Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas
2 de octubre de 2021
La microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) se aplica para obtener imágenes y analizar espinas dendríticas en el hipocampo murino.
Cada neurona en el cerebro está conectada con otras células neuronales por aproximadamente 7.000 sinapsis. Excepto que esas sinapsis en el cerebro de los mamíferos se encuentran principalmente en las pequeñas protuberancias de la membrana llamadas espinas dendríticas. Plasticidad de las sinapsis y espinas dendríticas y similares, funciones cerebrales tan importantes como el aprendizaje y los procesos de memoria.
Es importante tener en cuenta que solo la microscopía electrónica da una idea completa de si una columna dendrítica tiene una entrada postsináptica. Hay disponibles varias técnicas de imágenes de espinas dendríticas. Sin embargo, la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie ofrece una posibilidad única de obtener imágenes de un gran volumen de tejido con una alta resolución.
La técnica de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie requiere un protocolo especial de preparación de muestras que implica un fuerte contraste con metales pesados. Mi fijación primaria durante la perfusión nos permitió usar los mismos cerebros para la microscopía electrónica aligerada. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con un fijador primario suave.
El cerebro se cortó en mitades y un hemisferio se fijó con un fijador dedicado a la inmunofluorescencia, crioprotector, se cortó en rodajas con un criostato y se procesó para estudios de inmunofluorescencia. Donde el otro hemisferio fue fijado con fijador de microscopía electrónica, cortado con el vibrátomo y preparado para estudios de microscopía electrónica. Las rebanadas cerebrales para los estudios de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie se contrastaron, se incrustaron de forma plana en resina, luego se montó una región CA1 del hipocampo en el pasador y se tomaron imágenes con el microscopio electrónico de barrido basado en bloques en serie.
La parte del protocolo resaltada en un cuadro amarillo se presentó en el video. Tome el tejido, que ha sido fijado y cortado en 100 rodajas microbióticas y lávelo con tampón de fosfato frío cinco veces durante tres minutos cada una. Prepare una mezcla uno a uno de tetróxido de osmio al 4% y ferrocianuro de potasio al 3%.
El producto final se volverá marrón. Sumergir las muestras en esta mezcla. Luego coloque las muestras en hielo.
Y a partir de esta etapa es importante protegerlos de la luz. Incubarlos con un suave agitación durante una hora. Mientras tanto, prepare la solución TCH.
Mezclar 10 mililitros de agua destilada doble y 0,1 gramos de TCH. Colóquelo en un horno a 60 grados centígrados durante una hora. Es importante dar la solución de vez en cuando.
Cuando esté listo, enfríelo a temperatura ambiente. Ahora lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una y luego sumérjalas en una solución TCH filtrada. Las rodajas se volverán negras.
Incubarlos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una e incube con tetróxido de osmio al 2% durante 30 minutos, esta vez a temperatura ambiente. Nuevamente, lave las muestras con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una y colóquelas en acetato de amilo filtrado al 1%.
Incubarlos a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, comience con la preparación de D-aspartato. Mezcle el nitrato de plomo con la solución de ácido aspártico precalentada a 60 grados centígrados.
Coloque la mezcla en un baño de agua a 60 grados centígrados y ajuste el pH a 5.5 con un hidróxido de sodio molar. Cierre el vial con aspartato de plomo y déjelo en 60 grados centígrados durante 30 minutos. La solución debe ser clara.
Si se vuelve turbio, debe descartarse y se debe preparar uno nuevo. Mientras tanto, lave las muestras con el gas doble agua destilada cinco veces durante tres minutos cada una y manténgalas en el horno a 60 grados centígrados durante 30 minutos. Sumergir las muestras en la solución de aspartato de plomo recién preparada e incubarlas en el horno a 60 grados centígrados durante 20 minutos.
Preparar resina epoxi. Pesar los ingredientes y mezclar bien la resina durante al menos 30 minutos antes de añadir el acelerador DMP 30. Preparar el virus con dilución graduada de etanol.
Luego saque las muestras del horno y lávelas nuevamente con agua destilada doble cinco veces durante tres minutos cada una. Mientras tanto, mezcle la resina con 100% de etanol en proporción uno a uno para obtener la resina del 50%. Mézclalo bien.
Después de esto, deshidrate las muestras en cada dilución de etanol durante cinco minutos. Recuerde que las muestras nunca deben secarse por completo. Infiltrar las muestras primero en 50% de resina durante 30 minutos, luego en 100% de resina durante una hora, y luego nuevamente en una resina fresca de 100% durante la noche.
