Name: Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Aprende a generar perfiles de polisomas sin sistemas automatizados de fraccionamiento. Este método manual permite analizar la actividad ribosomal en células de Saccharomyces cerevisiae mediante gradientes de sacarosa preparados paso a paso.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen al Dr. Percy Tumbale y a la Dra. Melissa Wells por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).

1. Preparación de gradientes de sacarosa al 7% - 47%
NOTA: El rango lineal del gradiente de sacarosa se puede modificar para lograr una mejor separación dependiendo del tipo de célula utilizada. Este protocolo está optimizado para perfiles de polisomas para S. cerevisiae.
<ol><li>Preparar soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% en tampón de gradiente de sacarosa (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 y 1 mM DTT). Esterilizar con filtro las soluciones madre de sacarosa a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 14 ml de soluciones de sacarosa al 17%, 27% y 37% dispensando y mezclando las soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% de la manera descrita en la Tabla 1.</li>
	<li>Coloque seis tubos de centrífuga de polipropileno (14 x 89 mm) en un bastidor de tubos de ensayo de vista completa. Asegúrese de que haya suficiente espacio entre los tubos para que las acciones con un tubo no perturben a los demás.</li>
	<li>Coloque una aguja larga en una jeringa de 3 ml. Para este protocolo, use una aguja de 9 pulgadas y 22 G con una punta roma (Figura 1), pero cualquier aguja lo suficientemente larga como para llegar al fondo del tubo de centrífuga será suficiente. NOTA: Realice un llenado y dispensación de prueba para asegurarse de que la jeringa pueda contener la solución de sacarosa sin ningún goteo antes de configurar los gradientes.</li>
	<li>Agregue 2 ml de sacarosa al 7% en el fondo de cada tubo de centrífuga.</li>
	<li>Agregue 2 ml de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7% colocando la punta de la aguja en las inmediaciones del fondo del tubo y dispensando la solución lenta y cuidadosamente.</li>
	<li>Repita con 2 ml cada una de las soluciones de sacarosa al 27%, 37% y 47%. Asegúrese de que cada capa se distinga entre sí por una línea que marque la separación de densidades (Figura 2). NOTA: Si los gradientes no se van a utilizar dentro de las 48 horas, en este punto, antes de su asentamiento en un gradiente continuo, congele rápidamente los tubos con soluciones de sacarosa en capas en nitrógeno líquido y guárdelos en un congelador de -80 ° C para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Almacene los gradientes a 4 °C durante la noche para permitir que los gradientes se asienten en un porcentaje continuo y creciente de sacarosa. Las soluciones de sacarosa en capas tardan de 8 a 12 h en asentarse en un gradiente lineal de sacarosa. Los gradientes lineales son estables durante un máximo de 48 h. El almacenamiento nocturno a 4 °C proporciona tiempo suficiente para la descongelación y el asentamiento en un gradiente lineal para el uso de soluciones de sacarosa congeladas y en capas. Utilice un densitómetro para evaluar la calidad del gradiente. NOTA: Es fundamental almacenar los gradientes en un lugar estable donde no se alteren, ya que cualquier movimiento o vibración interrumpirá el gradiente.</li>
</ol>2. Preparación de extractos de células de levadura
<ol><li>Inocular la cepa de levadura de interés en 50 ml de extracto de levadura peptona dextrosa (YPD) y cultivar durante la noche a 30 °C en una incubadora de agitación hasta la fase estacionaria. NOTA: La temperatura puede variar dependiendo de los requisitos de la cepa de levadura.</li>
	<li>Transfiera 10 ml de cultivo en fase estacionaria a 1 L de medios YPD frescos. Incubar las células con agitación vigorosa a 30 °C (u otra temperatura adecuada) hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento exponencial medio (DO600 = 0,4-0,6).</li>
	<li>En la fase de crecimiento exponencial medio, añadir cicloheximida al cultivo a una concentración final de 0,1 mg/ml. Incubar en hielo durante 5 min.</li>
	<li>Cosechar las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min a 4 °C. NOTA: En este punto, las células se pueden congelar y almacenar a -80 °C.</li>
	<li>Resuspender las células en 700 μL refrigerados de tampón de extracción de polisomas (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0.1 mg/mL de cicloheximida, 0.2 mg/mL de heparina). Agregue 100 unidades de inhibidor de RNasa y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 1.5 ml.</li>
	<li>Agregue ~ 400 μL de perlas de vidrio preenfriadas con un rango de tamaño de 425-600 μm al tubo de centrífuga. Interrumpir las células de levadura mediante agitación vigorosa en un batidor de cuentas durante 5 min.</li>
	<li>Aclarar el lisado por centrifugación a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Determinar la concentración del ARN en el lisado clarificado midiendo la absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro o utilizando un sistema de detección de ARN basado en fluorescencia. NOTA: Para mediciones de concentración de ARN muy precisas, utilice kits de detección de ARN basados en fluorescencia.</li>
