del factor de crecimiento deben formar un gel solidificado.
A continuación, agregue un mililitro de uno mediano al tubo de 15 mililitros. Usando una pipeta de un mililitro, pipetear el gel solidificado dos o tres veces para dispersar el grupo. Luego agregue otros nueve mililitros de uno mediano y transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 10 centímetros.
Incubar el plato a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Esto se considera el día cero. El primer día, examine las células con un microscopio.
En promedio, se observan de tres a cuatro quistes en una pieza de gel. En el quinto día, cambie el medio recogiendo el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros, permitiendo que los quistes se asienten en el fondo y reemplazando el sobrenadante con uno mediano nuevo. Disperse los quistes en el tubo en dos platos de 10 centímetros, asegurando al menos 300 quistes en cada plato.
En el día siete, la mayoría de los quistes unidos al plato se extienden y forman colonias adherentes. El día 10, cambie el medio por uno medio fresco, asegurándose de que todos los quistes permanezcan unidos al plato. Observe las células bajo un microscopio de los días 13 a 17 para asegurarse de que las células se están extendiendo.
El día 15, después de enjuagar las células una vez con un mililitro de DPBS, agregue un mililitro de solución de Dispase e incube a 37 grados centígrados. Después de cinco minutos, retire el tampón Dispase y enjuague suavemente los cultivos con un mililitro de DPBS. Luego agregue 10 mililitros de dos medianos a cada plato de 10 centímetros e incube en una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Después de 24 horas, los cultivos adherentes se desprenden espontáneamente y se ensamblan en organoides retinianos. Tres días después del desprendimiento, recoger las células de la placa de cultivo celular en un tubo de 15 mililitros. Cuando los organoides se asienten, retire el sobrenadante del tubo y transfiera los organoides a una nueva placa de Petri no adherente con 10 mililitros de dos medianos durante los siguientes cuatro días.
Una semana después del desprendimiento, cambie el medio al medio tres y a partir de este día, cultive los organoides en el medio tres. En el día 27 del cultivo de organoides retinianos, la arquitectura de la vesícula óptica es evidente y alrededor del 90% de los organoides muestran esta estructura. La primera detección del retinoblastoma ocurre en el día 45 y se hace palpable en el día 50.
Cuando crece hasta el día 90, las estructuras de las vesículas ópticas están envueltas principalmente por el retinoblastoma. El retinoblastoma ahora se puede aislar y cultivar aún más como una línea celular. En el día 105, más del 80% de los organoides retinianos están completamente envueltos por el retinoblastoma.
Estos organoides expresan altamente el marcador de proliferación Ki67 y el marcador oncogén SYK en comparación con los organoides retinianos derivados de H nueve, lo que indica tumorigénesis. Además, la alta expresión del marcador precursor de cono ARR3 y el marcador precursor de fotorreceptores CRX en los organoides de retinoblastoma demuestra que se originan a partir de células precursoras de cono. Aquí se representan resultados inferiores y superiores durante las tres etapas morfológicas de la generación del retinoblastoma.
Las células madre embrionarias humanas diferenciadas e indiferenciadas se pueden distinguir fácilmente en función de su morfología. Las células indiferenciadas se eligen para la formación de retinoblastoma. En el quinto día, la esfera generada debe ser hueca en lugar de sólida.
El retinoblastoma se deriva de los organoides retinianos que muestran la arquitectura de vesículas ópticas. No se genera retinoblastoma a partir de los organoides inferiores. Mientras se realiza el procedimiento, todas las puntas deben enfriarse y la matriz de la membrana basal debe fundirse a cuatro grados antes de agregarla al tubo.
Este es un paso clave para este protocolo de diferenciación.
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Resumen
Este estudio presenta un método para generar retinoblastoma humano (RB) mediante la introducción de mutaciones bialélicas en el gen RB1 en células madre embrionarias humanas (hESC). El protocolo permite el cultivo exitoso de líneas celulares de RB in vitro, proporcionando un modelo valioso para la investigación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Oncología
Antecedentes
- El retinoblastoma humano es el cáncer intraocular más común en la infancia.
- Las muestras clínicas son difíciles de obtener, y los modelos de ratón existentes no replican eficazmente la enfermedad.
- La generación in vitro del retinoblastoma es fundamental para estudiar su desarrollo y probar nuevas terapias.
