Name: PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprende transformación germinal en Spodoptera frugiperda mediante el sistema piggyBac con transposasa hiperactiva. Este método mejora la eficiencia en lepidópteros plaga y avanza la genómica funcional para el control biológico.

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La investigación reportada es apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias I / UCRC, el Centro de Tecnologías de Manejo de Artrópodos, bajo la Subvención No IIP-1821936 y por socios de la industria, la Subvención Competitiva de la Iniciativa de Investigación Agrícola y Alimentaria No. 2019-67013-29351 y el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura, departamento de agricultura de los Estados Unidos (2019-67013-29351 y 2353057000).

1. Síntesis in vitro de arNm hyPBase
NOTA: La secuencia codificante completa de la secuencia hyPBase se sintetizó e insertó en un vector pTD1-Cas9 (consulte la Tabla de materiales)para producir la construcción pTD1-hyPBase, que contiene un casete que expresa hyPBase, promotor T7: poliedrín-5' UTR: hyPBase: poliedrín-3' UTR: poli (A). La secuencia completa de la construcción pTD1-hyPBase se proporciona en el Material suplementario.
<ol><li>Preparación de la plantilla para síntesis in vitro<ol>
<li>Realice una reacción de PCR para amplificar el cassette que expresa hyPBase utilizando una imprimación hacia adelante, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', y una imprimación inversa 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerasa de alta fidelidad y plásmido pTD1-hyPBase como plantilla. NOTA: La reacción de PCR (volumen final de 50 μL) contiene 5,0 μL de tampón de reacción 10x, 4,0 μL de trifosfato de desoxinucleósido de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plásmido (50 μg/μL), 1,0 μL de polimerasa de alta fidelidad, 1,0 μL cada uno de 10 μM de cebadores hacia adelante y hacia atrás, y 33 μL de agua libre de nucleasa. Los ajustes fueron los siguientes: una incubación inicial de 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 60 °C durante 15 s y 68 °C durante 2 min.</li>
		<li>Revise el producto de PCR en un gel de agarosa al 1% a 120 V en tampón fresco de ácido tetraacético tris-acetato-etilendiamina (TAE) durante 30 minutos y purifique el producto con el kit de extracción de gel. NOTA: No utilice el kit de purificación del producto PCR. Incluso una pequeña cantidad del plásmido pTD1-hyPBase disminuye significativamente la eficiencia de la síntesis in vitro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Síntesis in vitro de arNm hyPBase utilizando un kit comercial<ol>
<li>Descongele completamente los reactivos congelados, mantenga la enzima y 2 veces la solución NTP / CAP en hielo y deje el tampón de reacción 10x descongelado a temperatura ambiente.</li>
		<li>Montar la reacción a temperatura ambiente añadiendo los siguientes componentes: 2x solución NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampón de reacción: 2 μL; ADN de plantilla: 0.1-0.2 μg; Mezcla de enzimas: 2 μL; Agua libre de nucleasas a 20 μL.</li>
		<li>Mezcle bien los reactivos canalizando suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo e incube a 37 °C durante 2-4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperación de ARNm sintetizado por precipitación de cloruro de litio<ol>
<li>Agregue 30 μL de solución de precipitación de LiCl, mezcle bien moviendo el tubo y luego manténgalo a -20 ° C durante ≥ 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a 4 °C durante 15 min a la velocidad máxima, y retirar con cuidado el sobrenadante.</li>
		<li>Lave el pellet una vez con 1 ml de etanol al 70%, vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante con cuidado.</li>
		<li>Seque el pellet a temperatura ambiente durante 1-2 min, y luego vuelva a suspender el pellet con 20-40 μL de agua libre de nucleasas.</li>
		<li>Diluir 1 μL de solución de ARNm con 9 μL de agua libre de nucleasas. Tome 2 μL para determinar la concentración de ARNm y use 8 μL para verificar la calidad del ARNm en un gel de agarosa al 1% a 100 V en tampón TAE fresco durante 40 min.</li>
		<li>Alícuota la solución de ARNm y guárdala congelada a -70 °C durante un máximo de un año. NOTA: No seque completamente el gránulo de ARNm; puede ser más difícil disolverlo en agua.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Microinyección
<ol><li>Colección de huevos<ol>
<li>Coloque 12 pupas macho y 12 pupas hembra en una caja de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Cubra la caja con una toalla de papel. Coloque una solución de sacarosa al 10% en la caja para alimentar a los adultos.</li>
		<li>El día 2 después de la eclosión, exponga a los adultos a una luz intensa durante la noche.</li>
		<li>En el día 3 después de la eclosión, transfiera a los adultos del paso 2.1.2 a un lugar oscuro. Recoger los embriones dentro de las 2 h posteriores a la oviposición.</li>
