PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda
23 de septiembre de 2021
La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.
Este protocolo muestra la producción de gusano cogollero transgénico utilizando un sistema de transformación basado en piggyBac. Esperamos que estos métodos se beneficien de mejorar la transformación, no solo en el gusano cogollero, sino también en los insectos lepidópteros. El método descrito aquí hace que la transformación de la línea germinal de los insectos plaga de lepidópteros sea eficiente.
Demostrando el procedimiento estará el Dr. Xien Chen, un becario postdoctoral en mi laboratorio. Comience colocando 12 pupas macho y 12 pupas hembra en una caja. Coloque una solución de sacarosa al 10% en la caja para alimentar a los adultos.
Cubra la caja con una toalla de papel. En el segundo día después de la eclosión, exponga a los adultos a una luz intensa durante la noche. En el tercer día después de la eclosión, transfiera a los adultos a un lugar oscuro.
Recoger los embriones dentro de las dos horas posteriores a la sobreposición. Agregue gotas de agua al trozo de la toalla de papel con huevos frescos guardados en una placa de Petri sobre hielo. Transfiera los huevos suavemente a un portaobjetos de vidrio con un cepillo fino y alinearlos uno por uno en un portaobjetos de vidrio.
Mantenga los portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en hielo antes de la microinyección. Inyecte una mezcla de 200 nanogramos por microlitro de plásmido de expresión de EGFP basado en piggyBac, 200 nanogramos por microlitro de ARNm de transposasa de piggyBac hiperactivo y agua destilada estéril en los huevos utilizando la presión de compensación del microinyector automatizado. Mantenga los huevos inyectados a 27 más o menos un grado Celsius, 60 más o menos 10% de humedad relativa hasta la eclosión.
Alimente a las larvas eclosionadas con una dieta artificial y transfiera cada larva a una taza pequeña en la etapa temprana de cuajada y estrella. Recoge las pupas y coloca aproximadamente 150 pupas hembras y 150 machos en una jaula. Cuelgue varios trozos de toallas de papel de 30 centímetros por 15 centímetros de tamaño en la jaula para recoger los huevos.
Recoja las toallas de papel con huevos diariamente y mantenga los huevos en condiciones apropiadas hasta que eclosionen. Mantenga las larvas neonatas a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para inmovilizarlas y luego transfiéralas a una placa helada. Examinar las larvas neonolientas inmovilizadas bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
Seleccione los neonatos EGFP positivos, elévelos a la etapa pupal, en aproximadamente dos semanas a 27 más o menos un grado Celsius. El ARNm hiperactivo de la transposasa piggyBac sintetizado in vitro se detectó utilizando un gel de agarosa al 1%. Los embriones inyectados con PDS no mostraron señal de EGFP, mientras que el plásmido que expresa EGFP y los embriones inyectados con ARNm de la transposasa piggyBac hiperactiva mostraron fluorescencia de EGP, lo que indica que la construcción de piggyBac fue exitosa.
Las larvas G1 obtenidas de huevos resultantes de un autocruce de adultos G0 mostraron una fuerte señal egfp. Un fragmento que contenía el promotor y el fragmento de EGFP se amplificó con éxito utilizando el ADN genómico aislado de las larvas positivas de EGFP como plantilla. Sin embargo, el mismo fragmento no se detectó cuando se aisló el ADN genómico de las larvas de tipo silvestre como plantilla.
Los huevos para la microinyección deben ser lo más frescos posible y siempre deben mantenerse en hielo antes de la microinyección para ralentizar su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores respondan preguntas en genómica funcional de insectos plaga y desarrollen métodos de control genético para esta plaga global.
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Descripción general
Este estudio demuestra un protocolo para la transformación germinal exitosa en la oruga militar del maíz, Spodoptera frugiperda, utilizando un sistema de transformación basado en piggyBac. El método promete una mayor eficiencia de transformación en plagas lepidópteras y mejora la investigación en genómica funcional en estos organismos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Ingeniería genética en insectos plaga
- Técnicas de biología transformacional
- Aplicaciones de genómica funcional
Antecedentes
- La oruga militar es una plaga agrícola importante.
