Name: Plataforma de cultivo de órganos del segmento anterior para el seguimiento de lesiones de globo abierto y rendimiento terapéutico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a utilizar una plataforma de cultivo de órganos del segmento anterior para evaluar lesiones de globo abierto y probar terapéuticas sin necesidad de animales. Este método permite monitorear la progresión de lesiones oculares durante tres días o más.

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Este material se basa en el trabajo apoyado por el Departamento de Defensa de los Estados Unidos a través de un acuerdo interinstitucional (# 19-1006-IM) con el programa de adquisición de Reparación Corneal Temporal (Agencia de Desarrollo de Material Médico del Ejército de los Estados Unidos).

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Los autores no declaran intereses contrapuestos. Las opiniones expresadas en este artículo son las del autor (s) y no reflejan la política o posición oficial del Departamento Médico del Ejército de los Estados Unidos, el Departamento del Ejército, el Departamento de Defensa o el Gobierno de los Estados Unidos.

Hay pasos críticos con la plataforma de lesiones ASOC OG que deben destacarse para mejorar la probabilidad de éxito al usar la metodología. En primer lugar, durante la disección del segmento anterior, preservar la malla trabecular es esencial pero difícil de hacer correctamente. Si la MT se interrumpe, el ojo no mantendrá la presión fisiológica y no cumplirá con los criterios de elegibilidad para el uso experimental. Se recomienda practicar primero el proceso de disección en condiciones normales en lugar de introducir lo...

Las lesiones de globo abierto (OG) pueden resultar en una pérdida permanente de la visión cuando no se tratan o al menos se estabilizan después deuna lesión 1. Sin embargo, los retrasos prevalecen en áreas remotas donde el acceso a la intervención oftálmica no está fácilmente disponible, como en áreas rurales o en el campo de batalla en escenarios militares. Cuando el tratamiento no está fácilmente disponible, el estándar actual de atención es proteger el ojo con un escudo rígido hasta que sea posible la intervención médica. En medicina militar, este retraso es actualmente de hasta 24 h, pero se prevé que aumente hasta 72 h en futuras operaciones de combate en entornos urbanos donde no es posible la evacuación aérea2,3,4. Estos retrasos pueden ser aún más largos en aplicaciones civiles rurales y remotas donde el acceso a la intervención oftálmica es limitado5,6. Una lesión OG no tratada es altamente susceptible a la infección y la pérdida de presión intraocular (PIO) debido a que el sello estanco del ojo se ve comprometido7,8. La pérdida de PIO puede afectar la viabilidad del tejido, por lo que es poco probable que cualquier intervención médica restaure la visión si el retraso entre la lesión y la terapéutica es demasiado largo9.
Para permitir el desarrollo de terapias fáciles de aplicar para sellar lesiones OG hasta que se pueda llegar a un especialista oftálmico, se desarrolló previamente un modelo de lesión OG de sobremesa10,11. Con este modelo, se crearon lesiones de alta velocidad en ojos porcinos enteros, mientras que la PIO fue capturada por transductores de presión. La terapéutica se puede aplicar para evaluar su capacidad para sellar el sitio de la lesión OG12. Sin embargo, como este modelo utiliza ojos porcinos enteros, solo puede evaluar el rendimiento terapéutico inmediato sin forma de rastrear el rendimiento a largo plazo en la posible ventana de 72 horas en la que el terapéutico debe estabilizar el sitio de la lesión hasta que el paciente llegue a la atención especializada. Como resultado, se desarrolló un modelo de lesión OG de cultivo de órganos del segmento anterior (ASOC) y se detalló en este protocolo como plataforma para el seguimiento del rendimiento terapéutico a largo plazo13.
ASOC es una técnica ampliamente utilizada para mantener el tejido avascular del segmento anterior, como la córnea, durante varias semanas después de la enucleación14,15,16,17. El segmento anterior se mantiene bajo PIO fisiológica mediante la perfusión de líquido a caudales fisiológicos y la preservación de la región de salida de malla trabecular, el tejido responsable de regular la PIO, durante la configuración de ASOC18,19. La plataforma ASOC puede mantener el tejido fisiológicamente, inducir una lesión OG utilizando un dispositivo neumático, aplicar una terapéutica y rastrear la estabilización de la lesión durante al menos 72 h después dela lesión 13.
Aquí, el protocolo proporciona una metodología paso a paso para usar la plataforma ASOC. Primero detalla cómo configurar y fabricar la plataforma ASOC. A continuación, el protocolo detalla cómo diseccionar asépticamente el segmento anterior y mantener la malla trabecular, seguido de la configuración del tejido del segmento anterior en platos de cultivo de órganos personalizados. Luego, detalla cómo crear lesiones de globo abierto y aplicar terapias inmediatamente después de la lesión. Por último, el protocolo proporciona una visión general sobre los parámetros de caracterización que son posibles de usar con este método que evalúa las propiedades funcionales, mecánicas y biológicas del ojo y qué tan bien se estabilizó la lesión. En general, este modelo proporciona una plataforma muy necesaria para acelerar el desarrollo de productos para estabilizar y tratar lesiones de globo abierto y mejorar el mal pronóstico de la visión después de una lesión.

