Ensayo de liberación de mediadores humanizados como lectura para la potencia de los alérgenos

El ensayo representa una importante herramienta de investigación para simular las degranulaciones de basófilos inducidas por la reticulación de la IgE de los pacientes y los alérgenos. Por lo tanto, el ensayo se puede utilizar para imitar las reacciones alérgicas tipo 1. El ensayo es robusto, reproducible y personalizable.

Además, es altamente sensible, ya que se puede realizar con pequeñas cantidades de alérgenos recombinantes o purificados o incluso con extractos de alérgenos complejos. El método se utiliza para diagnosticar alergias, ya que analiza la reactividad de la IgE de los pacientes a los alérgenos. Además, este método es adecuado para analizar la reactividad cruzada y para monitorear la eficacia del tratamiento con AIT.

Comience cosechando células Ag8 del matraz de cultivo celular y transfiera las células a un tubo de centrifugación. Pellet por las células por centrifugación durante cinco minutos, a 250 veces g a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular a una concentración final de aproximadamente una vez 10 a la sexta célula, por mililitro en células RBL humanizadas.

Diluir los sueros humanos de uno a 10 en suspensión de células Ag8 para la dilución sérica final de uno a 20 en el ensayo, e incubar durante una hora a 37 grados Celsius y de cinco a 7% de dióxido de carbono. Cuando las células RBL humanizadas alcancen entre el 50 y el 90% de confluencia, aspire el medio desde un matraz de cultivo celular T-75 con cuidado sin tocar las células RBL humanizadas adheridas. Lave las células dos veces agregando 10 mililitros de DPBS al lado opuesto del matraz y no directamente sobre las células.

Aspire DPBS, agregue cinco mililitros de tripsina-EDTA precalentados una vez para el desprendimiento celular e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Golpee suavemente el matraz para separar las células. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrifugación de 15 milímetros y llene el tubo con un medio celular RBL humanizado o DPBS para diluir la tripsina-EDTA.

Centrifugar las células a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y resuspante el pellet en cinco mililitros de medio celular RBL humanizado para el recuento celular. Después de contar las células, diluya las células en medio celular RBL humanizado para obtener una concentración final de dos veces 10 a la sexta célula por mililitro.

Agregue 50 microlitros de suspensión de células RBL humanizadas, por pozo, equivalente a una vez 10 a la quinta célula por pozo en una placa estéril de 96 pozos. Centrifugar la suspensión sérica ag8 preincubada y transferir 50 microlitros de la suspensión sérica ag8 centrifugada a cada pozo que contenga células RBL humanizadas, sin perturbar el pellet de células Ag8. Use células sensibilizadas no estimuladas sin antígeno como ningún control de antígenos para la indicación de la meseta de la señal inferior o el fondo, y no sensibilice el fondo y los pozos de control de lisis máxima.

Cubra el plato con la tapa e incube durante la noche a 37 grados centígrados y de cinco a 7% de dióxido de carbono. Aspire los sueros que contienen el medio celular, invierta y golpee la placa sobre el papel absorbente para vaciar la placa para lavar las células RBL humanizadas. Lave las células tres veces agregando 200 microlitros de tampón de Tyrode por pozo, e incube durante aproximadamente 30 segundos por lavado durante los dos primeros lavados.

Después de agregar el tampón de Tyrode por tercera vez, aspire el tampón y deje la solución en los pozos hasta que esté lista para agregar la dilución del antígeno. Transfiera 100 microlitros de solución de antígeno a cada pozo que contenga las células RBL humanizadas presensibilizadas, pero no estimule la lisis máxima y las células de fondo no sensibilizadas con antígeno. Agregue 100 microlitros del tampón de Tyrode en los pozos de control de lisis máxima, pozos de control de fondo no sensibilizados y pozos no antígenos sensibilizados.

Incubar las células durante una hora a 37 grados centígrados y de cinco a 7% de dióxido de carbono. Tratar los pozos de control de lisis máxima con 10 microlitros de 10%Triton X-100 por pozo, y mezclar adecuadamente para lisiar las células completamente para una liberación del 100% de beta-hexosalinaidasa. Agregue 50 microlitros de solución de sustrato en una nueva placa de 96 pozos no vinculante.

Transfiera 50 microlitros de sobrenadante de los pozos de células RBL humanizadas que contienen la placa a la nueva placa que contiene la solución de sustrato e incube la placa durante una hora a 37 grados Celsius para permitir la conversión del sustrato fluorogénico. Agregue 100 microlitros de solución de parada por pozo y mida la fluorescencia como se describe en el manuscrito de texto. La curva en forma de campana obtenida en el ensayo de actividad de la beta-hexosaminidasa, que indica la ocupación monovalente de los epítopos de antígeno de la inmunoglobulina E debido al exceso de alérgeno, que inhibe la reticulación de la inmunoglobulina E alergénica a altas concentraciones de antígeno.

La concentración de antígenos necesaria para la liberación media máxima del mediador se calculó mediante el análisis de regresión lineal. El ensayo de viabilidad celular se realizó para excluir los efectos citotóxicos derivados del suero sensibilizante o del antígeno utilizado para la estimulación. Se utilizaron cinco sueros humanos diferentes para el ensayo de actividad de la beta-hexosaminadasa, y cuatro de cada cinco sueros derivados de los pacientes con alergia al polen de abedul respondieron a la estimulación de Bet v 1, lo que demuestra que Bet v 1 es un alérgeno potente responsable de los síntomas alérgicos mediados por la inmunoglobulina E.

Se evaluó la reactividad cruzada de la inmunoglobulina E a alérgenos homólogos. La respuesta a Bet v 1 se encontró en ambos pacientes, pero el paciente dos también respondió a Cor a 1. El alérgeno alimentario homólogo Bet v 1, que indica niveles más altos de Cor a 1 inmunoglobulina E de reactividad cruzada en el paciente dos.

Se evaluó la naturaleza hipoalergénica de las variantes mutantes de los alérgenos y se comparó con su contraparte de tipo salvaje. La curva de liberación de la variante Bet v 1 fold se desplazó hacia una mayor concentración de antígenos en comparación con el alérgeno de tipo salvaje, lo que resultó en una concentración significativamente mayor de antígeno para provocar la liberación media máxima, lo que hace que el mutante sea menos alérgico y, por lo tanto, un candidato para la inmunoterapia específica del alérgeno. No olvide dejar las soluciones de lavado en las células hasta aplicar la dilución del antígeno para evitar que las células se sequen, de lo contrario, esto resultaría en un mal rendimiento del ensayo.

El ensayo se puede utilizar para muchas aplicaciones diferentes, incluida la estandarización de productos alergénicos, en función de su actividad biológica, como soluciones de prueba de punción cutánea o extractos utilizados para inmunoterapia específica de alérgenos.