Al día siguiente, coloque las muestras en resina fresca 100% durante una hora y luego insértelas entre las láminas de incrustación de fluoropolímeros. Prepare trozos de lámina de incrustación que hayan sido desgrasados con etanol y deje a un lado los portaobjetos de vidrio que se utilizarán como soporte. Coloque un trozo de lámina incrustante en un portaobjetos de vidrio, coloque una gota de resina sobre él, luego transfiera la muestra con cuidado con el uso de un palo de madera.
Cúbrelo con la segunda pieza. Trate de evitar las burbujas de aire. Sea suave ya que el tejido es muy frágil.
Coloque con cuidado otro portaobjetos de vidrio encima de la pieza de la hoja de incrustación y cure la muestra en el horno a 70 grados centígrados durante al menos 48 horas. Separe las capas y corte un trozo de la muestra incrustada con una cuchilla de afeitar. Transfiéralo a la parafina.
Esto minimizará el peligro de perder la muestra debido a la electrostática. Tome un pasador de aluminio que haya sido desengrasado con etanol. Mezcle bien un epoxi conductor y use una pequeña cantidad de él para montar la muestra en el pasador.
Cure el epoxi conductor a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Recorte cada lado del bloque de muestra con el cuchillo de diamante y luego pula la cara del bloque hasta que el tejido quede expuesto. Moele la muestra al pasador con pintura conductora y cújela.
Para minimizar la carga, las muestras también deben ser manchadas recubiertas con una fina capa de oro o paladio de oro. Coloque el pasador con la muestra en la cámara del microscopio electrónico de barrido basado en bloques en serie. Alinee la muestra con el cuchillo y luego cierre la cámara y establezca los parámetros.
Recopila una pila de imágenes. Utilizando el método descrito, se obtuvieron imágenes de tejido cerebral de ratón. Se tomó la imagen grande del hipocampo en una región y la imagen se colocó en el centro del estrato radiatum.
Se adquirió una pila de imágenes y se segmentaron los objetos de interés, como las espinas dendríticas y las sinapsis. Se obtuvo una morfología tisular de buena calidad con membranas y vesículas sinápticas claramente visibles y mitocondrias bien conservadas. Los estudios inmunofluorescentes de anticuerpos PSD 95 confirmaron que la fijación primaria leve y la fijación tradicional con 4% pfa dan resultados comparables.
El protocolo presentado permite la adquisición de imágenes de tejido cerebral con el uso de microscopía electrónica de barrido basada en bloques en serie, morfología tisular de alta calidad y 12 membranas visibles que facilitan la segmentación y reconstrucción correctas de 10. Mi fijación primaria hizo posible utilizar los mismos cerebros para el análisis de la inmunofluorescencia PSD 95 y la microscopía electrónica de imágenes de las espinas dendríticas. Aquí usamos PSE 9, 500 en ciernes.
Sin embargo, el otro también se puede usar.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio utiliza la microscopía electrónica de barrido de corte en bloque (SBEM) para obtener imágenes y analizar espinas dendríticas en el hipocampo de roedores, lo cual es fundamental para comprender la plasticidad sináptica relacionada con el aprendizaje y la memoria. La metodología permite la obtención de imágenes con alta resolución de grandes volúmenes de tejido, aportando información sobre la conectividad y los aspectos funcionales de las redes neuronales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Microscopía Electrónica
- Plasticidad Neuronal
Antecedentes
- Las espinas dendríticas son pequeñas protrusiones que albergan conexiones sinápticas.
- La plasticidad sináptica en las espinas dendríticas sustenta funciones cerebrales críticas.
- Las técnicas tradicionales de imagen podrían no proporcionar información integral sobre estas estructuras.
- El MEBE ofrece un enfoque único para visualizar las espinas dendríticas con alta resolución.
Objetivo del estudio
- Investigar las características estructurales de las espinas dendríticas en el hipocampo del ratón.
- Establecer una metodología detallada de obtención de imágenes mediante SBEM.
- Mejorar la comprensión de la organización y función sináptica en redes neuronales.
Métodos Utilizados
- Utilizó la microscopía electrónica de barrido de corte en bloque en serie como plataforma principal para la obtención de imágenes.
- Estudió muestras del hipocampo de ratón procesadas tanto para microscopía óptica como electrónica.
- Los protocolos detallados de preparación de muestras incluyeron contraste con metales pesados y manejo de electrostática.
- Se preparó e imprimió la región CA1 del hipocampo, obteniéndose resultados de alta resolución.