<table><tbody><tr><td>10-32 Tapón recto de policarbonato, conector de tubo roscado macho</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K431</td><td></td></tr><tr><td>10-32 Tornillo de cabeza hueca, &frac12; "</td><td>McMaster-Carr</td><td>92196A269</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 20 mL</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Llave L de extremo de bola</td><td>McMaster-Carr</td><td>5020A25</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Fisher Scientific NC1696484</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Intramedic&nbsp; PE 160 Tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-12E</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón</td><td>Puritan</td><td>25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medios</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Junta tórica de silicona de alta temperatura, 2 mm de ancho, 4 mm de diámetro interior</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233T47</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td> grandes <td>World Precision Instruments</td><td>500365</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas grandes</td><td>World Precision Instruments</td><td>503261</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de dientes medianos</td><td>World Precision Instrumentos</td><td>501217</td><td></td></tr><tr><td>Clavo (objeto de punción)</td><td>McMaster-Carr</td><td>97808A503</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa de nylon</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Policarbonato, de tres vías, llave de paso con macho&nbsp; luer&nbsp; cerradura</td><td>Fisher</td><td>NC9593742</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Acero inoxidable 18 G&nbsp; 90 grados&nbsp; aguja dosificadora angular</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A81</td><td></td></tr><tr><td>Acero inoxidable 18 G recto & frac12; &#039;&rsquo; aguja dosificadora</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A675</td><td></td></tr><tr><td>Vasos de precipitados estériles de 100 ml con tapa</td><td>VWR</td><td>15704-092</td><td></td></tr><tr><td>Vannas&nbsp; tijeras</td><td>World Precision Instruments</td><td>WP5070</td><td></td></tr></tbody></table>

plataforma de cultivo de órganos del segmento anterior para el seguimiento de lesiones de globo abierto y rendimiento terapéutico

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Las lesiones de globo abierto tienen malos resultados visuales, lo que a menudo resulta en una pérdida permanente de la visión. Esto se debe en parte a un retraso prolongado entre las lesiones y la intervención médica en entornos rurales y aplicaciones de medicina militar donde la atención oftálmica no está fácilmente disponible. Las lesiones no tratadas son susceptibles a la infección después de que el ojo ha perdido su sello estanco, así como a la pérdida de viabilidad del tejido debido a la hipotensión intraocular. Las terapias para sellar temporalmente las lesiones del globo abierto, si se desarrollan adecuadamente, pueden restaurar la presión intraocular y prevenir la infección hasta que sea posible la atención oftálmica adecuada. Para facilitar el desarrollo del producto, aquí se detalla el uso de una plataforma de lesión de globo abierto de cultivo de órganos del segmento anterior para rastrear el rendimiento terapéutico durante al menos 72 h después de la lesión. El tejido del segmento anterior porcino se puede mantener en platos de cultivo de órganos diseñados a medida y mantenerse a presión intraocular fisiológica. Las lesiones por punción se pueden crear con un sistema neumático capaz de generar tamaños de lesión de hasta 4,5 mm de diámetro, similares a los tamaños de lesión relevantes para el ejército. La pérdida de presión intraocular se puede observar durante 72 h después de la lesión, lo que confirma la inducción adecuada de la lesión y la pérdida del sello estanco del ojo. El rendimiento terapéutico se puede rastrear mediante la aplicación al ojo después de la inducción de la lesión y luego el seguimiento de la presión intraocular durante varios días. Además, el modelo de lesión del segmento anterior es aplicable a los métodos ampliamente utilizados para el seguimiento funcional y biológico de la fisiología del segmento anterior, como la evaluación de la transparencia, la mecánica ocular, la salud del epitelio corneal y la viabilidad de los tejidos. En general, el método descrito aquí es un siguiente paso necesario hacia el desarrollo de terapias de biomateriales para sellar temporalmente las lesiones de globo abierto cuando la atención oftálmica no está fácilmente disponible.