- La eficiencia del protocolo propuesto puede alcanzar aproximadamente el 100 %.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para generar retinoblastoma humano in vitro.
- Facilitar el estudio del origen, proliferación y crecimiento del retinoblastoma.
- Ayudar en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el retinoblastoma.
Métodos Utilizados
- Introducción de mutaciones bialélicas en RB1 en células madre embrionarias humanas.
- Cultivo de células H9 editadas genéticamente en una matriz de membrana basal con factores de crecimiento reducidos.
- Cambios diarios de medio para el mantenimiento celular.
- Pasaje de células utilizando tampón de EDTA a temperaturas especificadas.
Resultados Principales
- Generación exitosa de líneas celulares humanas de retinoblastoma.
- Duración variable para la generación de retinoblastoma, que oscila entre 45 y 120 días.
- Alta eficiencia en el cultivo in vitro de células de RB.
- Potencial para investigaciones futuras sobre terapias para el retinoblastoma.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para estudiar el retinoblastoma.
- Los modelos in vitro pueden mejorar la comprensión de la enfermedad.
- Este enfoque podría conducir al desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la reconstrucción in vitro del retinoblastoma humano a partir de líneas de hESC editadas genéticamente, proporcionando un modelo escalable y reproducible para estudiar la génesis tumoral y la respuesta terapéutica. Al recapitular el origen en precursor de cono del retinoblastoma, el modelo apoya la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en el descubrimiento de fármacos oncológicos. Aborda una brecha crítica en los modelos preclínicos debido a la falta de modelos roedores fieles y al acceso limitado a muestras clínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de pérdida de función de RB1 en un contexto celular humano.
- Valor operativo: Proporciona una fuente renovable de células de retinoblastoma para estudios de interacción con dianas.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de candidatos terapéuticos dirigidos contra la tumorigénesis derivada de precursores de conos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera organoides con marcadores cuantificables de tumorigénesis, como Ki67 y SYK.
- Valor operativo: Produce cultivos enriquecidos en retinoblastoma para el día 105, útiles para cribados consistentes de compuestos.
- Preparación para ensayos: Permite el monitoreo longitudinal del crecimiento tumoral, desde la arquitectura de la vesícula óptica hasta el envolvimiento completo.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra el origen específico de la enfermedad humana mediante la expresión de ARR3 y CRX en organoides de retinoblastoma.
- Valor operativo: Permite el aislamiento de líneas celulares de retinoblastoma para perfiles farmacodinámicos y de toxicidad posteriores.
- Continuidad traslacional: Conecta la diferenciación de células madre embrionarias humanas con la producción tumorigénica en una ventana temporal definida (día 45–120).
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, permitiendo la verificación de hipótesis sobre dianas mediante líneas de células madre embrionarias humanas isogénicas con mutación o interrupción del gen RB1 antes de la identificación del compuesto líder.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la investigación mecanicista de la pérdida de la vía RB1 en el desarrollo retiniano humano.
- Cribado: Genera líneas celulares de retinoblastoma adecuadas para ensayos de viabilidad y proliferación de alto contenido.
- Análisis: Proporciona puntos finales medibles que incluyen la formación de organoides, el envolvimiento tumorigénico y la expresión de marcadores.
- Investigación Traducional: Relaciona las firmas de precursores de conos con el resultado tumorigénico para la selección de dianas alineadas con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma para modelar otros cánceres pediátricos con orígenes celulares definidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción mecanicista de riesgos en terapias dirigidas a RB1 mediante la modelización de la tumorigénesis relevante para el ser humano.
- Valor operativo: Protocolo estandarizado de diferenciación con transiciones definidas de medios y cronograma establecido.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en la penetrancia tumoral y la expresión de marcadores, en un formato escalable.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos para retinoblastoma.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo de células madre embrionarias humanas (hESC), edición genética y diferenciación de organoides en 3D.
- Depende de una matriz de membrana basal con reducción de factores de crecimiento y formulaciones precisas del medio.
- Necesita un pase estandarizado utilizando tampón de EDTA a temperaturas controladas.
- Requiere monitoreo de la adaptación para mantener la fidelidad del marcador de precursores de conos en diferentes líneas de hESC.
- Limitado por la duración variable de la formación de retinoblastoma (día 45–120), lo que requiere un seguimiento longitudinal.