	<li>Asegúrese de que la concentración de ARN sea de 0,5-1 μg/μL. Si la concentración de ARN es demasiado baja, reduzca el volumen del tampón de extracción de polisomas utilizado para resuspender las células en futuros experimentos. NOTA: Cargue el lisado en los gradientes inmediatamente después de la lisis y la cuantificación de ARN. Si es necesario, congelar rápidamente los lisados en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C durante unos días.</li>
</ol>3. Centrifugación de gradientes
<ol><li>Cargue cuidadosamente el lisado en la parte superior de los degradados. Coloque la punta de la pipeta contra la pared interior, en la parte superior del tubo de polipropileno. Incline suavemente el tubo y dispense lentamente el lisado en la parte superior del gradiente goteando contra la pared. Tenga mucho cuidado de no interrumpir o alterar el gradiente al cargar el lisado. NOTA: La cantidad de lisado cargado variará según el tipo de celda. El contenido del ARN también variará. Puede ser necesario realizar una serie de experimentos para determinar la cantidad de lisado necesaria para generar un perfil de polisoma óptimo. Para la levadura, 300 μg de ARN es un buen punto de partida para la optimización.</li>
	<li>Coloque suavemente los tubos en los cubos preenfriados de un rotor de cangilón oscilante. NOTA: Cada tubo de centrífuga de polipropileno debe tener volúmenes iguales de gradiente y la cantidad de lisado cargada. Esto puede variar de un tubo a otro. Asegúrese de que la variación no cause un error de desequilibrio durante la ultracentrifugación.</li>
	<li>Centrifugar los gradientes a 260,110 x g durante 150 min a 4 °C.</li>
</ol>4. Fracción y recogida de datos
<ol><li>Retire con cuidado los tubos de la centrífuga del rotor del cucharón oscilante y colóquelos en un soporte para tubos.</li>
	<li>Etiquete las placas de 96 pocillos para almacenar las fracciones y preenfriarlas en hielo. NOTA: Utilice una placa de 96 pocillos adecuada para un espectrofotómetro que tenga una ventana óptica de hasta 230 nm para determinaciones de ácidos nucleicos a 260 nm/280 nm.</li>
	<li>Recoja fracciones de 100 μL o 200 μL comenzando desde la parte superior del degradado insertando cuidadosamente una punta de pipete en la parte superior del degradado. Recolecte fracciones hasta que todo el gradiente sea alícuoto. El número de fracciones dependerá del volumen total del gradiente. NOTA: Recopile las fracciones de una manera que no interrumpa el resto del degradado. Asegúrese de que todas las fracciones tengan el mismo volumen. Además del fraccionamiento manual, otro método de bajo costo para el fraccionamiento es usar una pequeña bomba peristáltica.</li>
	<li>Transfiera cada fracción a la placa de 96 pocillos para llegar al fondo del tubo de centrífuga. Mantenga las fracciones recolectadas en el hielo en todo momento.</li>
	<li>Mida la absorbancia de cada fracción a 254 nm con un espectrofotómetro. Use las soluciones de sacarosa al 7% y 47% como espacios en blanco. NOTA: Al medir la absorbancia de fracciones, tenga en cuenta que para la mayoría de los espectrómetros y colorímetros, el rango de absorbancia más efectivo es 0.1-1. Si las mediciones de absorbancia están fuera del rango (≥1.0), las fracciones tienen demasiado material. Diluya la muestra, recopile los datos y luego tenga en cuenta el factor de dilución al trazar el perfil.</li>
	<li>Cree el perfil del polisoma trazando el número de fracción frente a la absorbancia.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).</li>
<li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79(2019).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3(2018).</li>
<li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+in+leishmania%2C+human+cells+and+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600(2018).</li>
<li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate%2C+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573(2017).</li>
<li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295(2014).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164(2014).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126(2017).</li>
<li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li>
<li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li>
<li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+assembly+coming+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li>
<li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+puzzle+of+life%3A+Crafting+ribosomal+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li>
<li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nascent+ribosome%3A+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymolog%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se ha descrito un método para crear perfiles polisómicos sin el uso de costosos sistemas de fraccionamiento automatizado. La ventaja de este método es que hace que el perfil de polisomas sea accesible para los laboratorios que no tienen sistemas de fraccionamiento automatizados. Las principales desventajas de este protocolo son el tedioso fraccionamiento manual y la sensibilidad reducida en comparación con el sistema de fraccionamiento de densidad dedicado.
Este protocolo implica una prep...

