Name: Migración nuclear en el ovocito Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Aprenda a observar la migración nuclear del ovocito en Drosophila mediante microscopía de imagen en vivo. Este protocolo mantiene cámaras de huevo disecadas viables durante 12 horas para capturar películas 3D de lapso de tiempo.

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Estamos extremadamente agradecidos a Jean-Antoine Lepesant y Nicolas Tissot que originalmente desarrollaron el protocolo y compartieron algunos elementos gráficos de la Figura 3 con nosotros. Agradecemos a Fanny Roland-Gosselin que tomó las fotos de la Figura 4. También agradecemos a otros miembros del laboratorio por las útiles discusiones que contribuyeron a la mejora de esta técnica y a Nathaniel Henneman por sus comentarios que ayudaron a mejorar este manuscrito. Reconocemos la instalación central de ImagoSeine del Instituto Jacques Monod, miembro de France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh cuenta con el apoyo de una beca de doctorado del Ministerio de Investigación de Francia (MESRI). Antoine Guichet y Fred Bernard fueron apoyados por la ARC (Grant PJA20181208148), la Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) y por una beca Emergence de IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).

1. Preparación del medio de imagen
<ol><li>Prepare medios frescos el día de su uso. Pipeta 200 μL de medio Schneider (que contiene L-glutamina y 0,40 g/L de NaHCO3 complementada con suero de ternero fetal inactivado al 10% por calor, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina).</li>
	<li>Suplemento con 30 μL de insulina 10 mg/ml.</li>
	<li>Añadir 4 μL de suero fetal de ternero inactivado por calor.</li>
</ol>2. Preparación de la cámara de observación
<ol><li>Con una punta de pipeta, aplique una pequeña cantidad de grasa de silicona alrededor del orificio en la parte inferior de la diapositiva perforada(Figura 4D).</li>
	<li>Coloque un capa de cubierta de 24 x 50 mm de espesor de 0,13-0,16 mm.</li>
	<li>Con el extremo ancho de una punta de pipeta, aplique presión sobre el cubrebocas para aplanar la silicona con el fin de sellar el lape y crear un anillo de silicona interior a la diapositiva(Figura 4F,G).</li>
</ol>3. Disección ováica
<ol><li>Anestesiar una mosca hembra del fenotipo deseado en una almohadilla de CO2.</li>
	<li>Transferir la hembra en 150 μL del medio de imagen en un pozo de disección (Figura 4H).</li>
	<li>Abra una hembra agarrando su tórax con fórceps y pellizcando la cutícula dorsal del abdomen con un segundo par de fórceps.</li>
	<li>Aísle y separe el par de ovarios, que deben ser fácilmente visibles al abrir la cutícula.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el útero, el oviducto y la hera muscular(Figura 4I).</li>
	<li>Coloque una gota de 10-15 μL del medio de imagen y transfiera un ovario en la cámara de imagen (Figura 4J,K).</li>
</ol>4. Aislamiento de la cámara de huevos
<ol><li>Para separar los ovarioles, sostenga el extremo posterior del ovario (hacia las etapas más antiguas) con la aguja. Separe los ovarioles tirando cuidadosamente del germario con otra aguja.</li>
	<li>Retire la hela muscular restante en las cámaras de huevos; una aguja que sostiene la hela y la otra tira del ovario a través de las cámaras más grandes (etapa 9 o anterior).</li>
	<li>Permita que el ovariole desenvainado se hunda y entre en contacto con la cubierta.</li>
	<li>Retire las etapas tardías y el resto de los ovarios de la microcámara con la ayuda de pórceps. Distancia cuidadosamente los ovarioles de los demás con agujas para facilitar la adquisición (Figura 4L).</li>
</ol>5. Cierre de la cámara de observación
<ol><li>Cortar un pequeño cuadrado (10 x 10 mm) de membrana permeable (Figura 4M,N).</li>
	<li>Aplique cuidadosamente la membrana en la parte superior del medio de imagen para expulsar cualquier burbuja de aire (Figura 4O).</li>
	<li>Sellar herméticamente la cámara con una fina capa de aceite de halocarbono alrededor del pozo en el contorno de la membrana (Figura 4P,Q).</li>
</ol>6. Imágenes
<ol><li>Coloque la configuración de imágenes en el soporte deslizante del microscopio invertido utilizando un objetivo 40x (HCX PL Apo, 1.25NA, inmersión en aceite).</li>
	<li>Localice y guarde posiciones de diferentes ovocitos en estadio 6 en los que el núcleo está listo para migrar.</li>
