Un Método Eficiente Para La Inducción De Células Dirigidas Hepatocitos-Como De Las Células Madre Embrionarias Humanas

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).

Las células similares a hepatocitos derivadas de células madre embrionarias humanas son útiles en el modelado de enfermedades y la detección de fármacos. Este es un método eficiente y reproducible para inducir eficazmente la diferenciación de las células madre embrionarias humanas en células funcionales similares a hepatocitos. Un estado indiferenciado y una confluencia apropiada de células madre embrionarias humanas son fundamentales para una diferenciación exitosa a células similares a hepatocitos.

Para el mantenimiento de células madre, recubra placas estériles tratadas con cultivos de tejidos estériles de seis pozos con un mililitro de Matrigel calificado para células madre embrionarias humanas 1X por pozo, y guárdelas a cuatro grados Centígrados durante la noche. Deje las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Descongele las HESE crioconservadas en un baño de agua de 37 grados Celsius durante tres minutos sin agitar, luego transfiera inmediatamente las células madre pipeteándolas en un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio mTESR precalentado de 37 grados Celsius.

Centrifugar las HESE y aspirar el sobrenadante, a continuación, volver a suspender suavemente las células en un mililitro de medio mTESR. Aspirar el medio DMEM F-12 de la placa. Sembrar las células en una placa de seis pozos a una densidad de 1 x 10 a las células 5 en dos mililitros de mTESR, e incubar en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.

Mantenga las células reemplazando el medio con un medio mTESR precalentado diariamente. Pase las células en aproximadamente 70 a 80% de confluencia, o cuando las colonias celulares comienzan a hacer contacto. Para el paso de células, aspirar el medio e incubar las células con un mililitro por pozo de solución enzimática durante cinco minutos a 37 grados Centígrados.

Transfiera las células pipeteándolas en un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de DMEM F-12 precalentados a 37 grados Centígrados. Prepare placas de 24 pozos recubriendolas con 250 microlitros de medio Matrigel calificado por 1X hESC. Semillas hESCs a una densidad de 1 a 1,5 veces 10 a la 5ª celda por pozo en 500 microlitros de medio mTESR.

Añadir tanto la activina A a una concentración final de 100 nanogramos por mililitro como chir99021 a una concentración final de tres micromolares en un volumen adecuado de medio básico de diferenciación en fase uno precalentado. Después de tres días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores de células endodermas definitivas, como FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 y FOXA1. En el tercer día de diferenciación, aspirar el medio, reemplazarlo con el medio de etapa dos, e incubar durante 24 horas.

Cambie el medio cada dos días en los días cuatro a ocho. Después de ocho días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores apropiados de células progenitoras hepáticas, como HNF4 alfa, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. En el día ocho, aspire el medio de la etapa dos de las células, y reemplácelo con el medio de la etapa tres.

Permita que las células se incubarán durante 10 días a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono, y cambie el medio cada dos días con factores de diferenciación recién agregados. Después de 18 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores característicos de hepatocitos, como AAT, ALB, TTR, HNF4 alfa, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Se muestra el diagrama esquemático de células similares a hepatocitos de hESCs e imágenes de campo brillante de cada etapa de diferenciación.

En la primera etapa, la activina A y CHIR99021 se agregaron durante tres días para inducir a las células madre a formar células endodermas. En la etapa dos, las células del endodermo se diferenciaron en células progenitoras hepáticas después de ser tratadas con un medio de diferenciación durante cinco días. En la etapa tres, después de 10 días, los hepatocitos tempranos habían madurado y distinguido en hepatocito-como las células en factor de crecimiento y oncostatin del hepatocito.

En la etapa final de la diferenciación, las células demostraron un fenotipo típico del hepatocito. RT-PCR, la coloración de la inmunofluorescencia, y borrar occidental fueron utilizados para detectar a marcadores de las células del endodermo, de las células hepáticas del precursor, y de los hepatocitos maduros. Las células diferenciadas mostraron altos niveles de expresión de genes y proteínas relacionados con la diferenciación en cada etapa, como los marcadores de endodermo SOX17 en el día tres, la alfa hepática del marcador precursor HNF4 en el día ocho, AFP en el día 14 y el marcador de hepatocitos maduro ALB en el día 18.

El HLCs exhibió la coloración verde y la coloración ácida citoplásmica extensa de la cambio. Los hepatocitos demostraron morfología bi-nucleated típica. La actividad enzimática de CYP3A4, la CYP metabólica esencial en el hígado en HLCs, fue confirmada con un análisis de la enzima.

La ubicación de células madre embrionarias humanas con una densidad adecuada y el inicio de la diferenciación en la fecha siguiente son fundamentales. En la primera etapa, toque los medios suavemente porque las células son propensas a flotar hacia arriba. La combinación de activina A y otras moléculas pequeñas puede mejorar aún más las eficiencias de diferenciación y producir células más maduras similares a hepatocitos en este procedimiento.

Esta técnica puede proporcionar una plataforma para explorar el trasplante de hepatocitos, la ingeniería de tejidos hepáticos, los hígados bioartificiales y el modelado de enfermedades.