Los ribosomas son complejos de ribonucleoproteínas mega-Dalton que realizan el proceso fundamental de traducir el ARNm en proteínas. Los ribosomas son responsables de llevar a cabo la síntesis de todas las proteínas dentro de una célula. Los ribosomas eucariotas comprenden dos subunidades designadas como la subunidad ribosómica pequeña (40S) y la subunidad ribosómica grande (60S) de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación. El ribosoma completamente ensamblado se designa como el monosoma 80S. Los polisomas son grupos de ribosomas dedicados a traducir una sola molécula de ARNm. El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es un método poderoso utilizado para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos asociados con la traducción de ribosomas y analizar factores asociados a polisomas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Esta técnica se utiliza a menudo para separar polisomas de ribosomas individuales, subunidades ribosómicas y partículas de ribonucleoproteína mensajera. Los perfiles obtenidos del fraccionamiento pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad de traducción de los polisomas14 y el estado de ensamblaje de los ribosomas15,16,17.
El ensamblaje de ribosomas es un proceso muy complejo facilitado por un grupo de proteínas conocidas como factores de ensamblaje de ribosomas 18,19,20,21. Estos factores realizan una amplia gama de funciones durante la biogénesis de los ribosomas a través de interacciones con muchas otras proteínas, incluyendo ATPasas, endo y exo-nucleasas, GTPasas, helicasas de ARN y proteínas de unión a ARN22. El fraccionamiento de polisomas ha sido una poderosa herramienta utilizada para investigar el papel de estos factores en el ensamblaje de ribosomas. Por ejemplo, este método ha sido utilizado para demostrar cómo las mutaciones en la polinucleótido quinasa Grc3, un factor de procesamiento pre-rRNA, pueden afectar negativamente el proceso de ensamblaje de ribosomas17,23. El perfil de polisomas también ha resaltado y mostrado cómo los motivos conservados dentro de la ATPasa Rix7 son esenciales para la producción de ribosomas16.
El procedimiento para el fraccionamiento de polisomas comienza con la fabricación de lisados celulares solubles a partir de células de interés. El lisado contiene ARN, subunidades ribosómicas y polisomas, así como otros componentes celulares solubles. Se realiza un gradiente de sacarosa lineal continuo dentro de un tubo de ultracentrífuga. La fracción soluble del lisado celular se carga suavemente en la parte superior del tubo de gradiente de sacarosa. El tubo de gradiente cargado se somete a centrifugación, que separa los componentes celulares por tamaño dentro del gradiente de sacarosa por la fuerza de la gravedad. Los componentes más grandes viajan más lejos en el gradiente que los componentes más pequeños. La parte superior del gradiente alberga los componentes celulares más pequeños y lentos, mientras que los componentes celulares más grandes y de viaje más rápido se encuentran en la parte inferior. Después de la centrifugación, el contenido del tubo se recoge como fracciones. Este método separa eficazmente las subunidades ribosómicas, monosomas y polisomas. La densidad óptica de cada fracción se determina midiendo la absorbancia espectral a una longitud de onda de 254 nm. Trazar absorbancia vs. número de fracción produce un perfil de polisoma.
Los gradientes lineales de densidad de sacarosa se pueden generar utilizando un fabricante de gradiente. Después de la centrifugación, los gradientes a menudo se fraccionan y las absorbancias se miden utilizando un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad 3,7,13,24,25. Si bien estos sistemas funcionan muy bien para producir perfiles polisomónicos, son costosos y pueden ser prohibitivos para algunos laboratorios. Aquí se presenta un protocolo para generar perfiles polisómicos sin el uso de estos instrumentos. En cambio, este protocolo utiliza equipos típicamente disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular.

