Migración nuclear en el ovocito Drosophila
13 de mayo de 2021
En Drosophila,el núcleo de ovocitos sufre una migración dependiente de microtúbulos durante la oogénesis. Aquí, describimos un protocolo que se desarrolló para seguir la migración mediante la realización de imágenes en vivo en cámaras de óvulos ex-vivo. Nuestro procedimiento mantiene vivas las cámaras de huevos durante 12 h para adquirir películas de lapso de tiempo 3D multi posición utilizando microscopía confocal de disco giratorio.
Esta técnica permite observar largos procesos biológicos en cámaras de óvulos de Drosophila diseccionadas, como la migración nuclear de ovocitos, utilizando microscopía de imágenes en vivo. Este protocolo describe cómo mantener vivas las cámaras de óvulos disecadas durante 12 horas para realizar microscopía de imágenes en vivo. Para empezar, pipetea 200 microlitros de Schneider Medium y complementa con 30 microlitros de 10 miligramos por mililitro de insulina, luego agrega cuatro microlitros de suero de ternero fetal inactivado por calor.
Use una punta de pipeta para aplicar una pequeña cantidad de grasa de silicona alrededor del orificio en la parte inferior de la diapositiva perforada. Coloque un coverslip y use el extremo ancho de la punta de una pipeta para aplicar presión sobre el coverslip para aplanar la grasa de silicona para crear un anillo de silicona en el interior de la diapositiva. Transfiera las moscas hembra anestesiadas al pozo de disección que contiene 150 microlitros del medio de imagen.
Para diseccionar a la hembra, use las pinzas para agarrar el tórax y pellizcar la cutícula dorsal del abdomen con un segundo par de fórceps. Retire cuidadosamente el útero, el oviducto y la hera muscular. Aísle y separe el par de ovarios visibles en la abertura de la cutícula.
Coloque una gota de 10 a 15 microlitros del medio de imágenes en los ovarios y transfiera un ovario a la cámara de imágenes. Para separar los ovarioles, use la aguja para sostener el extremo posterior del ovario. Use otra aguja para tirar cuidadosamente del germario para separar los ovarioles.
Sostenga la hela con una aguja y tire del ovariole a través de las cámaras más grandes con otra aguja para eliminar la hela muscular restante en las cámaras de huevos. Permita que el ovariole desenvainado se hunda y entre en contacto con la cubierta. Retire las últimas etapas y el resto de los ovarios de la microcámara con pórceps.
Use agujas para distanciar cuidadosamente los ovarioles para facilitar la adquisición. Cortar un pequeño cuadrado de 10 por 10 milímetros de la membrana permeable. Aplique cuidadosamente la membrana en la parte superior del medio de imagen para expulsar cualquier burbuja de aire.
Luego selle herméticamente la cámara con una capa delgada de aceite de halocarbono alrededor del pozo en el contorno de la membrana. Coloque la configuración de imágenes en el soporte deslizante del microscopio invertido y use un objetivo 40X. La migración del núcleo de ovocitos de una cámara de óvulos de tipo silvestre se capturó mediante microscopía de imágenes en vivo.
El núcleo alcanza la membrana plasmática anterior o la membrana plasmática lateral antes de deslizarse a lo largo de las trayectorias para alcanzar su posición final en la intersección de las dos membranas plasmáticas. Las deformidades de la membrana, las células foliculares desorganizadas, las células atrofiadas y los núcleos encogidos son los primeros signos de cámaras de óvulos moribundas. El ovocito degenerado antes de las ocho horas de la imagen generalmente no se detecta.
Sin embargo, los casos raros de degeneración temprana se deben a problemas durante la disección o los pasos de montaje. Dañar las cámaras de huevos compromete su supervivencia. Por lo tanto, la delicada disección precisa a mano y la preparación de la microcámara son primordiales.
Este procedimiento nos permitió visualizar que el núcleo del ovocito puede tomar tres trayectorias diferentes durante su migración y diferentes orgánulos regulan estas trayectorias dentro del ovocito.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para observar la migración nuclear de los ovocitos en Drosophila mediante microscopía de imagen en vivo. La técnica permite mantener cámaras ováricas disecadas durante 12 horas, lo que posibilita la obtención de películas tridimensionales de lapsos de tiempo en múltiples posiciones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Drosophila sirve como organismo modelo para estudiar la ovogénesis.
- La migración dependiente de microtúbulos es crucial para el desarrollo del ovocito.
- Las técnicas de imagen en vivo mejoran la comprensión de los procesos celulares dinámicos.
- Mantener la viabilidad de las cámaras ováricas es esencial para la imagenología a largo plazo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la obtención de imágenes en vivo de la migración nuclear del ovocito.
- Mantener cámaras ováricas vivas durante períodos prolongados durante la observación.
- Utilizar microscopía confocal de disco giratorio para obtener imágenes detalladas.
Métodos Utilizados
- Preparación del medio de Schneider suplementado con insulina y suero de feto bovino.
