Despliegue de AAV de construcciones de expresión basadas en potenciadores in vivo en cerebro de ratón
March 31st, 2022
Este protocolo describe un nuevo ensayo de potenciador transitorio-reportero basado en rAAV. Este ensayo se puede utilizar para inducir la expresión impulsada por potenciadores in vivo en el cerebro del ratón.
Este protocolo es significativo porque permite la visualización no solo de si una secuencia potenciadora puede impulsar la expresión, sino también dónde puede impulsar la expresión en una parte particular del cuerpo. Es rápido. Las inyecciones tardan menos de 10 minutos en completarse, y si se expresa y dónde se expresa un gen reportero se puede ver a los pocos días de la recolección de la muestra.
Para comenzar la clonación, elija o diseñe una construcción de reportero. La construcción utilizada aquí coloca al candidato potenciador en las tres regiones principales no traducidas de un gen reportero EGFP expresado bajo el control del promotor mínimo hsp68. Para diseñar los cebadores de PCR para amplificar una secuencia de interés y clonar en el vector, agregue el brazo de homología apropiado para la clonación de Gibson al extremo principal de los cinco cebadores.
Usando los cebadores diseñados, realice PCR a partir de una muestra de ADN. Digiera de uno a 10 microgramos de ADN vectorial usando Pac1 y Asc1, dependiendo del número deseado de reacciones de clonación requeridas. Mediante el empleo de electroforesis en gel de 0,7 a 1% durante 30 a 60 minutos a 100 voltios, separe los fragmentos de digestión de restricción.
Extraiga la banda para el vector lineal y purifíquela con un kit de extracción de gel comercial. Una vez que se complete la clonación de Gibson y la transformación de las células, coloque las células en medios selectivos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Después de verificar la clonación exitosa de la construcción del reportero, inocule cinco mililitros del cultivo iniciador utilizando el stock de glicerol.
Cultive el cultivo durante ocho a 16 horas en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 180 rotaciones por minuto. A medida que el caldo se vuelve turbio, diluya el cultivo iniciador 1, 000x en 250 a 300 mililitros de caldo LB selectivo fresco, e incube durante la noche en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 180 rotaciones por minuto. Usando un maxi kit comercial de plásmidos, purifica el plásmido.
Para probar la recombinación de los ITR, realice una digestión Xma1. Visualiza las bandas. Asegúrese de que su resumen muestre el número esperado de bandas.
La recombinación dará como resultado menos bandas de las esperadas. Prepare la mezcla recombinante de AAV para la entrega. Si compara los patrones de expresión de múltiples virus reporteros potenciadores, diluya cada virus para equiparar los títulos de virus al virus menos concentrado.
Mezcle el virus reportero potenciador y el virus reportero de control expresado constitutivamente en una proporción de dos a uno o tres a uno. Agregue una pequeña cantidad de tinte verde rápido con una concentración final de 0.06%Rompa la punta de una pipeta de vidrio tirada hecha de un tubo capilar graduado de microlitro perforándola suavemente en una toallita delicada y sin pelusa. Inserte la pipeta en un conjunto de aspirador con un dispositivo de aplicación de presión conectado a una junta de goma para sostener una pipeta microcapilar.
Extraiga un pequeño volumen de alrededor de 0,2 a 0,5 microlitros de aceite mineral en la pipeta aplicando presión negativa a través del aspirador. Mantenga el conjunto del aspirador a un lado y coloque el virus en hielo hasta que esté listo para inyectarse. Después de crioanestesiar a los ratones neonatos, aplique presión negativa con el conjunto del aspirador y extraiga la mezcla de virus en la pipeta de vidrio tirado hasta que el menisco pase la marca de dos microlitros.
Retire el ratón de la cámara fría y colóquelo en la parte superior del banco. Localice los sitios de inyección bilateral a medio camino entre lambda y bregma, así como la sutura sagital y cada ojo. Desinfectarlos con una toallita con alcohol.
Perforar el cráneo de los ratones neonatos con la pipeta de vidrio tirado. A medida que la aguja entra en el cráneo, aplique una presión positiva a través del conjunto del aspirador. Dispensar un microlitro del virus en el ventrículo lateral y retirar la pipeta.
Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica o una cámara de calentamiento para recuperarse. Devuelva al animal a la jaula de la casa una vez despertado. Grabe imágenes de fluorescencia que atraviesan la sección del cerebro utilizando una lente subjetiva de bajo aumento 5x.
Al localizar el sitio de inyección, evalúe el alcance de la transducción del virus, dependiendo de la densidad e intensidad de las células fluorescentes rojas. Compare los animales que fueron transducidos de manera similar. Grabe imágenes fluorescentes con una lente objetivo de mayor aumento de más de 25x.
A continuación, abra el software de análisis y aplique un filtro mediano de tres por tres para reducir el ruido. Haga clic en el menú Proceso, luego haga clic en Ruido y elija la opción Desspeckle. A continuación, para restar la fluorescencia de fondo de las imágenes, comience separando los canales de una imagen multicanal.
Haga clic en el menú Imagen, luego haga clic en Color y seleccione la opción Dividir canales. Con la herramienta de selección de rectángulos o círculos, dibuje una forma pequeña en un área de la imagen sin celdas fluorescentes. Mida la intensidad de píxeles promedio del fondo haciendo clic en Analizar y luego en Medir, y repita para muestrear varias veces.
Promedie el valor gris medio de cinco a ocho áreas de fondo y elimine los valores decimales. Resta los valores de cada píxel de la imagen seleccionando el menú Proceso y, a continuación, haz clic en Matemáticas y restar. A continuación, introduzca el valor de fondo que desea restar y haga clic en Aceptar. Si es necesario, vuelva a combinar los canales en una imagen multicanal seleccionando el menú Imagen, luego haga clic en Color y seleccione Combinar canales.
Para contar el número de células fluorescentes verdes, oculte el canal verde y dibuje una forma alrededor de la región del cerebro que exprese fluorescencia roja utilizando la herramienta de selección de forma libre. Haga clic en la función Medir para medir el área, la densidad integrada y el valor gris medio del canal rojo en la zona seleccionada. Cuente el número de celdas verdes utilizando una herramienta de selección de varios puntos y normalice el número de celdas verdes por la intensidad integrada del canal rojo.
Después de transducir el informe potenciador que el ratón inyectado intracranealmente en P0 con una construcción positiva de AAV mostró expresión de EGFP impulsada por potenciadores en las capas inferiores medias de la corteza 28 días después de la inyección. El ratón inyectado con una construcción de control negativo en P0 no muestra ninguna expresión de EGFP 28 días después de la inyección, lo que demuestra que los elementos potenciadores se encuentran para impulsar la transcripción de EGFP en el cerebro del ratón. Para visualizar el área transducida con éxito y controlar la variabilidad potencial, se examinaron las bibliotecas de reporteros potenciadores entregados por AAV de diferentes títulos.
La biblioteca de títulos altos de potenciadores candidatos impulsa una amplia expresión de EGFP, mientras que la biblioteca de títulos más bajos de potenciadores candidatos impulsa la expresión dispersa de CGFP en el cerebro del ratón P7. Es vital mezclar el reportero potenciador AAV con el control positivo en cada inyección para distinguir entre potenciadores sin actividad y entregas fallidas. Este procedimiento se puede combinar con inmunohistoquímica, ARN FISH o secuenciación de ARN de una sola célula para determinar en qué tipos de células está activo un potenciador.
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Descripción general
Este estudio presenta un ensayo novedoso basado en rAAV y transitorio potenciador-reportero para su uso in vivo en el cerebro del ratón para visualizar la expresión génica impulsada por potenciadores. El protocolo permite a los investigadores evaluar rápidamente no solo si un potenciador puede impulsar la expresión, sino también dónde puede hacerlo dentro de regiones cerebrales específicas.
Componentes clave del estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Expresión Génica
- Biología Molecular
Antecedentes
- Comprender las secuencias potenciadoras es crucial para descifrar la regulación génica.
- Los modelos in vivo proporcionan información sobre los patrones de expresión en tejidos específicos.
- Este método permite una evaluación rápida de la actividad génica en comparación con los enfoques tradicionales.