Las imágenes capturadas a través de la tomografía de coherencia óptica (OCT) se muestran para los ojos lesionados OG para ilustrar cómo se ve una inducción de lesión exitosa. La Figura 3 muestra imágenes para el control y el tejido AS lesionado por OG inmediatamente después de la lesión y 72 h después. Se muestran dos vistas: imágenes transversales a través del sitio de la lesión y proyección de intensidad máxima (MIP) de arriba hacia abajo para visualizar el área de superficie de la imagen....

Las lesiones oculares de globo abierto pueden no tratarse durante varios días en escenarios rurales o militares relevantes, lo que resulta en ceguera. Se necesitan terapias para minimizar la pérdida de visión. Aquí, detallamos un modelo de lesión de globo abierto de cultivo de órganos. Con este modelo, las posibles terapias para estabilizar estas lesiones pueden evaluarse adecuadamente.

Plataforma de cultivo de órganos del segmento anterior para el seguimiento de lesiones de globo abierto y rendimiento terapéutico

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

Las lesiones de globo abierto pueden conducir a la pérdida permanente de la visión si no se tratan. Este modelo de cultivo de órganos del segmento anterior permite la evaluación de estas lesiones dentro de la necesidad de pruebas en animales. Este protocolo permite el seguimiento de lesiones de globo abierto, y terapéutico, para estabilizar la lesión durante tres o más días con una plataforma de cultivo de órganos.Demostrando el procedimiento estará Trent Pearson, un técnico de investigación del laboratorio Dr.Boice. Para comenzar, coloque la cortina quirúrgica y los instrumentos necesarios para la disección gruesa. Configure el gabinete de bioseguridad para visualizar los ojos en el microscopio de disección.Configure el gabinete de bioseguridad para el montaje del plato. Configure el espacio de trabajo de inducción de lesiones de globo abierto dentro del gabinete de bioseguridad. Coloque el vicio de seguimiento cruzado en el gato de laboratorio, frente a la plataforma de punción.Después de extraer los tejidos orbitarios adicionales y lavar los ojos con pbs antimicótico antibiótico, para hemisectar el ojo, coloque el ojo sobre la gasa antimicótica antimicótica PBS empapada. Use una hoja de afeitar estéril o un bisturí para crear una incisión cerca del ecuador del ojo. Luego hemisecte el ojo usando tijeras quirúrgicas curvas para aislar el ojo anterior.Use micro tijeras como pala para extraer el humor vítreo del segmento anterior y retire la lente del segmento anterior con micro tijeras. Corta gradualmente el iris a la raíz del iris radialmente hasta que la malla trabecular sea visible. Extienda el corte 360 grados alrededor del iris, para exponer toda la región de malla trabecular y limpie cualquier iris residual restante que cubra la malla trabecular si es necesario.Recorte los restos del cuerpo ciliar posteriores a la región de malla trabecular dejando solo una banda delgada de un milímetro del tejido. Después de colocar el segmento anterior en la placa de Petri. Humedezca un hisopo de algodón en el medio y aplique suavemente en el centro de la córnea para eliminar cualquier pigmento.Sostenga los ojos con las pórceps y elimine el pigmento adicional alrededor de la esclerótica limpiándolo. Coloque el segmento anterior invertido sobre la región elevada del plato inferior, asegurándose de que la córnea permanezca en el centro de la región elevada. Coloque el anillo de sujeción en la parte superior del segmento anterior recién colocado y apriete suavemente los tornillos con la tecla L.Conecte ambos conectores fluídicos con oídas a puertos roscados en la parte inferior del plato. Al primer conector fluídico conecte 18 bujes de aguja doblada de calibre 90 grados, una longitud de tubo, un cubo de aguja de calibre 18, un filtro de jeringa de nylon, una válvula de tres vías y una jeringa de 20 milímetros llena de medios. Al segundo conector