- Aplicación de grasa de silicona para crear un entorno de imagen estable.
- Diseción de moscas hembra para obtener cámaras ováricas destinadas a la obtención de imágenes.
- Uso de microscopía confocal de disco giratorio para capturar películas de lapso de tiempo.
Resultados principales
- Mantenimiento exitoso de las cámaras ováricas durante 12 horas durante la adquisición de imágenes.
- Visualización clara de los procesos de migración nuclear del ovocito.
- Demuestra la eficacia de las técnicas de imagen en vivo.
- Contribución al entendimiento de la biología del desarrollo en Drosophila.
Conclusiones
- El protocolo permite la observación detallada de la dinámica de los ovocitos.
- La imagen en vivo proporciona información sobre los mecanismos de migración celular.
- Este método puede aplicarse a otros procesos biológicos en Drosophila.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la dinámica de la migración nuclear en sistemas modelo como los ovocitos de Drosophila proporciona conocimientos fundamentales sobre la regulación del citoesqueleto y los mecanismos de transporte intracelular, relevantes para la validación de dianas en ensayos basados en células. La imagenología en vivo del movimiento tridimensional de orgánulos permite reducir el riesgo mecanicista de hipótesis que involucran proteínas motoras, la estabilidad de los microtúbulos o el establecimiento de la polaridad, aspectos clave en la fase inicial del descubrimiento donde la selección fenotípica depende de lecturas a nivel subcelular. Este enfoque respalda la confianza predictiva al vincular perturbaciones moleculares con comportamientos celulares observables y cuantificables en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con reguladores del citoesqueleto y proteínas de posicionamiento nuclear mediante la visualización directa de trayectorias de migración.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de dianas al correlacionar perturbaciones genéticas o farmacológicas con alteraciones en los patrones de movimiento nuclear en 3D.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Facilita la estandarización de ensayos al proporcionar lecturas cuantitativas y resueltas temporalmente de la posición nuclear y la cinética de migración en un entorno de imagen controlado y a largo plazo.
- Valor operativo: Mejora la preparación para cribados mediante la preparación reproducible de cámaras y la viabilidad estable de las cámaras ováricas de Drosophila durante hasta 12 horas, lo que permite comparaciones entre múltiples condiciones.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Ofrece un sistema relevante para la enfermedad que permite estudiar defectos de polaridad asociados a trastornos del desarrollo, apoyando la exploración de biomarcadores traslacionales mediante la correlación entre el mal posicionamiento nuclear y los resultados fenotípicos.
- Valor operativo: Favorece la continuidad traslacional al permitir que los hallazgos de la fase de descubrimiento se validen en un modelo genéticamente manejable y compatible con imágenes en vivo antes de su traslación a sistemas mamíferos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre el blanco hasta la optimización del ensayo y la validación preclínica, especialmente cuando la dinámica nuclear o la función del citoesqueleto son fundamentales para el mecanismo de acción.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo biológico mediante la visualización en tiempo real de cómo los silenciamientos génicos específicos o los tratamientos con compuestos alteran la migración nuclear.
- Tamizaje: Permite la preparación del ensayo mediante un montaje estandarizado de cámaras y el seguimiento cuantitativo en 3D de la posición nuclear como lectura funcional de los efectos de los compuestos.
- Análisis: Genera resultados cuantificables como la velocidad de migración, la elección de trayectoria y la posición final del núcleo, que pueden compararse estadísticamente entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al establecer una relación causal entre los defectos en la posición nuclear y los fenotipos del desarrollo, aportando información para decisiones de avance con ajuste de riesgo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagen reutilizable para estudiar el transporte intracelular, la posición de orgánulos o el establecimiento de la polaridad en múltiples proyectos de biología del desarrollo y celular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los mecanismos diana al reducir la ambigüedad sobre cómo las intervenciones moleculares afectan la organización y dinámica subcelular.
- Valor operativo: Proporciona estandarización y reproducibilidad mediante un protocolo validado de preparación de cámaras que mantiene la viabilidad del tejido durante imágenes en vivo prolongadas.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al ofrecer anclajes fenotípicos observables tempranamente para dianas implicadas en la regulación del citoesqueleto o en el transporte intracelular.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basándose en su impacto demostrado sobre la migración nuclear, un proceso vinculado al destino celular y a la integridad del desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de Drosophila, microscopía de imagen en vivo y preparación de muestras fluorescentes.
- Depende del acceso a un sistema confocal de disco giratorio o sistemas equivalentes de imagen 3D a largo plazo con control ambiental.
- Necesita la estandarización del sellado de la cámara y de la composición del medio entre diferentes equipos para garantizar la supervivencia constante de las cámaras ováricas.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el sistema de cámaras a otros tipos de tejidos o etapas del desarrollo distintas de la oogénesis media.
- Está limitado por la relevancia fisiológica de Drosophila en relación con las enfermedades humanas, lo que requiere validación ortogonal en sistemas mamíferos para objetivos traslacionales.