	<li>Configure los láseres de 488 y 561 nm. Con una potencia láser de salida medida de 150 mW, utilice el 30% de la potencia del láser y la exposición de 300 ms y 500 ms, respectivamente.</li>
	<li>Configura el experimento. Tome un lapso de tiempo de 12 h con el intervalo de 15 min-41 secciones con un intervalo de 1 μm centrado en el núcleo. NOTA: De acuerdo con el tiempo de exposición descrito anteriormente, este ajuste permite la adquisición de una posición en alrededor de 45 s. Dado que hay un retraso debido al cambio de posición, se recomienda establecer un máximo de 12 posiciones en estas condiciones.</li>
</ol>7. Análisis de imágenes
<ol><li>Procese las películas en el software Fiji, utilizando la vista ortogonal del plug-in y realice un seguimiento manual de los núcleos.</li>
</ol><img alt="Secuencia de la técnica de microinyección para el análisis de embriones de Drosophila bajo un microscopio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Imágenes de montaje paso a paso de microcámaras. (A,B,C) Preparación de las herramientas necesarias: placa de pozo de disección, torceps, agujas, medios de imagen, grasa de silicio, membrana permeable y el portaobjetos de aluminio. (D) Aplicación de la grasa de silicio en la parte posterior de la corredera de aluminio con una punta de pipeta. (E) Una cubierta de vidrio se pega en la grasa de silicio para crear la parte inferior de la cámara. (F,G) Aplicación de presión en la cubierta con la extremidad más ancha de la punta de una pipeta para crear una articulación dentro de la cámara. (H,I) Disección de los ovarios de la mosca en los medios de imagen. (J) Pipeteo de una gota de medios de imagen en la microcámara. (K,L) Separación de los ovarioles en la microcámara mediante agujas. (M,N,O) Membrana permeable cortada en un cuadrado de 10 x 10 mm y colocándola sobre la gota del medio en la microcámara. (P,Q) Sellado de la microcámara con aceite de halocarbono. Las muestras están listas para ser fotografiada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol><li>Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li>
<li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891(2009).</li>
<li>Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+and+round+gets+you+somewhere%3A+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li>
<li>Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+%27+n+Villa%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li>
<li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li>
<li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).</li>
<li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Oogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Otros protocolos describen cómo preparar y cultivar cámaras de huevos de Drosophila ex vivo para el ensayo de imágenes en vivo12,13. La novedad de este protocolo es el uso de una cámara de imagen construida con una corredera de aluminio ahuecado, un coverslip y una membrana permeable A O2/ CO2. La principal ventaja de esta configuración es limitar el movimiento en Z sin ejercer presión sobre la muestra. Por lo tanto, el ovocito aún ...

Durante varios años, el ovocito Drosophila ha surgido como un sistema modelo para estudiar la migración nuclear. El ovocito Drosophila se desarrolla en una estructura multicelular llamada cámara de óvulos. Las cámaras de óvulos abarcan 16 células germinales (15 células nodriza y el ovocito) rodeadas por una capa epitelial de células somáticas foliculares. El desarrollo de la cámara de óvulos se ha subdividido en 14 etapas(Figura 1A),durante las cuales el ovocito crecerá y acumulará las reservas necesarias para el desarrollo temprano del embrión. Durante el desarrollo, tras la reorganización de los microtúbulos y el transporte asimétrico de los determinantes maternos, el ovocito se polariza a lo largo de los ejes antero-dorsal y dorso-ventral. Estos ejes determinan los ejes de polaridad posteriores del embrión y del adulto derivados de la fecundación de este ovocito1. Durante la oogénesis, el núcleo adopta una posición asimétrica en el ovocito. En la etapa 6, el núcleo está centrado en la célula. Tras una señal aún no identificada emitida por las células foliculares posteriores que es recibida por el ovocito, el núcleo migra hacia la intersección entre las membranas plasmáticas anterior y lateral en la etapa 7(Figura 1B)2,3. Esta posición asimétrica es necesaria para inducir la determinación del eje dorso-ventral.