fluídico conecte 18 bujes de aguja doblados de calibre 90 grados, una longitud de tubo, un cubo de aguja de calibre 18, una válvula de tres vías como se demostró para el primer conector de fluido y luego conecte la porción del barril de una jeringa estéril de 10 mililitros, que actuará como un depósito para atrapar el líquido y las burbujas.Manteniendo las válvulas de tres vías abiertas adecuadamente a las jeringas, empuje suavemente el medio a través del sistema, utilizando el primer puerto de conector de fluidos. Para inflar el segmento anterior, llene el tubo con medios y, finalmente, llene el depósito. Retire las burbujas empujando suavemente los medios dentro del plato e invierta el plato para empujar las burbujas.Coloque el plato de cultivo de órganos del segmento anterior en la incubadora de cultivo celular. Dirija las líneas de tubería a través de la parte inferior de la puerta de la incubadora para evitar interferencias con la apertura y el cierre de la puerta. Coloque las líneas de tubería con el depósito en el instrumento del transductor de presión.Conecte la válvula lateral de tres vías al transductor de presión configurado mientras PBS fluye a través de la línea para evitar que las burbujas de aire entren en las líneas de tubería. Dentro del gabinete de bioseguridad preparado para la inducción de lesiones abiertas, ajuste el regulador de presión en la plataforma de punción a una fuerza de 50 libras por pulgada cuadrada para generar una fuerza de punción adecuada en los objetos de hasta 4.5 milímetros de diámetro. Coloque el vicio de seguimiento cruzado en el conector de laboratorio frente a la plataforma de punción.Extienda el brazo del pistón a su distancia máxima y coloque el ápice corneal dentro de la región de un milímetro del objeto punzante, retraiga el brazo del pistón y acerque el segmento anterior un centímetro más al objeto punzante. Para encender el dispositivo de punción, encienda el dispositivo y abra la válvula solenoide con el segundo interruptor del dispositivo. Para retraer el dispositivo del ojo, presione el segundo interruptor, verifique la inducción adecuada de la lesión mediante la inspección visual y la fuga de medios del sitio de la lesión.Después de la cirugía, la integridad del epitelio corneal se evaluó mediante imágenes mediante tomografía de coherencia óptica. El tejido del segmento anterior lesionado fue fotografiado inmediatamente después de la lesión y 72 horas después de la lesión. Los ojos controlados no muestran una interrupción notable en la córnea, mientras que las lesiones claras se localizaron a través de la córnea después de la lesión.A partir de la proyección de intensidad máxima de arriba hacia abajo, fue evidente que las lesiones eran irregulares en forma y tamaño, pero el tamaño de la lesión disminuyó durante 72 horas. Se observó presión interocular durante los primeros tres días antes de la cirugía para determinar la estabilidad de la presión en el rango aceptable. En los resultados representativos, tres de cada cinco ojos se encuentran dentro del rango de presión interocular aceptable.La presión interocular cambia debido a la lesión del globo abierto y la intervención terapéutica. Después de la inducción de la lesión de globo abierto, la presión disminuyó significativamente y se mantuvo baja hasta que se completó el experimento. El tratamiento de los tejidos lesionados con adhesivo dermabond resultó en un aumento de la presión interocular en comparación con el tejido no tratado, lo que indica que este método se puede utilizar para medir la eficacia de la terapéutica para restaurar la presión intraocular.La configuración inicial del segmento en el cultivo de órganos es fundamental para la estabilidad a largo plazo del tejido. Apretar demasiado el anillo puede causar estrés en el tejido y reducir el cumplimiento.

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Bioingeniería

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