Resultados principales
- Se obtuvieron imágenes de alta resolución de espinas dendríticas, que demostraron su organización espacial.
- Los resultados de la imagen proporcionaron información sobre la presencia de entradas postsinápticas.
- Los pasos de procesamiento garantizaron la preservación y calidad de imagen de estructuras neuronales delicadas.
- La validación de los protocolos permitió una visualización confiable, necesaria para comprender las funciones sinápticas.
Conclusiones
- Este estudio demuestra la eficacia de la SBEM para elucidar las complejidades estructurales de las espinas dendríticas.
- Permite una mejor comprensión de cómo las conexiones neuronales facilitan el aprendizaje y la memoria.
- El método tiene potencial para explorar más a fondo los mecanismos sinápticos y la plasticidad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía electrónica de barrido con corte en bloque en serie (SBEM) permite la obtención de imágenes tridimensionales de alta resolución de las espinas dendríticas, proporcionando información estructural esencial sobre la arquitectura sináptica, relevante para la validación de dianas neuropsiquiátricas. Al combinar SBEM con inmunofluorescencia en el mismo tejido, el método apoya la desviación mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento, al correlacionar marcadores moleculares con características ultraestructurales. Este enfoque de doble modalidad mejora la confianza predictiva en los estudios de interacción con la diana, a la vez que reduce el uso de animales mediante una utilización eficiente de las muestras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la morfología de las espinas dendríticas y la presencia de densidades postsinápticas para validar los blancos sinápticos implicados en la plasticidad.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico al confirmar los correlatos estructurales del acoplamiento al blanco en modelos neuronales.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al vincular cambios ultraestructurales con resultados funcionales en las vías de aprendizaje y memoria.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera datos morfológicos cuantitativos en 3D (volumen de las espinas, tamaño del PSD) para la estandarización de ensayos en la selección de objetivos sinápticos.
- Valor operativo: Proporciona resultados reproducibles con resolución a escala nanométrica, adecuados para plataformas de análisis de alto contenido.
- Escalabilidad: Permite la obtención de imágenes en tejidos de gran volumen, facilitando la preparación para cribado en múltiples condiciones experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona fenotipificación estructural de circuitos hipocampales relevante para enfermedades, alineándose con estrategias traslacionales de biomarcadores.
- Valor operativo: Asegura continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante microscopía correlativa de luz y electrones.
- Reducción de riesgos: Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la confirmación de cambios estructurales mediados por el blanco en modelos preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La MEBE se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, particularmente para dianas del SNC que modulan la plasticidad sináptica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la visualización de orgánulos sinápticos y densidades postsinápticas.
- Tamizaje: Proporciona lecturas morfológicas cuantitativas listas para ensayos, con alta reproducibilidad para la evaluación del efecto de compuestos.
- Análisis: Permite la segmentación y reconstrucción de espinas dendríticas y sinapsis, ofreciendo resultados estadísticos para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta con la continuidad preclínica mediante la validación correlacionada mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de PSD-95 y otros marcadores sinápticos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagenología reutilizable para la neurofarmacología estructural en múltiples clases diana y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos sinápticos mediante la observación ultraestructural directa.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de preparación de muestras y de adquisición de imágenes, mejorando la reproducibilidad entre diferentes centros y estudios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia estructural del acoplamiento al objetivo, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas del sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de compuestos basada en riesgos, según efectos confirmados sobre la densidad y la morfología de las espinas dendríticas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de muestras para microscopía electrónica, contraste con metales pesados y técnicas de inclusión en resina.
- Depende del acceso a instrumentación de microscopía electrónica de barrido con seccionado en bloque (SBEM), montaje con epoxi conductor y mitigación de la acumulación de carga mediante recubrimiento de oro/paladio.
- Necesita una estandarización entre equipos de histología, adquisición de imágenes y análisis de imágenes para flujos de trabajo correlativos de microscopía óptica y electrónica.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el protocolo a regiones cerebrales no hipocampales o modelos de enfermedad con integridad tisular alterada.
- Comprende limitaciones prácticas, como tiempos prolongados de procesamiento (curado de resina de 48 horas o más) y vulnerabilidad a la pérdida electrostática durante el manejo de las muestras.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:56
Sample Contrasting
5:29
Dehydration and Resin Embedding
8:02
Trimming and Mounting
9:12
Serial Block‐Face Scanning Electron Microscopy Imaging
9:47
Representative Results: Dendritic Spine Analysis Using Serial Block‐Face Scanning Electron Microscopy
10:35
Conclusion