<img alt="Microscopía de fluorescencia de la cámara de huevos de Drosophila, que muestra los estadios de los ovocitos y los núcleos de las células nodrizas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Cámaras de huevo de Drosophila melanogaster. (A) Ovariole fijo de moscas transgénicas que expresan Fs(2)Ket-GFP que etiqueta las envolturas nucleares y ubi-PH-RFP que marca las membranas plasmáticas. El ovariole se compone de cámaras de huevo en desarrollo en diferentes etapas. La maduración aumenta a lo largo del eje antero-posterior con el germario en la punta anterior (izquierda) donde reside la célula madre germinal y la etapa más antigua en la punta posterior (derecha). (B) Proyección Z de la cámara de huevo vivo mediante microscopía confocal de disco giratorio en la etapa 6 de la oogénesis (izquierda), en la que el núcleo se centra en el ovocito. El núcleo migrará para adoptar una posición asimétrica en la etapa 7 (derecha) en contacto con la membrana plasmática anterior (entre el ovocito y la célula nodriza) y la membrana plasmática lateral (entre el ovocito y las células foliculares). Esta posición inducirá la determinación del lado dorsal y, por lo tanto, del eje dorso-ventral de la cámara de huevos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Durante muchas décadas, esta migración nuclear se ha estudiado en tejidos fijos mediante inmunotinción. Este enfoque ha hecho notablemente posible demostrar que este proceso depende de una densa red de microtúbulos4,5. Más recientemente, desarrollamos un protocolo que ofrece condiciones compatibles con la obtención de imágenes en vivo del ovocito durante varias horas, lo que permite estudiar este proceso dinámicamente6.
De ahí que, por primera vez, hayamos podido describir que el núcleo tiene trayectorias preferentes y características durante su migración, una a lo largo de la membrana plasmática anterior (APM) y otra a lo largo de la membrana plasmática lateral (LPM) del ovocito(Figura 2). Estos últimos resultados subrayan la importancia de los protocolos de imágenes en vivo cuando se estudian procesos dinámicos como la migración nuclear.
<img alt="&lt;span&gt;Diagrama de ovogénesis: ovocito, células nodrizas, células foliculares; dirección del eje y diferenciación celular.&lt;/span&gt;" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Representación esquemática de las diferentes rutas de migración del núcleo. En la etapa 6 de la oogénesis, el ovocito es una célula grande con un núcleo central. En esta etapa, el eje de polaridad antero-posterior se establece con una membrana plasmática posterior/lateral del ovocito en contacto con las células foliculares y la membrana plasmática anterior (en amarillo) está en contacto con las células nodriza2. Hemos informado previamente que el núcleo podría migrar a lo largo de la membrana plasmática anterior (APM), a lo largo de la membrana plasmática lateral (LPM), o a través del citoplasma (STAD, directamente a la corteza antero-dorsal)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La migración del núcleo de ovocitos es un fenómeno de aproximadamente 3 h6, y hasta ahora, se desconoce el evento que desencadena el inicio de la migración real. El inicio de la migración también puede ser retrasado por los mutantes de proteínas utilizados para estudiar este mecanismo. Estas variables desconocidas nos motivaron a adquirir imágenes durante largos períodos de tiempo (10-12 h). Por lo tanto, es importante asegurarse de que los ovocitos permanezcan vivos. A medida que la cámara de huevos se desarrolla, se alarga a lo largo del eje antero-posterior de una