Name: Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende a identificar conformaciones locales estables en α-sinucleína mediante la técnica de mejora de fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo a nivel de molécula única.

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El plásmido pT-t7 que codifica el mutante A56C α-Syn nos fue dado como regalo por el Dr. Asaf Grupi, el Dr. Dan Amir y el Dr. Elisha Haas. Este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, subvención R01 GM130942 a E.L. como subaward), la Fundación de Ciencias de Israel (subvención 3565/20 dentro del Programa de Investigación KillCorona - Frenar el Coronavirus), el Fondo Milner y la Universidad Hebrea de Jerusalén (fondos de inicio).

Todos los autores no comparten ningún conflicto de intereses.

Se realizaron extensos estudios bioquímicos y biofísicos para estudiar las características estructurales de α-Syn y su naturaleza desordenada33,34,35,36,37,38. Varios trabajos ya han utilizado smFRET de libre difusión para investigar la dinámica intramolecul molecular del monómero α-Syn libre de unión. Estos trabajos reportar...

En las últimas dos décadas, los métodos basados en fluorescencia de una sola molécula se han convertido en una poderosa herramienta para medir biomoléculas1,2,sondeando cómo se distribuyen los diferentes parámetros biomoleculares, así como cómo se interconvierten dinámicamente entre diferentes subtensiones de estos parámetros a una resolución de menos de milisegundos3,4,5. Los parámetros en estas técnicas incluyen la eficiencia de transferencia de energía en las mediciones FRET 6,7,anisotropía de fluorescencia8,9,rendimientos cuánticos de fluorescencia y vidasútiles 10,11,en función de diferentes mecanismos de enfriamiento de fluorescencia12 o mejora13. Uno de estos mecanismos, más conocido como mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE)14 introduce la mejora del rendimiento cuántico de fluorescencia y la vida útil en función de la obstrucción estérica a la isomerización libre del fluoróforo cuando está en estado excitado, causada por superficies de proteínas en las cercanías del colorante14,15,16,17,18,19 . Tanto FRET como PIFE se consideran reglas espectroscópicas o sensores de proximidad, ya que su parámetro medido está directamente relacionado con una medida espacial dentro de la biomolécula etiquetada bajo medición. Mientras que la eficiencia FRET está relacionada con la distancia entre un par de colorantes dentro de un rango de 3-10 nm20,PIFE rastrea aumentos en los rendimientos cuánticos de fluorescencia o vidas útiles relacionadas con la distancia entre el tinte y una superficie de una proteína cercana en el rango de 0-3 nm19.
El FRET de molécula única se ha utilizado ampliamente para proporcionar información estructural sobre muchos sistemas de proteínas diferentes, incluidas las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs)21, como la α-Sinucleína (α-Syn)22. α-Syn puede formar estructuras ordenadas después de la unión a diferentes biomoléculas y bajo diferentes condiciones23,24,25,26,27,28,29,30. Sin embargo, cuando no está unido, el monómero α-Syn se caracteriza por una alta heterogeneidad conformacional con conformaciones que se interconvierten rápidamente31,32.
Las conformaciones de α-Syn han sido estudiadas previamente utilizando diversas técnicas diferentes que ayudan a identificar dinámicas conformacionales de tales sistemas proteicos altamente heterogéneos y dinámicos33,34 , 35,36,37,38,39. Curiosamente, las mediciones fret de una sola molécula (smFRET) de α-Syn en tampón informaron una sola población fret39,40 que es el resultado del promedio de tiempo de conformaciones que se interconvierten dinámicamente a veces mucho más rápido que el tiempo de difusión típico de α-Syn a través del punto confocal (tiempos tan rápidos como pocos microsegundos e incluso más rápido que eso, en relación con los tiempos de difusión típicos de milisegundos)40, 41. Sin embargo, el uso de una regla espectroscópica FRET con la sensibilidad de distancia de 3-10 nm a veces informa solo sobre los cambios estructurales generales en una proteína pequeña como α-Syn. Las mediciones de una sola molécula que utilizan sensores de proximidad espectroscópicos con sensibilidades de distancia más cortas tienen el potencial de informar sobre la dinámica de las estructuras locales. Aquí realizamos mediciones PIFE de una sola molécula de α-Syn e identificamos diferentes sub-poblaciones de vidas de fluorescencia mapeando diferentes estructuras locales con transiciones entre ellas tan lentas como 100 ms. Este trabajo resume las mediciones smPIFE resueltas en el tiempo de moléculas de α-Syn de difusión libre de una en una, en tampón y cuando se unen a membranas basadas en SDS como un sensor de proximidad espectroscópico de molécula única de corto alcance.

