Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos

Los macrófagos asociados a tumores antiinflamatorios están relacionados con la progresión y el mal pronóstico del cáncer. Este protocolo es una guía para diferenciar y polarizar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Actualmente no existe un modelo establecido para la polarización antiinflamatoria de THP-1.

Este protocolo utiliza períodos de descanso adecuados y un proceso de polarización prolongado para crear un subtipo de macrófagos distinto similar a M2. El desarrollo de tumores, por ejemplo, en el cáncer de colon y la remodelación de tejidos, están controlados por macrófagos antiinflamatorios. Entre los estudios que investigan su función, la creación estandarizada de un subtipo distinto similar a M2 garantiza hallazgos reproducibles.

Comience configurando un temporizador durante 150 segundos. Retire el vial congelado que contiene la línea celular THP-1 del nitrógeno líquido y descongele el vial inmediatamente a 37 grados centígrados en un baño de agua limpia, iniciando el temporizador tan pronto como el vial se coloque en el baño de agua. Afloje la tapa para liberar la presión acumulada debido al proceso de descongelación, asegurando que la abertura del tubo no entre en contacto con el agua para evitar la contaminación.

Descongele la suspensión celular hasta que quede una viruta de hielo de unos cuatro milímetros de tamaño dentro del vial y proceda al siguiente paso inmediatamente. Transfiera la fase líquida de la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de medios de crecimiento calientes. Luego transfiera un mililitro de esta suspensión de células medianas calientes al vial de THP-1 y regrese al tubo de 15 mililitros para derretir la viruta de hielo restante, y enjuague el vial para asegurarse de que no queden células.

Mezcle la suspensión suavemente pipeteándola hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro. Retire aproximadamente 10 microlitros de la muestra para contar las células para la viabilidad usando azul tripano. Las células con citoplasma claro son viables, un citoplasma azul indica la muerte celular.

Mientras cuenta, gire hacia abajo la suspensión de células calientes a 200 veces G durante siete minutos a 37 grados centígrados. Retire el sobrenadante por completo y resuspónda las células en medio de crecimiento para lograr una densidad celular de 500, 000 células por mililitro. Mezcle la suspensión suavemente y transfiera 22 mililitros en matraces de cultivo celular T75 cada uno.

Almacene los matraces en posición vertical en una incubadora a 37 grados centígrados con una concentración de dióxido de carbono del 5% e intercambie los medios de crecimiento cada tres o cuatro días. Prepare la suspensión celular para sembrar las células a una densidad de 300, 000 por mililitro por pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos. Mezclar el medio suavemente y preparar alícuotas de 26 mililitros en tubos de 50 mililitros.

Transfiera un mililitro del medio que contiene la célula a cada pozo de una placa de 24 pozos. Mezcle el medio suavemente canaleándolo hacia arriba y hacia abajo entre transferencias. Mantenga la solución de trabajo recién preparada de PMA en hielo y agregue 100 nanogramos de PMA por pozo.

Incubar las placas en la incubadora sin ningún tratamiento adicional durante 72 horas. Después de 72 horas, retire el medio de crecimiento y reemplácelo con un mililitro de medio de crecimiento fresco, asegurándose de no tocar el fondo de los pozos con puntas de pipeta. Deje que las células descansen durante otras 96 horas en la incubadora.

Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con un mililitro de medio de crecimiento fresco. Agregue 20 nanogramos de interleucina 4 y 20 nanogramos de interleucina 13 por pozo. Luego deje que las células descansen durante 48 horas en la incubadora.

Repita todo el proceso después de 48 horas y deje que las células descansen durante otras 48 horas en la incubadora. Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con un mililitro de medio de crecimiento fresco. Luego deje que las células descansen durante 48 horas en la incubadora.

Retire el medio de células calientes de cada pozo y reemplácelo con una mezcla de un mililitro de PBS helado sin calcio y magnesio y 5% FBS. Luego, coloque inmediatamente la placa celular sobre hielo durante 45 minutos. Después de 45 minutos en hielo, raspe las células usando mini raspadores de células.

Transfiera suavemente los macrófagos desprendidos a PBS frío y 5% FBS en un tubo de 15 mililitros mantenido en hielo. Los macrófagos derivados del método de polarización muestran la expresión de CD14, así como los marcadores CD11b. Los marcadores de monocitos y macrófagos CD14 y CD11b se expresaron en el 70,9% y 74,7% de las células, respectivamente.

Las células mostraron bajos niveles superficiales del marcador similar a M1 CD80 en el 0,2% de las células, y altos niveles de superficie del marcador similar a M2 CD206 en el 62,6% de las células. Como las células THP-1 en medio tienden a hundirse en el fondo de un vial y son fáciles de activar a través del estrés mecánico, es importante mezclar y manipular suavemente las células. Los macrófagos similares a M2 se crean de manera reproducible y se han caracterizado utilizando QR-TPCR, ELISA y citometría de flujo.

Esta es la base para investigar los mecanismos antiinflamatorios en el desarrollo del cáncer o la remodelación de tejidos.