forma esférica a una elíptica. Este alargamiento es impulsado por la rotación de las células foliculares, que ocurre desde la etapa 1 hasta la etapa 8, perpendicular al eje antero-posterior7. Además, una hela tubular de músculo con propiedad pulsátil rodea las cámaras de huevos. Su función fisiológica es empujar los folículos en desarrollo hacia el oviducto continuamente8. Con el fin de limitar los movimientos que inducen oscilaciones de las cámaras de huevos después de su disección, diseñamos una microcámara de observación que mide 150 μm de altura(Figura 3A). Esta altura es marginalmente más alta que el tamaño de un folículo en las etapas 10 y 11. Limita considerablemente los movimientos verticales de la muestra al tiempo que preserva la rotación de la cámara de óvulos, lo que resulta en defectos limitados en el desarrollo del folículo. Luego realizamos imágenes en vivo durante 12 h en cámaras de huevos diseccionadas mediante adquisiciones de lapso de tiempo de múltiples posiciones utilizando un microscopio confocal de disco giratorio. Aquí describimos nuestro protocolo para estudiar la migración nuclear de ovocitos entre las etapas 6 y 7.
<img alt="Diagrama de cámara microfluídica; dimensiones, detalles de montaje y uso de grasa de silicona para observación biológica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Representación esquemática de la cámara de observación. (A) (Vista superior) Dimensiones precisas de la corredera de aluminio con las alturas (A') y circunferencias (A'') del pozo perforado en el centro de la diapositiva. (B) (Vista inferior) Un codal que bloquea el pozo se sella a la corredera con grasa de silicio. (C) (Vista superior) Los ovarioles disecados se desarrollan en un medio de imagen que está cubierto por una membrana permeable al gas. El aceite de halocarbono se utiliza para estabilizar la membrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para seguir la migración nuclear y evaluar con precisión las trayectorias en el ovocito, se necesitan marcadores tanto para la envoltura nuclear como para la membrana plasmática. Con este objetivo, se han seleccionado dos transgenes que tienen una alta relación señal/ruido y no se desvanecen en el transcurso de las imágenes en vivo. Para etiquetar la membrana plasmática, se recomienda el uso de una P[ubi-PH-RFP] que codifique el dominio de Homología de Pleckstrin (PH) de la Fosfolipasa C Humana ∂1 (PLC∂1) fusionada a RFP. Este dominio PH se une al fosfoinosítido PI(4,5)P2 distribuido a lo largo de la membrana plasmática del ovocito9. Para la envoltura nuclear, la cepa trampa de proteína P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP donde GFP se inserta dentro del gen que codifica la ß-importina de Drosophila muestra una señal homogénea e intensa10. Las moscas jóvenes (1-2 días de edad) se colocan en viales frescos que contienen levadura seca 24-48 h antes de la disección del ovario.
Para este ensayo de imágenes en vivo, se ha cortado una pieza de aluminio de 1 mm de espesor, que no es reactiva para la muestra, en las dimensiones de una diapositiva de microscopía. Tiene un orificio de 16 mm de diámetro en el centro de la corredera que ha sido contraborrado a 0,85 mm. Este contrabordo tiene un orificio adicional de 6 mm de diámetro con una profundidad de 150 μm (Figura 3A). Un coverslip se pega con grasa de silicona (inerte para la muestra) en la parte inferior de la cámara de aluminio(Figura 3B). Después de colocar las muestras en el pozo lleno de medio, se coloca una membrana permeable al intercambio de O2/ CO2 sobre el medio y rodeada de aceite de halocarbono(Figura 3C).