		<li>Agregue gotas de agua al pedazo de una toalla de papel con huevos frescos guardados en una placa de Petri sobre hielo. Transfiera los huevos suavemente a un portaobjetos de vidrio con un cepillo fino y alinearlos uno por uno en un portaobjetos de vidrio. Mantenga los portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en hielo antes de la microinyección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuración de microinyección<ol>
<li>Inyecte una mezcla de un plásmido transgénico que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) (200 ng / μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, ARNm hyPBase (200 ng / μL) y agua destilada estéril en los huevos, utilizando la presión de compensación del microinyector automatizado (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Mantenga los huevos inyectados a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% de humedad relativa hasta la eclosión.</li>
		<li>Alimente a las larvas eclosionadas con una dieta artificial y transfiera cada larva a una taza pequeña a principios de la3ª etapa instar (~ 6 mm de longitud, y el color del cuerpo se vuelve negro).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cribado de fluorescencia y cruce genético
<ol><li>Recoge las pupas y coloca ~150 pupas hembra y ~150 pupas macho en una jaula de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Cuelgue varios trozos de toallas de papel (~ 30 cm x 15 cm) en la jaula para recoger los huevos.</li>
	<li>Recoja las toallas de papel con huevos diariamente y mantenga los huevos a 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% de humedad relativa hasta la eclosión.</li>
	<li>Mantenga las larvas neonatas a 4 °C durante 5 minutos para inmovilizarlas y luego transfiéralas a una placa helada.</li>
	<li>Examinar las larvas neonoliadas inmovilizadas bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Seleccione los neonatos EGFP positivos, elévelos a la etapa pupal en ~ 2 semanas a 27 ± 1 ° C, y sepárelos por sexo de acuerdo con las diferencias de fenotipo en los segmentos ventrales del abdomen. NOTA: La pupa hembra tiene una abertura genital en forma de hendidura en el octavo segmento abdominal y los márgenes cefálicos del noveno y décimo segmento que se curvan hacia la abertura genital. La abertura genital de la pupa masculina tiene una ligera elevación en el noveno segmento abdominal.</li>
	<li>Coloque las pupas EGFP positivas y las pupas de tipo salvaje del sexo opuesto en una proporción macho:hembra de 1:1 en una jaula. Sib-cruza los adultos que expresan EGFP para producir las siguientes generaciones.</li>
</ol>4. Detección por PCR de inserción transgénica
<ol><li>Extraiga ADN genómico de las larvas individuales de tipo silvestre y EGFP positivo utilizando cualquier kit de extracción de ADN genómico comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Realizar una reacción de PCR utilizando el ADN genómico como plantilla; una cartilla delantera, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' situada en la región promotora ie1; y un cebador inverso, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situado en la región EGFP del vector de transformación.</li>
	<li>Configure cada reacción de PCR (volumen final de 40 μL) para que contenga 20 μL de la mezcla de polimerasa, 1,0 μL de ADN genómico (40 μg/μL), 1,0 μL cada uno de los cebadores de 10 μM hacia adelante y hacia atrás, y 17 μL de agua libre de nucleasas. Utilice los siguientes ajustes: una incubación inicial de 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 20 s, 56 °C durante 20 s y 68 °C durante 40 s.</li>
	<li>Revise los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 30 min.</li>
</ol>5. Determinación del sitio de inserción transgénica
<ol><li>Realizar TAIL-PCR de alta eficiencia utilizando ADN genómico como plantilla para determinar el sitio de integración de la inserción de transgenes en los insectos EGFP-positivos.<ol>
<li>Realizar las reacciones de PCR siguiendo los pasos descritos en otra parte9.<ol>
<li>Utilice tres cebadores, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', y P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', que son específicos del vector piggyBac, en las 3 rondas de reacción de PCR, respectivamente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Secuenciar los productos finales de PCR para determinar el sitio de integración.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
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<li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li>
<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
<li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La baja tasa de transposición y la dificultad de administrar componentes transgénicos en embriones frescos limitan el éxito de la transformación de la línea germinal en muchos insectos no modelo, especialmente aquellos de orden, Lepidoptera. Para aumentar la tasa de transformación de la línea germinal, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac más utilizada (hyPBase)7,10. Hasta la fecha, la transformación exitosa de la línea germin...

El gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,es originario de las regiones tropicales y subtropicales de América. Actualmente, este es un insecto herbívoro devastador en más de 100 países en todo el mundo1. Las larvas de FAW se alimentan de más de 350 plantas huésped, incluidos algunos cultivos alimentarios básicos importantes2. La fuerte capacidad de migración de los adultos FAW contribuye a su reciente y rápida propagación desde las Américas a otros lugares1,2. Como resultado, este insecto ahora está amenazando la seguridad alimentaria a nivel internacional. La aplicación de nuevas tecnologías puede facilitar estudios avanzados en FAW y proporcionar estrategias novedosas para controlar esta plaga.
La transformación de la línea germinal de insectos se ha utilizado para estudiar la función de los genes y generar insectos transgénicos para su uso en el control genético3,4. Entre los diversos métodos utilizados para lograr la transformación genética en insectos, el método basado en elementos piggyBac es el método más utilizado5. Sin embargo, debido a la baja tasa de transposición, sigue siendo difícil llevar a cabo la transgénesis en insectos no modelo. Recientemente, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac (hyPBase)6,7. La transformación de la línea germinal se logró en FAW recientemente8,que es el primer informe que utilizó la hyPBase en insectos lepidópteros. En este informe, se describe información detallada sobre el empleo de ARNm de hyPBase en la generación de FAW transgénicos. El método descrito aquí podría aplicarse para lograr la transformación de otros insectos lepidópteros.

<table><tbody><tr><td>Rollos de algodón dental de 1.5"</td><td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>CRIANZA</td></tr><tr><td>1 oz Tapas de taza de soufflé</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>Tazas de soufflé de 1 oz</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>CRIANZA</td></tr><tr><td>48 oz Contenedores de plástico para delicatessen</td><td>Genpack</td><td>AD48</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Juego de filtros adicionales (verde)</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>CRIBADO</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>INYECCIÓN</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Visor de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Pinza de peso pluma</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>DE RECRÍA</td></tr><tr><td>Protector de canalón</td><td>Productos ThermWell VX620</td><td></td><td>DE CRIANZA</td></tr><tr><td>Invertida Microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>NightSea Full System NightSea</td><td>LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td>gaseoso AWG/ Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td>Bounty</td><td>&nbsp; 43217-45074</td><td>CRERÍA</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Dieta Artificial</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [Solicitar Especie/Cantidad]CRERÍA</td><td></td></tr><tr><td>Spodoptera frugiperda Huevos</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [Solicitar Especie/Cantidad]</td><td>CRÍA Mezcla de</td></tr><tr><td>polimerasa</td> <td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

piggyactivobac transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

La inserción estable de carga genética en los genomas de insectos utilizando elementos transponibles es una herramienta poderosa para estudios genómicos funcionales y el desarrollo de estrategias genéticas de manejo de plagas. El elemento transponible más utilizado en la transformación de insectos es piggyBac,y la transformación de la línea germinal basada en piggyBacse ha llevado a cabo con éxito en insectos modelo. Sin embargo, todavía es un desafío emplear esta tecnología en insectos no modelo que incluyen plagas agrícolas. Este artículo informa sobre la transformación de la línea germinal de una plaga agrícola global, el gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,utilizando la transponasa hiperactiva piggyBac (hyPBase).
En este trabajo, el ARNm hyPBase fue producido y utilizado en lugar del plásmido ayudante en microinyecciones embrionarias. Este cambio condujo a la generación exitosa de FAW transgénicos. Además, también se describen los métodos de cribado de animales transgénicos, la detección rápida basada en PCR de la inserción de transgenes y la determinación del sitio de integración basada en PCR entrelazada asimétrica térmica (TAIL-PCR). Por lo tanto, este trabajo presenta un protocolo para producir FAW transgénico, que facilitará la transgénesis basada en piggyBacen FAW y otros insectos lepidópteros.

Un constructo para la expresión del promotor T7 que contiene hyPBase: poliedrín-5'UTR: hyPBase: poliedrín-3'UTR: se generó una señal poli (A)(Figura 1A)y se amplificó como un fragmento de PCR de ~2,2 kb para sintetizar el ARNm de hyPBase in vitro (Figura 1B). Luego, se produjo el ARNm hyPBase y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El ARNm del tamaño esperado (~1.1 kb banda) se detectó en un gel de agarosa al 1%(Figura 1C)....