Propósito del Estudio
- Crear un ensayo eficiente para visualizar la actividad potenciadora en un organismo vivo.
- Facilitar la evaluación rápida de la expresión del gen reportero en el cerebro del ratón.
- Permitir la localización precisa de la expresión impulsada por el potenciador.
Métodos Utilizados
- El protocolo utiliza un enfoque de transducción basado en rAAV.
- Se utilizan modelos de cerebro de ratón para evaluar los patrones de expresión después de la administración viral.
- Los pasos clave incluyen la clonación de constructos reporteros y la realización de inyecciones in vivo.
- El análisis de los patrones de expresión ocurre justo después de la inyección.
Resultados Principales
- Visualización exitosa de la expresión de EGFP impulsada por el potenciador en capas corticales específicas.
- Diferenciación clara entre los efectos de los constructos de control positivo y negativo.
- La validación de los patrones de expresión indica una evaluación eficaz de la actividad potenciadora.
Conclusiones
- Este protocolo demuestra un nuevo método para evaluar la función potenciadora in vivo.
- Permite una evaluación rápida y localizada de la expresión génica, mejorando nuestra comprensión de los mecanismos reguladores.
- El enfoque es valioso para futuros estudios que exploren la regulación génica en contextos neurales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, in vivo assessment of enhancer activity in the mouse brain, providing spatial and temporal resolution of gene regulation without requiring transgenic models. It supports target validation by linking non-coding DNA elements to functional expression patterns in disease-relevant neural circuits. The approach accelerates mechanistic de-risking in early discovery by delivering quantitative, imaging-based readouts of enhancer function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate enhancer sequences can drive gene expression in specific brain regions.
- Operational Value: Uses standard cloning and AAV packaging to generate enhancer-reporter libraries for high-throughput screening of regulatory elements.
- Predictive Value: Enables biological de-risking by linking enhancer activity to cell-type-specific expression patterns in the cortex and other neural structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative fluorescence readouts (EGFP intensity) that correlate with enhancer strength and activity patterns across developmental stages.
- Operational Value: Leverages expanding AAV serotypes and standardized imaging workflows for reproducible, scalable enhancer testing across multiple constructs.
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (transduced mouse brain) suitable for downstream applications like immunohistochemistry or single-cell RNA sequencing to define enhancer-active cell types.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping enhancer activity to specific cortical layers and developmental timepoints (P0 to P7).
- Translational Continuity: Enables cross-functional collaboration by providing standardized, spatially resolved expression data that can inform biomarker alignment and target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing active enhancers from negative controls through normalized green-to-red fluorescence ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing of non-coding regulatory elements prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing where enhancers drive expression in the mouse brain, linking genotype to phenotype in neural tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized virus production, equitized titers, and co-injection with control reporters to distinguish true enhancer activity from delivery failure.
- Analytics: Enables quantitative comparison of enhancer activity via integrated density measurements and background-subtracted fluorescence imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing follow-up with RNA FISH or immunohistochemistry to determine cell-type specificity of enhancer-driven expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer library screening, leveraging low-cost AAV production and standard microscopy for repeated campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in enhancer function through direct in vivo visualization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled virus titers, background subtraction protocols, and normalized cell counting.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of enhancer candidates without generating and maintaining transgenic lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing clear, imaging-based evidence of enhancer activity in disease-relevant brain regions.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for Gibson assembly and viral vector preparation.
- Depends on AAV purification and titration infrastructure for consistent enhancer-reporter delivery.
- Necessitates stereotaxic injection skills and neonatal mouse handling for accurate intracranial delivery.
- Relies on fluorescence microscopy and image analysis tools (e.g., background subtraction, channel splitting) for reliable readout.
- Limited by enhancer context-dependency; activity may vary across developmental stages, brain regions, or disease models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Enhancer Candidate Sequence Cloning into the AAV Vector Plasmid
3:09
Intracranially Inject rAAV-Packaged Plasmid into Neonatal Mice
5:32
Image and Analyze Brain Tissue Sections for Enhancer Activity
8:10
Results: AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs in Mouse Brain
9:21
Conclusion