Para la disección, se recomienda utilizar fórceps de acero inoxidable con una dimensión de punta de 0.05 x 0.02 mm, y agujas de 0.20 mm de diámetro para la separación de los ovarioles(Figura 4B,C). Los núcleos migratorios se capturan en un microscopio invertido confocal de disco giratorio CSU-X1 equipado con una cámara. Las imágenes multi-posición fueron adquiridas por time-lapse cada 15 min a 24 °C. Un intervalo de 15 minutos permite realizar adquisiciones multi-posición con fotobleaching limitado de las proteínas fluorescentes y fototoxicidad para las muestras. Además, un intervalo más corto no proporcionaría datos mucho más informativos para seguir las trayectorias nucleares. Las películas se procesan y analizan a través del software Fiji11.

<table><tbody><tr><td>Almohadilla de CO2 Anesthetize</td><td>Dutscher</td><td>789060</td><td>Anesthetize Flyes</td></tr><tr><td>Coverslip (24x50 mm)</td><td>Knittel Glass</td><td></td><td>VD12450Y100A Preparación de la cámara de observación</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>Carl Roth</td><td>K342.1</td><td>Disección</td></tr><tr><td>Agujas de acero inoxidable</td><td>Entosphinx</td><td>20</td><td>Disección</td></tr><tr><td>Suero</td> <td>de pantorrilla fetal inactivado por calorSIGMA-ALDRICH</td><td>F7524</td><td>Medio de imagen</td></tr><tr><td>Solución de insulina páncreas bovino</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10516 - 5ml</td><td>Medio de imagen</td></tr><tr><td>Solución de penicilina/estreptomicina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P0781</td><td>Medio de imagen</td></tr><tr><td>Membrana permeable</td><td>Leica</td><td>11521746</td><td>Preparación de la cámara de observación</td></tr><tr><td>Schneider Medium</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-91500</td><td>Medio de imagen</td></tr><tr><td>Grasa de silicona</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>335148</td><td>Preparación de la cámara de observación</td></tr><tr><td>Disco giratorio confocal</td><td>Zeiss</td><td>CSU-X1 Observación de</td><td>la migración nuclear</td></tr><tr><td>Aceite Voltalef 10S</td><td>VWR</td><td>24627 - 188</td><td>Preparación de la cámara de observación</td></tr></tbody></table>

migración nuclear en el ovocito drosophila

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Las imágenes de células vivas son particularmente necesarias para comprender los mecanismos celulares y moleculares que regulan los movimientos de los orgánulos, los reordenamientos del citoesqueleto o el patrón de polaridad dentro de las células. Al estudiar el posicionamiento del núcleo de ovocitos, las técnicas de imágenes en vivo son esenciales para capturar los eventos dinámicos de este proceso. La cámara de huevos de Drosophila es una estructura multicelular y un excelente sistema modelo para estudiar este fenómeno debido a su gran tamaño y disponibilidad de numerosas herramientas genéticas. Durante la oogénesis media de Drosophila, el núcleo migra desde una posición central dentro del ovocito para adoptar una posición asimétrica mediada por fuerzas generadas por microtúbulos. Esta migración y posicionamiento del núcleo son necesarios para determinar los ejes de polaridad del embrión y la posterior mosca adulta. Una característica de esta migración es que ocurre en tres dimensiones (3D), creando una necesidad de imágenes en vivo. Así, para estudiar los mecanismos que regulan la migración nuclear, hemos desarrollado un protocolo para cultivar las cámaras de óvulos diseccionadas y realizar imágenes en vivo durante 12 h mediante adquisiciones time-lapse mediante microscopía confocal de disco giratorio. En general, nuestras condiciones nos permiten preservar las cámaras de huevos de Drosophila vivas durante un largo período de tiempo, lo que permite visualizar la finalización de la migración nuclear en una gran cantidad de muestras en 3D.

Antes de la migración, el núcleo es dinámico y oscila alrededor de una posición central durante un período definido como pre-migración. Estos pequeños movimientos reflejan un equilibrio de fuerzas de empuje y tracción que mantienen el equilibrio en el medio del ovocito. Al cuantificar las trayectorias de los núcleos, hemos demostrado que las trayectorias APM y LPM tenían proporciones similares. Definimos la naturaleza de la trayectoria por el primer contacto entre el núcleo y la membrana plasmática6</su...