La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Este protocolo muestra la producción de gusano cogollero transgénico utilizando un sistema de transformación basado en piggyBac. Esperamos que estos métodos se beneficien de mejorar la transformación, no solo en el gusano cogollero, sino también en los insectos lepidópteros. El método descrito aquí hace que la transformación de la línea germinal de los insectos plaga de lepidópteros sea eficiente.Demostrando el procedimiento estará el Dr. Xien Chen, un becario postdoctoral en mi laboratorio. Comience colocando 12 pupas macho y 12 pupas hembra en una caja. Coloque una solución de sacarosa al 10% en la caja para alimentar a los adultos.Cubra la caja con una toalla de papel. En el segundo día después de la eclosión, exponga a los adultos a una luz intensa durante la noche. En el tercer día después de la eclosión, transfiera a los adultos a un lugar oscuro.Recoger los embriones dentro de las dos horas posteriores a la sobreposición. Agregue gotas de agua al trozo de la toalla de papel con huevos frescos guardados en una placa de Petri sobre hielo. Transfiera los huevos suavemente a un portaobjetos de vidrio con un cepillo fino y alinearlos uno por uno en un portaobjetos de vidrio.Mantenga los portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en hielo antes de la microinyección. Inyecte una mezcla de 200 nanogramos por microlitro de plásmido de expresión de EGFP basado en piggyBac, 200 nanogramos por microlitro de ARNm de transposasa de piggyBac hiperactivo y agua destilada estéril en los huevos utilizando la presión de compensación del microinyector automatizado. Mantenga los huevos inyectados a 27 más o menos un grado Celsius, 60 más o menos 10% de humedad relativa hasta la eclosión.Alimente a las larvas eclosionadas con una dieta artificial y transfiera cada larva a una taza pequeña en la etapa temprana de cuajada y estrella. Recoge las pupas y coloca aproximadamente 150 pupas hembras y 150 machos en una jaula. Cuelgue varios trozos de toallas de papel de 30 centímetros por 15 centímetros de tamaño en la jaula para recoger los huevos.Recoja las toallas de papel con huevos diariamente y mantenga los huevos en condiciones apropiadas hasta que eclosionen. Mantenga las larvas neonatas a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para inmovilizarlas y luego transfiéralas a una placa helada. Examinar las larvas neonolientas inmovilizadas bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.Seleccione los neonatos EGFP positivos, elévelos a la etapa pupal, en aproximadamente dos semanas a 27 más o menos un grado Celsius. El ARNm hiperactivo de la transposasa piggyBac sintetizado in vitro se detectó utilizando un gel de agarosa al 1%. Los embriones inyectados con PDS no mostraron señal de EGFP, mientras que el plásmido que expresa EGFP y los embriones inyectados con ARNm de la transposasa piggyBac hiperactiva mostraron fluorescencia de EGP, lo que indica que la construcción de piggyBac fue exitosa.Las larvas G1 obtenidas de huevos resultantes de un autocruce de adultos G0 mostraron una fuerte señal egfp. Un fragmento que contenía el promotor y el fragmento de EGFP se amplificó con éxito utilizando el ADN genómico aislado de las larvas positivas de EGFP como plantilla. Sin embargo, el mismo fragmento no se detectó cuando se aisló el ADN genómico de las larvas de tipo silvestre como plantilla.Los huevos para la microinyección deben ser lo más frescos posible y siempre deben mantenerse en hielo antes de la microinyección para ralentizar su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores respondan preguntas en genómica funcional de insectos plaga y desarrollen métodos de control genético para esta plaga global.

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La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

El kit de herramientas genómicas funcionales para los nematodos parásitos Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti incluye transgénesis, mutagénesis mediada por CRISPR / Cas9 y ARNi. Este protocolo demostrará cómo utilizar la microinyección intragonadal para introducir transgenes y componentes CRISPR en S. stercoralis y S. ratti.

Generación de transgénicos y knockouts en especies de Strongyloides por microinyección

Aprende transformación germinal en Spodoptera frugiperda mediante el sistema piggyBac con transposasa hiperactiva. Este método mejora la eficiencia en lepidópteros plaga y avanza la genómica funcional para el control biológico.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

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