Aplicación de interferencia CRISPR (CRISPRi) para silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira

Mi nombre es Jarlath Nally, y soy parte del equipo de investigación aquí en el Centro Nacional de Enfermedades Animales en Ames, Iowa, y trabajamos en la leptospirosis. La leptospirosis es una enfermedad desatendida. Es una enfermedad global.

Y realmente, tenemos una comprensión muy limitada de cómo este grupo único de bacterias causan la infección. Por lo tanto, la presentación de hoy trata de proporcionar una visión general de una nueva herramienta que está disponible para facilitar la evaluación de los mecanismos patógenos de la leptospirosis silenciando específicamente genes específicos expresados por la leptospira, utilizando una técnica llamada interferencia CRISPR. Sin embargo, la capacidad de seleccionar colonias de newton depende mucho de proporcionar el mejor medio de crecimiento para estas leptospiras fastidiosas.

Así que, en primer lugar, vamos a presentarles a Rick Hornsby, quien fue muy brevemente presente un nuevo medio para propagar estas bacterias fastidiosas. Y luego les presentaremos a Louis Fernandez, quien hablará sobre la metodología de interferencia CRISPR para silenciar los genes diana dentro de la leptospira. Hola, soy Rick Hornsby.

Desde su identificación por Anada hace más de 100 años, las leptospiras han sido típicamente aisladas y propagadas a 29 grados Centígrados, una temperatura que no refleja ni el medio ambiente ni la temperatura corporal del huésped mamífero. Hace 10 años, usda ERS comenzó a investigar mejoras en los medios de leptospira y a partir de esta investigación, Hornsby-Alt-Nally medios se desarrolló. Utilizando este medio, los médicos e investigadores han sido capaces de aislar y propagar más rápidamente las leptospiras de casos de campo y en la investigación in vitro a una temperatura y en un ambiente que emula más de cerca al huésped mamífero.

Seguimos optimizando este medio, pero tal y como está, HAN ha demostrado potencial para mejorar significativamente los aislamientos clínicos veterinarios y humanos en la investigación in vitro y el desarrollo de vacunas más eficaces para la prevención de la leptospirosis. Hola, soy Luis Fernández. Hasta ahora, la patogenesia de la leptospirosis seguía siendo debajo-explorada, principalmente debido a la carencia de tubos genéticos eficaces y fáciles de realizar.

Aquí vamos a describir una nueva técnica llamada interferencia CRISPR o CRISPRi. Y esta técnica es muy simple porque sólo necesitamos expresar dos componentes, una proteína de unión al ADN llamada Cas9 muerto, o dCas9, y una molécula de ARN quimérico llamada ARN de guía única. Y el complejo dCas9 y el ARN guía van a hacer emparejamiento de bases a nuestro gen objetivo y por lo tanto reducir o incluso bloquear la transcripción.

También mediante el uso de los medios han recientemente descritos, podríamos disminuir drásticamente el tiempo de formación de colonias para una recuperación mutante. El primer paso es definir el protoespacial que estará contenido en el ARN guía. Esta secuencia comprende 20 nucleótidos que definirán el emparejamiento de bases con los objetivos genéticos deseados.

Envíe una secuencia de nucleótidos al servidor web CHOPCHOP, con parámetros definidos para streptococcus pyogenes, Cas9, y el motivo adyacente del protoespaciador, NGG. En función de los resultados, seleccione protoespaciales con las mejores puntuaciones dentro de la tendencia menos. El motivo NGG no se incluirá en la secuencia final.

Hemos estado utilizando el promotor lipL32 para expresar el ARN de guía única, que contendrá la variable 20 nucleótidos a cinco primos en un andamio dCas9 conservado. Después de obtener el casete será relegado al PMaOri. Plásmido dCas9 en el sitio de restricción Xma1.

Para la conjugación las células de la leptospira se cultivan en 29 o 37 grados centígrados en medios de HAN. Un día antes de una conjugación, las células igualadas dispensadas donante se crecen en los medios de la libra complementados con el ácido diaminopimelic, el DAP, y la espectinomicina. A continuación, en el día de la fusión de la parrilla los cultivos saturados de E. coli en LB más DAP.