En Drosophila,el núcleo de ovocitos sufre una migración dependiente de microtúbulos durante la oogénesis. Aquí, describimos un protocolo que se desarrolló para seguir la migración mediante la realización de imágenes en vivo en cámaras de óvulos ex-vivo. Nuestro procedimiento mantiene vivas las cámaras de huevos durante 12 h para adquirir películas de lapso de tiempo 3D multi posición utilizando microscopía confocal de disco giratorio.

Migración nuclear en el ovocito Drosophila

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Esta técnica permite observar largos procesos biológicos en cámaras de óvulos de Drosophila diseccionadas, como la migración nuclear de ovocitos, utilizando microscopía de imágenes en vivo. Este protocolo describe cómo mantener vivas las cámaras de óvulos disecadas durante 12 horas para realizar microscopía de imágenes en vivo. Para empezar, pipetea 200 microlitros de Schneider Medium y complementa con 30 microlitros de 10 miligramos por mililitro de insulina, luego agrega cuatro microlitros de suero de ternero fetal inactivado por calor.Use una punta de pipeta para aplicar una pequeña cantidad de grasa de silicona alrededor del orificio en la parte inferior de la diapositiva perforada. Coloque un coverslip y use el extremo ancho de la punta de una pipeta para aplicar presión sobre el coverslip para aplanar la grasa de silicona para crear un anillo de silicona en el interior de la diapositiva. Transfiera las moscas hembra anestesiadas al pozo de disección que contiene 150 microlitros del medio de imagen.Para diseccionar a la hembra, use las pinzas para agarrar el tórax y pellizcar la cutícula dorsal del abdomen con un segundo par de fórceps. Retire cuidadosamente el útero, el oviducto y la hera muscular. Aísle y separe el par de ovarios visibles en la abertura de la cutícula.Coloque una gota de 10 a 15 microlitros del medio de imágenes en los ovarios y transfiera un ovario a la cámara de imágenes. Para separar los ovarioles, use la aguja para sostener el extremo posterior del ovario. Use otra aguja para tirar cuidadosamente del germario para separar los ovarioles.Sostenga la hela con una aguja y tire del ovariole a través de las cámaras más grandes con otra aguja para eliminar la hela muscular restante en las cámaras de huevos. Permita que el ovariole desenvainado se hunda y entre en contacto con la cubierta. Retire las últimas etapas y el resto de los ovarios de la microcámara con pórceps.Use agujas para distanciar cuidadosamente los ovarioles para facilitar la adquisición. Cortar un pequeño cuadrado de 10 por 10 milímetros de la membrana permeable. Aplique cuidadosamente la membrana en la parte superior del medio de imagen para expulsar cualquier burbuja de aire.Luego selle herméticamente la cámara con una capa delgada de aceite de halocarbono alrededor del pozo en el contorno de la membrana. Coloque la configuración de imágenes en el soporte deslizante del microscopio invertido y use un objetivo 40X. La migración del núcleo de ovocitos de una cámara de óvulos de tipo silvestre se capturó mediante microscopía de imágenes en vivo.El núcleo alcanza la membrana plasmática anterior o la membrana plasmática lateral antes de deslizarse a lo largo de las trayectorias para alcanzar su posición final en la intersección de las dos membranas plasmáticas. Las deformidades de la membrana, las células foliculares desorganizadas, las células atrofiadas y los núcleos encogidos son los primeros signos de cámaras de óvulos moribundas. El ovocito degenerado antes de las ocho horas de la imagen generalmente no se detecta.Sin embargo, los casos raros de degeneración temprana se deben a problemas durante la disección o los pasos de montaje. Dañar las cámaras de huevos compromete su supervivencia. Por lo tanto, la delicada disección precisa a mano y la preparación de la microcámara son primordiales.Este procedimiento nos permitió visualizar que el núcleo del ovocito puede tomar tres trayectorias diferentes durante su migración y diferentes orgánulos regulan estas trayectorias dentro del ovocito.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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