<table><tbody><tr><td>Fraccionador automático</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar Lector de placas multimodo</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio, lavadas con ácido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425&ndash; 600 &mu; m</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio, 1 m</td> Aguja <td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>, 22 g, cubo de metal</td><td>Hamilton Company</td><td>7748-08</td><td>longitud personalizada 9 pulgadas, estilo de punta 3</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima XL-100K Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Estante de clavijas para tubo de ensayo de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Kit de ensayo HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Paquete de rotor de cubeta oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>jeringa, 3 mL</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 m,&nbsp; pH 7.4</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca UV-Star, 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>655801</tr></tbody></table>

perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es una herramienta poderosa que se puede utilizar para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos que son traducidos por ribosomas y analizar factores asociados a polisomas. Si bien los fabricantes automatizados de gradientes y los sistemas de fraccionamiento de gradiente se usan comúnmente con esta técnica, estos sistemas son generalmente costosos y pueden ser prohibitivos para los laboratorios que tienen recursos limitados o no pueden justificar el gasto debido a su necesidad poco frecuente u ocasional de realizar este método para su investigación. Aquí, se presenta un protocolo para generar de forma reproducible perfiles polisomáticos utilizando equipos estándar disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular sin instrumentos especializados de fraccionamiento. Además, se proporciona una comparación de perfiles de polisomas generados con y sin un sistema de fraccionamiento de gradiente. Se discuten estrategias para optimizar y producir perfiles polisómicos reproducibles. Saccharomyces cerevisiae se utiliza como organismo modelo en este protocolo. Sin embargo, este protocolo se puede modificar y adaptar fácilmente para generar perfiles de ribosomas para muchos organismos y tipos de células diferentes.

En la Figura 3 se muestran tres perfiles polisómicos representativos. Todos los perfiles son de la misma cepa de levadura. Un perfil polisomático típico tendrá picos bien resueltos para las subunidades ribosómicas 40S, 60S y 80S, así como para los polisomas. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma será evidente en cada perfil (Figura 3). En la Figura 3A se muestra un perfil representativo de un sistema automatizad...