Dentro de una campana de bioseguridad, ensambló el aparato de filtración colocando el filtro de membrana en la parte superior de la base de vidrio, seguido de un embudo de vidrio de 15 ML. Ambas piezas se mantienen unidas por esta abrazadera de resorte. Luego conecte el vidrio a una bomba de vacío, agregue cinco ML de cultivos de leptospira al embudo.

A continuación, agregue la cepa E.Coli beta 2163 que contiene el plásmido de interés. El volumen variará según la densidad óptica del cultivo. Nuestro objetivo es la gaisión de células uno a uno.

Gire la bomba de vacío, ahora los líquidos que vamos a conseguir a través de la membrana y las células se concentrarán en la parte superior de la misma. Tome el filtro y colócalo en la placa EMJH más DAP, bicurier lado hacia arriba. Incubar las placas a 29 grados centígrados durante 24 horas.

Luego recupere los filtros de las placas y colóquelo en un tubo cónico de 50 ML. Utilice un ML de soporte HAN líquido para recuperar las celdas del filtro mediante pipeteo. Visualice las células recuperadas por microscopia de campo oscuro.

En esta etapa se pueden observar números equivalentes de E. coli y leptospiras. Se utilizan de 100 a 200 microlitros para propagar las bacterias en placas HAN que contienen espectinomicina. En esta etapa, se omite el DAP y E. coli no crecerá.

Las placas se incuban a 37 grados centígrados y 3% de CO2. Las colonias deben ser evidentes entre ocho a 10 días. Las colonias de Leptospira interrogans son un poco difíciles de visualizar.

Aquí estamos mostrando colonias cubiertas de vegetación para que sea más fácil verlas. Añadir 100 microlitros de HAN líquido, a 1,5 tubos ml para la recuperación de los mutantes. Se recomienda tomar al menos tres colonias de cada placa.

Usando una punta de pipeta, las colonias individuales se recuperarán de las placas. Se espera que Agger sea tomado solo. Las colonias deben tomarse de las placas de control que contienen MTP PMaOri.

dCas9 plásmido. Y placas con leptospiras que contienen plásmido con dCas9 y ARN guía diseñado para el gen diana. Las células recuperadas ahora se pueden visualizar bajo microscopía de campo oscuro para confirmar la presencia de leptospiras viables.

Después de la visualización de las leptospiras de la licencia, transfiera las células a los medios líquidos de HAN que contienen espectinomicina. Después del crecimiento del cultivo, las células ahora se pueden recuperar para silenciar la confirmación y la evaluación del fenotipo. Si los anticuerpos contra las proteínas diana están disponibles immunoblot es una metodología sencilla para evaluar el silenciamiento.

Leptospiras que contienen pMAOri. dCas9 solos, o con la guía de ARN Cas se evalúan por PCR, cebadores de madera flanqueando. El plásmido DMT dará como resultado una banda de aproximadamente 300 pares de bases y se alcanza un único tipo de alrededor de 700 cuando el cassette de ARN guía está presente.

Immunoblots usando los extractos enteros de la célula se realizan para silenciar la confirmación, la expresión de la proteína lipL32 se suprime en las células que contienen los plásmidos expresados en dCas9 y el ARN de la guía apuntando este gen. Y tanto el enlace a como el enlace B están ausentes en las células que contienen el ARN guía, es específico para ambos genes. El control lipL41 se puede ver en todos los carriles.

Así que hemos usado la interferencia CRISPR en leptospira interrogans, también la hemos usado en varias especies patógenas adicionales de leptospira. Lo hemos utilizado para silenciar genes específicos, así como para silenciar la expresión de pequeños ARN no codificantes. Nuestro interés de investigación está en la comprensión de los mecanismos patógenos de la infección, por lo que normalmente buscamos identificar los factores de varianza, pero obviamente puede silenciar su propio gen de elección y de acuerdo con su propia área de investigación.

Y por ejemplo, eso podría ser la motilidad o la comprensión de cómo las leptospiras persisten en el medio ambiente, o el metabolismo. En cualquier caso, deberías ser capaz de generar un mutante específico que te permita realizar genómica funcional y entender la importancia biológica del gen en cuestión. Así que de todos nosotros aquí en el Centro Nacional de Enfermedades Animales, le deseamos la mejor de las suertes con su investigación.