- El sistema de transposón piggyBac es conocido por su eficiencia en la entrega de genes.
- Mejorar la transformación de la línea germinal es crucial para las estrategias de control de plagas.
Métodos Utilizados
- Microinyección de huevos con plásmido piggyBac y ARNm
- Spodoptera frugiperda como modelo biológico
- Microscopía de fluorescencia para la selección de larvas transgénicas
Resultados principales
- La expresión exitosa de EGFP en larvas transgénicas mostró la funcionalidad del sistema piggyBac.
- La expresión de EGFP se verificó mediante amplificación de ADN genómico, distinguiendo larvas transgénicas de larvas de tipo silvestre.
- La técnica de transformación resultó eficiente para producir insectos plaga modificados genéticamente.
Conclusiones
- El estudio establece un método robusto para la transformación germinal en Spodoptera frugiperda.
- Los hallazgos contribuyen al avance de medidas de control genético para plagas agrícolas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de una transformación germinal eficiente en plagas agrícolas como la oruga militar del maíz permite la genómica funcional para la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en las líneas de control de plagas. Este protocolo apoya el descubrimiento temprano al proporcionar un sistema escalable para investigar la función génica y evaluar los resultados fenotípicos en un modelo de insecto relevante para la enfermedad. La transgénesis exitosa facilita el cribado posterior y el descubrimiento de biomarcadores para estrategias de manejo genético de plagas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de genes de plagas para validar objetivos en estrategias de control genético.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para generar líneas transgénicas destinadas a la evaluación consistente de objetivos.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al vincular la interrupción génica con efectos fenotípicos en un modelo de plaga.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera líneas con reporteros fluorescentes para cribado de alto rendimiento de perturbaciones genéticas.
- Valor operativo: Permite genotipificación estandarizada basada en PCR y TAIL-PCR para la validación del sitio de inserción.
- Preparación para ensayos: Produce cepas transgénicas estables adecuadas para cribado de compuestos y ensayos fenotípicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Vincula la validación genética en fase de descubrimiento con la evaluación preclínica de mecanismos de control genético.
- Avance Ajustado al Riesgo: Facilita la evaluación de la esencialidad génica y el impacto fenotípico antes de la aplicación en campo.
- Alineación de Biomarcadores: Apoya la identificación de marcadores genéticos asociados a rasgos de susceptibilidad o resistencia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la validación del blanco mediante transgénesis, apoyar la identificación de compuestos prometedores mediante cribado fenotípico e informar las decisiones preclínicas a través de modelos genéticos estables.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la eliminación génica o sobreexpresión en oruga militar para evaluar la relevancia del blanco.
- Selección: Genera líneas transgénicas estandarizadas para la selección reproducible de moduladores genéticos o químicos.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas mediante PCR y fluorescencia para medir la integración del transgén y los niveles de expresión.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento de la función génica con la evaluación preclínica de enfoques de control genético de plagas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de transgénesis reutilizable, aplicable a través de especies de plagas lepidópteras para la validación de blancos en toda la cartera.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del blanco mediante manipulación genética directa en un modelo de plaga.
- Valor operativo: Proporciona un sistema de transgénesis escalable y reproducible, con protocolos estandarizados de microinyección y cribado.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del proyecto al reducir la incertidumbre biológica sobre la esencialidad del blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en la validación fenotípica in vivo en un modelo de plaga.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en embriología de insectos y técnicas de microinyección.
- Necesita microinyector automatizado, microscopio estereoscópico de fluorescencia y equipos de PCR para la validación.
- Exige protocolos estandarizados para la recolección de embriones, condiciones de inyección y cribado de transgénicos entre diferentes equipos.
- Requiere adaptación de los protocolos de temperatura, humedad y dieta para distintas especies de lepidópteros.
- Depende de la calidad y frescura de los embriones, con la eficiencia de microinyección influenciada por el momento del desarrollo embrionario.