<table><tbody><tr><td>Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 Merc</td><td></td><td>C7715</td><td>corte: 100 kDa</td></tr><tr><td>sulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>cisteamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>bolsas de diálisis - MEGA GeBaFlex-tube</td><td>Bio-Application MEGA320</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Solución rápida de tinción SeeBand</td><td>Bioaplicación génica</td><td>SB050</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Desalinizador 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1408</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromán-2-carboxílico (TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>isopropilo &beta;-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>Magnesio cloruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>Columna MonoQ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54807</td><td></td></tr><tr><td>proteína LoBind tubo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108094</td><td>0,5 mL</td></tr><tr><td>Enjuague un &micro;-slide 18</td><td>Ibidi</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>Esparcidores de células estériles, espátulas Drigalski</td><td>mini-plast</td><td>815-004-05-001</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-Cy3&nbsp; maleimida</td><td>ABCAM</td><td>AB146493</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

El uso de reglas espectroscópicas para rastrear múltiples conformaciones de biomoléculas individuales y su dinámica han revolucionado la comprensión de la dinámica estructural y sus contribuciones a la biología. Mientras que la regla basada en FRET informa sobre las distancias entre colorantes en el rango de 3-10 nm, otras técnicas espectroscópicas, como la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE), informan sobre la proximidad entre un colorante y una superficie de proteína en el rango más corto de 0-3 nm. Independientemente del método de elección, su uso en la medición de biomoléculas de difusión libre de una en una recupera histogramas del parámetro experimental que producen subtensiones separadas de biomoléculas distribuidas centralmente, donde cada subpuesto representa una sola conformación que permaneció sin cambios en milisegundos, o múltiples conformaciones que se interconvierten mucho más rápido que milisegundos, y por lo tanto una subalidad promediada. En fret de molécula única, donde el parámetro reportado en los histogramas es la eficiencia fretante entre colorantes, una proteína intrínsecamente desordenada, como el monómero de α-sinucleína en tampón, se informó previamente como exhibiendo una sola sub-población promediada de múltiples conformaciones que se interconvierten rápidamente. Si bien estos hallazgos anteriores dependen del rango de 3-10 nm de la regla basada en FRET, buscamos poner esta proteína a prueba utilizando PIFE de molécula única, donde rastreamos la vida útil de fluorescencia de las proteínas de α-sinucleínas α-Synuclein etiquetadas con sCy3 específicas del sitio. Curiosamente, utilizando este sensor de proximidad espectroscópico de corto alcance, la α-Sinucleína etiquetada con sCy3 exhibe varias subtensiones de por vida con vidas medias claramente diferentes que se interconvierten en 10-100 ms. Estos resultados muestran que, si bien α-sinucleína puede estar desordenada a nivel mundial, sin embargo, alcanza estructuras locales estables. En resumen, en este trabajo destacamos la ventaja de utilizar diferentes sensores de proximidad espectroscópicos que rastrean los cambios estructurales locales o globales una biomolécula a la vez.

Como IDP, cuando no está unido a otra biomolécula, α-Syn exhibe dinámica estructural entre múltiples conformaciones, con transiciones a pocos microsegundos40 e incluso a cientos de nanosegundos41. Cuando α-Syn cruza la mancha confocal, puede sufrir miles de transiciones entre conformaciones. De hecho, este fue el caso cuando se utilizó smFRET39,40. Aquí realizamos mediciones smPIFE para sondear la dinámica conformac...

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula puede complementar las mediciones de FRET de una sola molécula cuando se estudian subpoblaciones y conformaciones estructurales de proteínas, especialmente en los casos en que distintas subpoblaciones estructurales informan sobre estructuras locales estables. La principal ventaja de esta técnica es que captura distintas subtenuciones estructurales específicas del sitio en función de la proximidad del sitio de etiquetado del colorante a las superficies de la proteína. La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula se puede aplicar a cualquier sistema biomolecular de interés para sondear subpoblaciones estructurales distintas, locales.Comience preparando 25 alfa-sinucleína picomolares marcadas con Sulfo-Cy3 en tampón de medición en un tubo de unión a proteínas bajas. Agregue 100 microlitros de un miligramo por mililitro BSA a la diapositiva de la cubierta de microscopía de 18 cámaras e incube durante un minuto, luego, deseche el BSA. Agregue 100 microlitros de 25 muestras picomolares de alfa-sinucleína etiquetadas con Sulfo-Cy3 en la cámara de la diapositiva de deslizamiento de la cub

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Aprende a identificar conformaciones locales estables en α-sinucleína mediante la técnica de mejora de fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo a nivel de molécula única.

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez (Video) | JoVE Journal

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

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