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Este protocolo describe cómo generar un perfil polisomático que revela detalles moleculares sobre la actividad de los ribosomas dentro de la célula. Esta técnica permite a los usuarios obtener la valiosa información proporcionada por un perfil polisómico, que no tiene acceso a sistemas automatizados de fraccionamiento de gradiente. Tómese su tiempo mientras prepara los gradientes y guárdelos en un lugar donde no se vean interrumpidos por un compresor u otras operaciones mecánicas a medida que se asientan en un gradiente lineal.Para comenzar, prepare soluciones madre de sacarosa al 7 y 47% en tampón de gradiente de sacarosa. Filtro esterilizar las soluciones madre de sacarosa a través de un filtro de 0,22 micras. Prepare 14 mililitros de soluciones de sacarosa al 17, 27 y 37% dispensando y mezclando las soluciones de 7 y 47% de existencias.Coloque seis tubos centrífugos de polipropileno en un bastidor de tubos de ensayo de vista completa. Asegúrese de que haya suficiente espacio entre los tubos para que las acciones con un tubo no perturben a los demás. Conecte una aguja de nueve pulgadas y calibre 22 con una punta roma a una jeringa de tres mililitros, y realice un llenado y dispensación de prueba para asegurarse de que la jeringa pueda contener la solución de sacarosa sin gotear antes de configurar los gradientes.Agregue dos mililitros de sacarosa al 7% al fondo de cada tubo de centrífuga. Luego, agregue dos mililitros de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7%, colocando la punta de la aguja dentro de las inmediaciones del fondo del tubo. Dispense la solución con cuidado y lentamente.Repita el procedimiento con dos mililitros cada uno de la solución de sacarosa al 27, 37 y 47%, asegurándose de que cada capa se distinga de la otra por una línea que marque la separación de densidades. Almacene los gradientes a cuatro grados centígrados durante la noche para permitir que se asienten en un porcentaje continuo y creciente de sacarosa. Después del crecimiento y la cosecha de levadura, las células de Saccharomyces cerevisiae, resuspenden las células en 700 microlitros refrigerados de tampón de extracción de polisomas.Añadir 100 unidades de inhibidor de la ARNsa. Luego, agregue 400 microlitros de perlas de vidrio preenfriadas con un tamaño aproximado de 425 a 600 micras. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con las perlas de vidrio e interrumpa las células de levadura mediante una agitación vigorosa en un batidor de cuentas durante cinco minutos.Después de interrumpir las células, aclarar el lisado por centrifugación. Determine la concentración del ARN en el lisado clarificado midiendo la absorbancia a 260 nanómetros, utilizando un sistema de detección de ARN basado en fluorescencia. Asegúrese de que la concentración de ARN sea de 0,5 a un microgramo por microlitro.Si la concentración de ARN es demasiado baja, reduzca el volumen de tampón de extracción utilizado para resuspender las células. Cargue cuidadosamente el lisado en la parte superior de los degradados. Coloque la punta de la pipeta contra la pared interior en la parte superior del tubo de polipropileno.Incline el tubo y dispense lentamente el lisado en la parte superior del degradado, goteando contra la pared. Coloque suavemente los tubos en los cubos preenfriados de un rotor de cangilón oscilante y centrifugar los gradientes. Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos de centrífuga del rotor del cucharón oscilante y colóquelos en un soporte de tubos.Etiquete las placas de 96 pocillos para almacenar las fracciones y preenfriarlas en hielo. Recoja fracciones de 100 o 200 microlitros a partir de la parte superior del degradado, insertando cuidadosamente una punta de pipeta en la parte superior del degradado y recogiendo las fracciones hasta que todo el gradiente sea alícuoto. Mida la absorbancia de cada fracción a 254 nanómetros con un espectrofotómetro contra las soluciones de sacarosa al 7 y 47% como espacios en blanco.Cree el perfil del polisoma trazando el número de fracción frente a la absorbancia. Se muestran tres perfiles de polisomas representativos de la levadura S.Cerevisiae. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma es evidente en cada perfil.Aquí se muestra un perfil representativo de un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad. Este perfil se produjo a partir de un perfil de absorbancia continua ya que el gradiente de sacarosa fue desplazado de abajo hacia arriba por una solución de persecución, a través de una celda de flujo detector y recogido en fracciones. Aquí se muestra el perfil polisomal generado por fraccionamiento manual de muestras de 200 y 100 microlitros.Lo más importante que debe recordar con este procedimiento es no interrumpir los gradientes. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire o interrumpir el gradiente al dispensar la solución demasiado rápido. Después de este procedimiento, se puede extraer ARN de los gradientes para su posterior análisis para determinar los ARNm que se asocian con ribosomas activos.

polysome-profiling-without-gradient-makers-or-fractionation-systems

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

El protocolo presentado aquí implica el perfil polisomal para aislar translatoma, ARNm asociados con ribosomas, en ARN polisomales y no polisomales de Arabidopsis a través de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Este método demuestra la eficiencia de traslación de Arabidopsis sometida a estrés térmico.

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Aprende a generar perfiles de polisomas sin sistemas automatizados de fraccionamiento. Este método manual permite analizar la actividad ribosomal en células de Saccharomyces cerevisiae mediante gradientes de sacarosa preparados paso a paso.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Explorar más videos